HPLC法同時測定辣椒粉中5種紅色合成著色劑

曹永梅，吳薇

上海旺旺食品集團有限公司（上海 201103）

辣椒粉是一種常用的辛香調味料，為牟取利益、降低成本，辣椒粉的摻假摻雜時有報道[1-2]*，歐盟調查報告列出10大易摻假食品名單中辣椒粉就被列入其中[3]*。有的不法商家為使辣椒粉有一個好的賣相，非法添加非食用色素或超范圍使用人工合成著色劑[4-6]*，“涉紅”的辣椒粉屢禁不止。非法添加非食用紅色素主要指蘇丹紅、羅丹明B、酸性橙II等，針對這類色素的檢測方法研究較多[7-12]*。

GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》對食品中允許使用的合成著色劑種類、使用范圍和限量進行詳細規(guī)定，未在該標準使用范圍內使用此類合成著色劑就屬于超范圍使用。GB 5009.35—2016《食品安全國家標準 食品中合成著色劑的測定》中，方法的適用范圍不含辣椒粉。辣椒粉因基質復雜，使用國標方法中的前處理條件目標物回收率低，提取不完全[13]*，針對辣椒粉中人工合成著色劑的檢測方法相關文獻也較少。試驗采用高效液相色譜法（二極管陣列檢測器），測定辣椒粉中的新紅、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅、赤蘚紅B這5種紅色合成著色劑，對測定條件進行優(yōu)化，靈敏度高，準確性好，是一種簡便、快速、準確的測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與設備

安捷倫1260高效液相色譜、二極管陣列檢測器（安捷倫）；XS205分析天平（美國梅特列-托利多）；ELGA Classic UV超純水機（英國ELGA）；Sigma2-16P離心機（西格瑪）；漩渦混合儀XH-D（上海皓莊）；超聲波清洗儀SCQ（上海安譜）；旋轉蒸發(fā)儀Laborota 4000（海道夫）；氮吹儀DC12H（上海安譜）。

1.1.2 試劑與標準品

標準品：新紅（CAS 220658-76-4，上海安譜），莧菜紅（CAS 915-67-3，上海安譜），胭脂紅（CAS 1390-65-4，百靈威），誘惑紅（CAS 25956-17-6，上海安譜），赤蘚紅B（CAS 16423-68-0，百靈威）。

乙腈、甲醇、甲酸、乙酸銨（均為色譜純，Merck）；乙醇、氨水、正己烷（均為分析純，國藥集團）。

提取劑采用氨水-70%乙醇水溶液1∶99（V/V），混勻。

SPE小柱ProElut PLS 500 mg/6 mL（Dikma，cat.#68005）。

試驗用水均為經超純水機處理后的水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

樣品提取：稱取0.1 g（精確至0.000 1 g）辣椒粉于50 mL離心管中，加入30 mL正己烷，渦旋1 min，超聲15 min，以6 000 r/min離心5 min，棄去上清液；加入20 mL提取劑，渦旋5 min，超聲10 min，以6 000 r/min離心5 min，立即取上清液于100 mL旋轉蒸發(fā)瓶中。下層殘渣繼續(xù)用15 mL提取劑重復提取2次，合并3次上清液。

待凈化液：旋轉蒸發(fā)瓶中收集的液體，于50 ℃真空濃縮至約6 mL，加入80 μL甲酸酸化，混勻后得到待凈化液。

樣品凈化：分別用5 mL甲醇、5 mL水將SPE小柱進行活化、平衡，加入待凈化液，用少量乙醇淋洗旋轉蒸發(fā)瓶并全部轉移到小柱上，棄去流出液，加入5 mL水洗脫，棄去流出液，將SPE柱抽干，加入6 mL 2%氨水甲醇溶液，收集洗脫液，將洗脫液在45 ℃下氮氣吹至約0.5 mL，用水定容至2 mL，0.45 μm濾膜過濾后，待上機。

累計預扣預繳應納稅所得額=累計收入-累計免稅收入-累計減除費用-累計專項扣除-累計專項附加扣除-累計依法確定的其他扣除

1.2.2 標準使用液的配制

單標標準儲備溶液（1 000 μg/mL）：稱取適量（精確至0.1 mg）各標準品于50 mL棕色容量瓶中，分別用10%甲醇溶解后定容，混勻，置于-4 ℃下密封保存。

混合標準中間溶液（10 μg/mL）：依次吸取0.5 mL單標標準儲備液于50 mL棕色容量瓶中，用超純水稀釋后定容。

1.2.3 標準曲線制作

依次從1.2.2混合標準中間溶液（10 μg/mL）中吸取0.1，0.5，1.0，2.0和5.0 mL分別于10 mL容量瓶中，用超純水稀釋定容，制作成0.1，0.5，1.0，2.0和5.0 μg/mL的標準曲線工作溶液，過膜，待測。

辣椒粉HPLC色譜圖（5種目標物混標圖譜及辣椒粉樣品加標圖譜）詳見圖1。

圖1 辣椒粉HPLC色譜圖

色譜柱Agilent Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；進樣體積20 μL；流速1.0 mL/min；檢測波長509 nm。流動相配比及梯度洗脫時間見表1。

表1 流動相配比及梯度洗脫時間

2 結果與討論

2.1 試驗條件的選擇

2.1.1 檢測波長的選擇

在二極管陣列檢測器全波長范圍內進行光譜掃描，各物質在表2所示波長具有明顯吸收，因此探討在254，509和520 nm這3個波長的譜圖后發(fā)現(xiàn)，254 nm處除了目標物還有很多細小的雜峰，509 nm下的譜圖目標物響應最大，且無基質干擾，故試驗選擇509 nm作為檢測波長。

表2 各目標物的光譜掃描波長 單位：nm

2.1.2 提取溶劑的選擇

試驗中5種合成著色劑均為水溶性色素，能溶于水和乙醇，選用水、乙醇、氨水-70%乙醇水溶液作為提取試劑進行測試，氨水-70%乙醇水溶液溶解度最大，并且用氨水-乙醇溶液可大幅減少氮吹時間。綜合考量，選取氨水-70%乙醇水溶液為此次試驗提取溶劑。

2.1.3 前處理優(yōu)化

樣品經提取劑提取3次后直接真空濃縮，試驗中會產生大量泡沫，且在過SPE柱時導致柱堵塞。增加正己烷除脂步驟后，不僅降低油脂對小柱凈化的影響，同時能很好地消除雜質的干擾。

2.2 線性范圍

分別取混合標準使用液，用HPLC分別測其峰面積，5種目標化合物在0.1～5 μg/mL質量濃度范圍內，其濃度和峰面積呈線性關系，相關系數(shù)在0.999以上。保留時間、峰面積、線性方程及相關系數(shù)詳見表3。

表3 混標之峰面積及相關系數(shù)

2.3 回收率及精密度試驗

稱取樣品，在2個添加水平下加標，按1.2.1步驟處理，加標回收率及精密度見表4。在2個添加水平下目標物樣品平均加標回收率分別在81.23%～88.92%和87.82%～96.24%之間，SRSD＜7.76%，能滿足定量檢測的要求，詳見表4。

表4 樣品回收率及精密度（n=6）

2.4 檢出限和定量限

吸取加標樣品（添加0.5 μg）重復進樣10次，以3倍信噪比及10倍信噪比計算，得出檢出限及定量限，詳見表5。

表5 各目標物的檢出限和定量限 單位：mg/kg

3 結論

試驗使用高效液相色譜分離系統(tǒng)，梯度洗脫進行辣椒粉中5種紅色合成著色劑的測定，前處理采用正己烷脫脂后提取，過SPE小柱，可很好地消除雜質的干擾，有效提取目標物，峰形尖銳，分離效果良好。試驗方法可用于定性篩查辣椒粉中超范圍使用紅色合成色素，同時也可實現(xiàn)準確定量。試驗結果可為企業(yè)和監(jiān)管部門提供科學依據(jù)及技術支撐，從而更好保證辣椒粉的質量安全，維護廣大企業(yè)及消費者的利益。