沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶3調(diào)控機制及其在奶牛乳腺炎中的作用

冀思同 沙 萍 曹佩佩 馬燕芬

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏回族自治區(qū)反芻動物分子細(xì)胞育種重點實驗室，銀川 750021)

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)依賴性組蛋白去乙?；窼irtuin在新陳代謝、氧化應(yīng)激、炎癥及線粒體功能等方面發(fā)揮重要作用[1]。Sirtuin利用NAD+依賴性去乙酰化酶消除很多組蛋白與非組蛋白中的乙?；哉{(diào)控下游轉(zhuǎn)錄因子。Sirtuins共含7種亞型，分別是位于細(xì)胞質(zhì)的沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶(silent information regulator 2 related enzyme，SIRT)2，位于細(xì)胞核的SIRT1、SIRT6、SIRT7，以及位于線粒體的SIRT3、SIRT4、SIRT5[2]。過去針對Sirtuin家族的研究主要集中于SIRT1，目前其他成員的研究同樣成為焦點，特別是在機體內(nèi)部多個器官均有分布的SIRT3，在細(xì)胞代謝、生物合成、細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激等方面均可以發(fā)揮調(diào)控作用[3]。近年來，有研究證實SIRT3介導(dǎo)奶牛乳腺炎的發(fā)病過程，炎癥的發(fā)病過程與SIRT3的豐度相關(guān)，而SIRT3的豐度受到底物與表達(dá)水平的雙重調(diào)控。因此，了解SIRT3的調(diào)控機制及在奶牛乳腺炎中發(fā)揮的作用對于靶向防治炎性疾病有重要意義。

1 Sirtuin結(jié)構(gòu)和催化機制

沉默信息調(diào)節(jié)因子2(silent information regulator 2，SIR2)是在20世紀(jì)70年代于釀酒酵母細(xì)胞沉默轉(zhuǎn)錄時被發(fā)現(xiàn)的蛋白家族，其性質(zhì)高度保守，產(chǎn)物對基因組穩(wěn)定性存在影響[4]，后將真核生物中與SIR2同源的蛋白稱為Sirtuin。Sirtuin屬于Ⅳ類組蛋白去乙?；?histone deacetvlase，HDAC)中的第Ⅲ類。Sirtuin蛋白家族在不同的生物學(xué)過程如細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)代謝、線粒體合成、細(xì)胞應(yīng)激、胰島素分泌和衰老等都發(fā)揮著重要的作用[5]。對真核生物和原核生物的催化核心區(qū)域進行系統(tǒng)分類可將Sirtuin分為5個主要類型(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和U)[6]。SIRT3屬于第Ⅰ類，通常被認(rèn)為分布于線粒體中，但最近的研究發(fā)現(xiàn)SIRT3在線粒體外也有分布，在受到應(yīng)激刺激的細(xì)胞內(nèi)全長型SIRT3可被酶裁剪為成熟SIRT3，因成熟SIRT3缺乏線粒體定位信號，會非特異性地分布于細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)以及線粒體中[3]。

哺乳動物Sirtuin的催化核心區(qū)域包含一大一小2個基本結(jié)構(gòu)域，較大的結(jié)構(gòu)域具有較強的保守性，由Rossmann折疊構(gòu)成，較小的結(jié)構(gòu)域包含1個鋅指結(jié)構(gòu)和螺旋構(gòu)件[7]。大小結(jié)構(gòu)域之間的催化口袋包括A、B、C 3個活性位點，其中A點參與NAD+腺嘌呤-核糖部分的結(jié)合，B點參與煙酰胺-核糖部分的結(jié)合，C點是NAD+結(jié)合口袋深處。底物乙酰基被Sirtuin去乙酰化后轉(zhuǎn)移到NAD+的二磷酸腺苷(ADP)-核糖基部分，同時1分子NAD+連接的ADP-核糖部分與煙酰胺之間的糖苷鍵被切斷，分裂為1分子O-乙?；?ADP-核糖(O-acetyl-ADP-ribose)和1分子煙酰胺(nicotinamide，NAM)[8]。Sirtuin偶聯(lián)了去乙酰基和NAD+斷裂2種催化活性，并產(chǎn)生了重要產(chǎn)物——O-乙酰基-ADP-核糖。上文提到并非所有Sirtuin蛋白都具有去乙酰化酶活性，SIRT1、SIRT2、SIRT3和SIRT7具有去乙酰化酶活性，但SIRT7的活性較弱或檢測不到，而SIRT4則主要表現(xiàn)ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性[9]。

2 SIRT3參與的主要調(diào)控機制

2.1 SIRT3與核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)

NF-κB是包含p65(RelA)、RelB、c-Rel、NF-κB1(p105/p50)以及NF-κB2(p100/p52)7位成員的蛋白家族[10]。NF-κB信號通路是調(diào)節(jié)炎癥的關(guān)鍵信號通路，NF-κB主要通過參與炎性反應(yīng)建立的基因轉(zhuǎn)錄而調(diào)節(jié)炎性疾病[11]。NF-κB與SIRT3存在拮抗關(guān)系，上調(diào)SIRT3的表達(dá)可以抑制NF-κB信號通路，還可以同時抑制高濃度非酯化脂肪酸(non-esterified fatty acids，NEFA)誘導(dǎo)的核易位和促炎反應(yīng)的信號通路。奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells，BMEC)的NF-κBp65磷酸化水平會被NEFA誘導(dǎo)而上升，激活NF-κB信號通路，增加炎性因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin 6，IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)的mRNA水平，說明高濃度的NEFA會激活BMEC內(nèi)的炎性通路。在大多數(shù)情況下，靜止中的NF-κB最主要的異源二聚體NF-κBp50/p65與核因子κB抑制因子α(IκBα)結(jié)合于細(xì)胞質(zhì)中；NF-κBp50/p65在機體受到刺激時與IκBα分離，易位后進入細(xì)胞核內(nèi)作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)炎性因子表達(dá)[12]。在此過程內(nèi)，NF-κBp65誘導(dǎo)的磷酸化對NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性有十分關(guān)鍵的作用，患病奶牛磷酸化p65(p-NF-κBp65)與NF-κBp65比值的升高是NF-κB信號通路被激活的證明[13]。高濃度的NEFA具有脂毒性，奶牛脂解產(chǎn)生的NEFA約有1/2被BMEC吸收，促進乳腺炎性反應(yīng)，NEFA在肝細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等多種細(xì)胞中也可激活炎性通路，BMEC中的IL-6、IL-1β和p-NF-κBp65的表達(dá)對NEFA的反應(yīng)表現(xiàn)出劑量依賴性[14]。NF-κBp65的乙?；梢哉{(diào)節(jié)炎性反應(yīng)，使RelA/p65亞基的賴氨酸-310脫乙?；种芌elA/p65亞基的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制NF-κB依賴性基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄[15]。BMEC中SIRT3的過表達(dá)顯著降低IL-6、IL-1β和p-NF-κBp65的豐度，證實SIRT3可以抑制NF-κB信號通路的激活[13]。

2.2 SIRT3與活性氧(reactive oxygen species，ROS)

機體新陳代謝的過程中會產(chǎn)生有未配對電子的分子和原子，稱為自由基，正常情況下自由基的產(chǎn)生和清除是動態(tài)平衡的。奶牛泌乳期的代謝非常旺盛，BMEC會產(chǎn)生大量的ROS。高濃度的NEFA會影響到ROS的生成，圍產(chǎn)期奶牛耗氧量大幅增加，耗氧量越大生成的自由基也就越多，最后導(dǎo)致機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激[16]。細(xì)胞膜脂質(zhì)層被ROS過氧化產(chǎn)生的大量丙二醛(malondialdehyde，MDA)會引起和加重DNA氧化損傷和蛋白質(zhì)變性等，屬于不可逆損傷[17]，對細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p害。添加抗氧化劑后，NEFA的促氧化作用得到了抑制，說明NEFA是導(dǎo)致氧化應(yīng)激的主要原因[18]。SIRT3是ROS生成的主要調(diào)控因子，可直接去乙酰化并激活抗異檸檬酸脫氫酶2(isocitrate dehydrogenase 2，IDH2)以及氧化因子錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，MnSOD)，啟動抗氧化，防止細(xì)胞內(nèi)累積ROS[19]。轉(zhuǎn)錄因子叉形頭轉(zhuǎn)錄因子O亞型3a(forkhead box O3a，F(xiàn)OXO3a)會被SIRT3去乙?；T導(dǎo)表達(dá)，激活的FOXO3a可進一步促進MnSOD和IDH2的表達(dá)，消除已積累的ROS[3]。

2.3 SIRT3與單磷酸腺苷依賴的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)

作為機體內(nèi)重要的信號通路，AMPK同時也是主要由單磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)激活和調(diào)控的一種調(diào)節(jié)細(xì)胞物質(zhì)和能量平衡穩(wěn)定的重要蛋白，通過使其下游的多種蛋白包括SIRT3和叉頭盒(forkhead box，F(xiàn)ox)磷酸化達(dá)到調(diào)控分解與合成代謝的效果[20]。叉頭框蛋白O1(forkhead box protein O1，F(xiàn)oxO1)的轉(zhuǎn)錄活性會隨著SIRT3去乙酰化而增強，達(dá)到緩解線粒體氧化損傷的目的。SIRT3與AMPK關(guān)系密切，AMPK通過增加NAD+激活SIRT3抑制NF-κB途徑中的p65，阻止促炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄[21]，同時也可促進MnSOD表達(dá)減輕機體氧化應(yīng)激[22]，而SIRT3也會去乙酰化從而激活A(yù)MPK，在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用。

3 SIRT3在奶牛乳腺炎中的作用

乳腺炎在奶牛養(yǎng)殖中危害性很強，其在治療上較高的花費制約著奶牛業(yè)的健康發(fā)展[23]。美國國家乳房炎委員會(National Mastitis Council，NMC)將乳房炎分為慢性乳房炎、臨床型乳房炎和亞臨床型乳房炎3種，區(qū)分依據(jù)是乳房和乳汁是否存在明顯變化[24]，乳腺炎發(fā)病率在12%～75%[25]。奶牛對乳腺炎的易感性在產(chǎn)犢后的0～21 d尤為嚴(yán)重[26]。目前普遍認(rèn)為，奶牛個體因素是影響奶牛乳腺炎的主要因素[27-28]。

圍產(chǎn)前期(產(chǎn)前3周)，胎兒壓迫瘤胃，與營養(yǎng)代謝、激素紊亂等共同降低奶牛的干物質(zhì)采食量，瘤胃內(nèi)發(fā)酵物不足使丙酸缺乏，從而導(dǎo)致葡萄糖缺乏并上調(diào)脂肪分解信號，激活激素敏感脂肪酶(hormone-sensitive triglyceride lipase，HSL)[29]。HSL磷酸化后轉(zhuǎn)移到脂滴促進脂肪動員，并將脂肪內(nèi)的甘油三酯(triglyceride，TG)水解為NEFA和甘油[30-31]。奶牛能否成功度過能量負(fù)平衡(negative energy balance，NEB)階段取決于NEFA的濃度是否超出肝臟代謝上限[32]。當(dāng)NEFA濃度超出肝臟分解代謝能力的上限時會進行不完全β-氧化，此時就會產(chǎn)生β-羥丁酸(beta hydroxy butyric acid，BHBA)，同時機體又會處于嚴(yán)重的NEB狀態(tài)，此時奶牛機體易患乳腺炎。

目前已知SIRT3在治療奶牛乳腺炎中發(fā)揮的作用主要包括：一是SIRT3對BMEC氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS的抑制和清除。BMEC氧化應(yīng)激會使細(xì)胞受損導(dǎo)致奶牛乳腺炎，ROS水平的上升屬于BMEC氧化應(yīng)激時的特征之一，可以激活NF-κB信號通路并誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子表達(dá)[13]。已有研究證實SIRT3是ROS生成的主要調(diào)控因子[33]，通過促進MnSOD的mRNA的表達(dá)，將MnSOD去乙?；郧宄齊OS[34]。同時，SIRT3可以激活氨基酸代謝中的谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase，GDH)、三羧酸循環(huán)中的琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase，SDH)等的活性，增強線粒體呼吸作用，減少ROS的生成[35]。BMEC的氧化應(yīng)激程度因SIRT3抑制清除ROS而恢復(fù)正常水平，減少細(xì)胞受損，從而降低奶牛乳腺炎的發(fā)病率。二是SIRT3對NF-κB信號通路的抑制。患病奶牛體內(nèi)通常出現(xiàn)NEFA激活NF-κB信號通路，受到刺激后NF-κB的p65亞基迅速與IκBα解離，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核與靶基因相應(yīng)位點結(jié)合，增強細(xì)胞內(nèi)的炎性應(yīng)答，也增加促炎因子的釋放，最終導(dǎo)致機體產(chǎn)生炎性損傷。在BMEC中，SIRT3的過表達(dá)可以顯著降低p-NF-κBp65、IL-6和IL-1β的豐度，為SIRT3抑制NF-κB信號通路的作用提供支持[13]。NF-κB信號通路受到抑制后可減輕奶牛乳腺炎的發(fā)病。三是SIRT3對NEFA的抑制。NEB狀態(tài)是導(dǎo)致奶?；既橄傺椎闹饕蛑?，此狀態(tài)下脂解產(chǎn)生的NEFA約1/2會被BMEC吸收[36]。NEFA不僅會激活NF-κB信號通路，同時高濃度的NEFA具有脂毒性，造成BMEC炎性水平增加。研究表明，SIRT3通過去乙酰化調(diào)節(jié)長鏈?；o酶A脫氫酶(long chain acyl-coA dehydrogenase，LCAD)的活性，促進脂肪酸氧化，從而減少TG和脂肪酸氧化中間產(chǎn)物的累積[37]。TG是NEFA的主要來源，SIRT3的過表達(dá)可以減少體內(nèi)NEFA的累積，減弱NEFA的脂毒性及其對NF-κB信號通路的影響，減少奶牛乳腺炎的發(fā)病。

4 小 結(jié)

SIRT3通過去乙?；{(diào)控下游蛋白質(zhì)，并與NF-κB、AMPK等底物和NEFA、ROS等物質(zhì)相互作用，在細(xì)胞能量代謝、生物合成、細(xì)胞凋亡、熱量限制及氧化應(yīng)激等方面發(fā)揮作用。目前對SIRT3的研究還未達(dá)到其同家族SIRT1的深度，對SIRT3與乳腺炎之間的確切調(diào)控關(guān)系及機制還有著很大的空白，通過深層次研究SIRT3與乳腺炎發(fā)病可為SIRT3靶向治療乳腺炎提供新的方向。