氣相色譜-負(fù)化學(xué)源-質(zhì)譜法測定茶葉中的氟蟲腈及其代謝物

馬藝熒，郝 宇，張 鵬，劉萌萌，于 洋，孫欣瑤，于力濤,

（1.黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院，黑龍江 哈爾濱 150028；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)旅游烹飪學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150028；3.綏化學(xué)院招生就業(yè)處，黑龍江 綏化 152000）

氟蟲腈是一種具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的小分子化合物，作為一類廣譜殺蟲劑[1-2]使用，因具有殺蟲活性高、應(yīng)用范圍廣的特點(diǎn)，被廣泛用于蔬菜、水果等[3-4]農(nóng)產(chǎn)品領(lǐng)域，故其可通過食物鏈生物積累進(jìn)入生物體內(nèi)。研究表明，短期攝入大量氟蟲腈可能出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛等急性中毒癥狀，同時會對神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷；長期攝入可能損害肝、腎、甲狀腺等[5-6]器官組織，甚至產(chǎn)生生殖及發(fā)育毒性[7-9]。同時由于在自然環(huán)境中氟蟲腈可降解為氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜，且其3 種代謝產(chǎn)物毒性均高于氟蟲腈，并易儲存于富含脂質(zhì)的組織，對人體健康具有更大的威脅[10]。世界衛(wèi)生組織將氟蟲腈列為對人類有中等毒性化學(xué)品[11]。

中國是茶葉的發(fā)源地，是世界上第一產(chǎn)茶大國，生產(chǎn)的茶葉種類主要有紅茶、綠茶、白茶、黃茶、烏龍茶和黑茶六大類。茶作為一種健康飲品，茶葉的品質(zhì)尤為重要。茶樹適宜生長在地勢高、濕度大的地區(qū)，茶葉在生長過程中易出現(xiàn)病蟲害，使用氟蟲腈殺蟲劑成為控制其危害茶樹的主要手段，與此同時茶葉農(nóng)藥殘留問題也日益嚴(yán)重。2006—2014年，我國出口到日本的烏龍茶和綠茶因農(nóng)藥殘留超標(biāo)分別被通報(bào)87 次和12 次，其中氟蟲腈超標(biāo)被通報(bào)22 批次，占被通報(bào)總次數(shù)的22%[12]。2017年，我國出口烏龍茶被日本通報(bào)氟蟲腈超標(biāo)，檢出量為0.009 mg/kg，超出了日本對茶葉中氟蟲腈的限量0.002 mg/kg[13]。歐洲食品安全局規(guī)定雞蛋中的氟蟲腈最高限量為0.01 mg/kg；GB 2763—2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定水果、蔬菜、蛋類中的氟蟲腈最大限量為0.005～0.02 mg/kg，小麥、大麥、燕麥等谷物的氟蟲腈最大限量為0.002 mg/kg；歐盟委員會規(guī)定氟蟲腈在谷物、蔬菜、茶葉等食品中的限量為0.005 mg/kg。因此建立高效、快速、準(zhǔn)確的茶葉中氟蟲腈及其代謝物檢測方法，對茶葉中的氟蟲腈及其代謝物殘留的監(jiān)測具有重要意義。

目前，食品中氟蟲腈及其代謝物的檢測方法主要有氣相色譜法[14-16]、液相色譜法[4,17-18]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[19-20]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[21-24]等。其中氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是氟蟲腈的主要定量分析方法，具有檢測線性關(guān)系良好、分析定性及定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，是目前較理想的檢測方法[25-26]。尤其是氣相色譜-負(fù)化學(xué)源-質(zhì)譜法，具有離子碎裂少、響應(yīng)值高[27]、抗干擾能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)殘藥殘的檢測中有廣泛應(yīng)用[5]，而其在茶葉中檢測氟蟲腈及其代謝物的報(bào)道較少。因此，本實(shí)驗(yàn)對茶葉氟蟲腈及其代謝物中樣品處理?xiàng)l件：提取劑的選擇、提取劑的用量和凈化柱的選擇進(jìn)行研究，從而建立一種適合測定茶葉中氟蟲腈及其代謝物含量的氣相色譜-負(fù)化學(xué)源-質(zhì)譜法，并使用建立的方法測定市售茶葉中的氟蟲腈及其代謝物，該方法穩(wěn)定性和重復(fù)性良好、準(zhǔn)確度和靈敏度高，能為茶葉的質(zhì)量安全控制提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉30 份：綠茶10 份、紅茶10 份、烏龍茶5 份、黑茶5 份均為市售。

標(biāo)準(zhǔn)品：氟蟲腈（CAS號：120068-37-3，100 μg/mL）、氟甲腈（CAS號：205060-65-3，100 μg/mL）、氟蟲腈砜（CAS號：120068-36-2，100 μg/mL）、氟蟲腈亞砜（CAS號：120067-83-6，100 μg/mL） 北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；乙腈、丙酮、正己烷、甲醇（均為殘留級），氯化鈉（優(yōu)級純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；CNWBOND PSA SPE Cartridge（PSASPE柱）（規(guī)格為500 mg/6 mL）、CNWBOND Carbon-GCBSPE Cartridge（GCB-SPE 柱）（規(guī)格為500 mg/6 mL）、0.22 μm針式過濾器（有機(jī)相） 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；SUPELCLEAN ENVI-18（ENVI-18-SPE柱）（規(guī)格為500 mg/6 mL） 默克化工技術(shù)（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

8890-7000D三重四極桿氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配化學(xué)源及Mass hunter數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）、HP-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國安捷倫科技有限公司；FS-100粉碎機(jī) 華能科技有限公司；Dynamica VELOCITY 18R高速臺式離心機(jī) 上海馭锘實(shí)業(yè)有限公司；MMS-520·5020型振蕩器 東京理化有限公司；T 10 basic ULTRA-TURRAX?均質(zhì)器 德國IKA公司；LabTech H150-100LT旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 萊伯泰科儀器股份有限公司；TTL-DCII?氮吹儀 北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別移取氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜標(biāo)準(zhǔn)品1 mL，用丙酮分別定容到10 mL，配制質(zhì)量濃度為10 μg/mL的氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，-18 ℃貯存?zhèn)溆?。分別取上述溶液0.2 mL，用丙酮-正己烷（3∶7，V/V）定容到10 mL，充分混勻，配制成質(zhì)量濃度為0.2 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合使用液。

1.3.2 樣品處理

取茶葉樣品500 g，用磨碎機(jī)全部磨碎，并通過2.0 mm圓孔篩，混勻，放入密封瓶中備用。

稱取2.0 g茶葉樣品，加入10 mL水混勻，再加入20 mL乙腈，高速勻漿提取2 min，再加入1 g氯化鈉，400 r/min劇烈振蕩20 min，5000 r/min離心10 min，待凈化。

取10 mL上層提取液至50 mL具塞離心管中，加入10 mL正己烷，振搖3 min，靜置分層后棄去上層正己烷相，再加入10 mL正己烷重復(fù)操作1 次；將下層乙腈相轉(zhuǎn)移至濃縮瓶中，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入1.0 mL丙酮-正己烷（3∶7，V/V）溶解。

使用5 mL丙酮-正己烷（3∶7，V/V）活化PSA-SPE柱。將樣液傾入PSA-SPE柱中，用10 mL丙酮-正己烷（3∶7，V/V）進(jìn)行洗脫，控制流速不大于2 mL/min。收集全部洗脫液于濃縮瓶中，40 ℃氮吹至近干，用丙酮-正己烷（3∶7，V/V）溶解并定容至1.0 mL，使用0.22 μm濾膜針頭濾器過濾后裝入進(jìn)樣瓶，待測定，每個樣品平行測定3 次。

1.3.3 系列標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

分別取適量氟蟲腈及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)混合使用液，用丙酮-正己烷稀釋，配制成質(zhì)量濃度為0.002、0.010、0.050、0.100、0.200 μg/mL的氟蟲腈及其代謝物系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.4 色譜條件

HP-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為氦氣；進(jìn)樣口溫度250 ℃；升溫程序：初始溫度70 ℃，保持0 min，然后以30 ℃/min升溫至200 ℃保持10 min，再以50 ℃/min升溫至270 ℃保持4 min；接口溫度280 ℃；進(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣；流量1 mL/min。

1.3.5 質(zhì)譜條件

電離方式：負(fù)化學(xué)電離；離子源溫度150 ℃；四極桿溫度150 ℃；反應(yīng)氣：甲烷；測定方式：選擇離子監(jiān)測方式；溶劑延遲6 min。4 種目標(biāo)物的檢測參數(shù)見表1。

表1 氟蟲腈及其代謝物的檢測參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for fipronil and its metabolites

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀配備的定量分析軟件Mass hunter、Microsoft Excel和Origin 2021對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑的選擇

常見的提取劑有甲醇、丙酮、乙腈和正己烷等[21]。由于加入氯化鈉后甲醇與水相分層效果不明顯。故選擇丙酮、乙腈和正己烷為提取劑，以加標(biāo)量為0.010 mg/kg的空白茶葉樣品為研究對象，提取劑添加量為20 mL，經(jīng)過PSA-SPE柱凈化，進(jìn)行氟蟲腈及其代謝物的提取效果的研究，結(jié)果見表2、圖1。

表2 不同提取劑對氟蟲腈及其代謝物的提取效果Table 2 Extraction efficiencies of different solvents for fipronil and its metabolites

圖1 不同提取劑對氟蟲腈及其代謝物回收率的影響Fig.1 Effects of different extractants on the recoveries of fipronil and its metabolites

結(jié)果表明，當(dāng)4 種目標(biāo)物添加量為0.010 mg/kg，丙酮提取目標(biāo)物時，其對4 種目標(biāo)物的提取回收率為85.23%～90.70%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）不大于5.87%；乙腈對4 種目標(biāo)物的提取回收率為96.00%～98.52%，RSD不大于3.00%；正己烷對4 種目標(biāo)物的提取回收率為89.34%～95.75%，RSD不大于5.92%。由此可見使用乙腈作為提取劑時目標(biāo)物的回收率均高于使用丙酮和正己烷作為提取劑時目標(biāo)物的回收率，差異顯著（P＜0.05），這是由于乙腈極性大、穿透性強(qiáng)，與4 種目標(biāo)物極性更相似，故乙腈的提取率最高[28]。

2.2 提取劑的用量

分別添加5、10、15、20、25、30、35 mL乙腈對加標(biāo)量為0.200 mg/kg的空白茶葉樣品中4 種目標(biāo)物進(jìn)行提取，經(jīng)過PSA-SPE柱凈化，結(jié)果見圖2。

圖2 不同提取劑用量對氟蟲腈及其代謝物的提取效果Fig.2 Effect of acetonitrile dosage on the recoveries of fipronil and its metabolites

由圖2可以看出，隨著乙腈添加量的增加，4 種目標(biāo)物的響應(yīng)值也不斷增加，當(dāng)乙腈添加量為20 mL時，氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜響應(yīng)值達(dá)到最大，且隨著乙腈用量繼續(xù)增加，4 種目標(biāo)物的響應(yīng)值與乙腈添加量為20 mL時相當(dāng)，這說明在乙腈添加量為20 mL時4 種目標(biāo)物能被完全提取出來，故選擇20 mL作為提取劑的最適用量。

2.3 凈化柱的選擇

PSA可吸附蛋白質(zhì)、色素以及極性較高的酸性物質(zhì)[29]。C18可除去脂類、花青素、蠟質(zhì)等物質(zhì)，GCB可除去葉綠素、葉黃素、類胡蘿卜素等色素和甾醇等[19]。以加標(biāo)量為0.010 mg/kg的空白茶葉樣品為研究對象，對比3 種凈化柱對氟蟲腈及其代謝物的凈化效果，結(jié)果見圖3。

圖3 ENVI-18-SPE柱（A）、GCB-SPE柱（B）和PSA-SPE柱（C）凈化氟蟲腈及其代謝物的色譜圖Fig.3 Chromatograms of fipronil and its metabolites purified by ENVI-18-SPE cartridge (A),GCB SPE cartridge (B) or PSA SPE cartridge (C)

結(jié)果顯示，3 種小柱均可起到凈化的效果，但經(jīng)ENVI-18-SPE柱凈化后的4 種目標(biāo)物，雜質(zhì)峰較多，且響應(yīng)值較高，對目標(biāo)化合物檢出限附近濃度影響較大，這是由于茶葉樣品經(jīng)其凈化后還殘留其他雜質(zhì)。GCB-SPE柱凈化后的4 種目標(biāo)物存在被吸附的現(xiàn)象，響應(yīng)值均低于其他2 種凈化柱的凈化結(jié)果。PSA-SPE柱凈化的4 種目標(biāo)物分離效果較好，響應(yīng)值較高，故選擇PSA-SPE柱。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性關(guān)系

由圖4可知，4 種目標(biāo)物在16 min內(nèi)可以完全分離，分離效果好，達(dá)到了基線分離。

圖4 氟蟲腈及其代謝物的標(biāo)準(zhǔn)圖譜Fig.4 Chromatogram of standard mixture of fipronil and its metabolites

以氟蟲腈及其代謝物系列標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，響應(yīng)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性范圍；采用空白樣品添加目標(biāo)化合物的方法，選取同一空白茶葉樣品，向其添加目標(biāo)化合物，添加水平為0.002 mg/kg，平行測定10 次，根據(jù)信噪比法，典型可接受的信噪比為2∶1或3∶1[30]，本方法將平均信噪比為10∶1時的含量作為檢出限，結(jié)果見表3。

表3 氟蟲腈及其代謝物的線性回歸方程Table 3 Linear regression equations of fipronil and its metabolites

由表3可知，4 種目標(biāo)物在0.002～0.200 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2大于0.999，響應(yīng)值和氟蟲腈及其代謝物含量之間具有顯著的線性相關(guān)性。檢出限均為0.002 mg/kg，該方法靈敏度高，可以滿足氟蟲腈及其代謝物測定的要求。

2.5 重復(fù)性、精密度及正確度

選取同一空白茶葉樣品，向其添加目標(biāo)化合物，添加量分別為0.010、0.050 mg/kg和0.100 mg/kg，平行測定7 次，RSD小于5%，表明該方法重復(fù)性良好，精密度良好，達(dá)到分析要求，結(jié)果見表4。

表4 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=7）Table 4 Results of precision tests (n =7)

選取同一空白茶葉樣品，向其添加目標(biāo)化合物，以檢出限的1、5 倍和10 倍，在線性范圍內(nèi)選取0.002、0.010 mg/kg和0.020 mg/kg三個添加水平，每個樣品進(jìn)行3 次平行測定，得各水平加標(biāo)回收率在96.33%～102.50%之間，符合檢測方法確認(rèn)的技術(shù)要求[31]，結(jié)果見表5。

表5 正確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）Table 5 Results of spiked recovery tests (n=3)

2.6 樣品測定

使用本研究建立的氣相色譜-負(fù)化學(xué)源-質(zhì)譜法對30 份不同種類、不同批次的市售茶葉進(jìn)行檢測分析，并對烏龍茶中未檢出樣品進(jìn)行加標(biāo)回收測試，理論加標(biāo)值為0.020 mg/kg，結(jié)果見表6。

表6 不同市售茶葉的氟蟲腈及其代謝物含量Table 6 Results of determination of fipronil and its metabolites in different types of commercial tea by GC-NICI-MS

由表6可知，30 份茶葉樣品中氟蟲腈及其代謝物檢出率為6.67%，其中10 份綠茶中有1 批次氟蟲腈含量為（0.003±0.001）mg/kg，10 份紅茶中有1 批次氟蟲腈砜含量為（0.004±0.001）mg/kg，5 份烏龍茶和5 份黑茶中未檢出氟蟲腈及其代謝物，加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)回收率較好，說明本次市售茶葉檢測實(shí)驗(yàn)正確度較好，數(shù)據(jù)可信度高。

檢出樣品中氟蟲腈及其代謝物總量（以氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜之和計(jì)）高于日本規(guī)定的茶葉中氟蟲腈的最大殘留量0.002 mg/kg，但未達(dá)到歐盟規(guī)定蔬菜中氟蟲腈的最大殘留量0.005 mg/kg。GB 2763—2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中，未對茶葉中氟蟲腈及其代謝物做出限量規(guī)定，表明其作為農(nóng)藥禁止在茶葉中使用。鑒于氟蟲腈對甲殼類水生生物和蜜蜂具有較高風(fēng)險，在水和土壤中降解慢，我國在2009年就對其限制使用[32]，只允許衛(wèi)生用或作為部分旱田種子包衣劑使用。茶葉樣品中氟蟲腈及其代謝物的檢出，可能存在茶農(nóng)非法使用氟蟲腈的現(xiàn)象，亦或是氟蟲腈被施用后，對環(huán)境造成污染，從而被茶樹吸收，導(dǎo)致茶葉中檢出氟蟲腈及其代謝物。針對該現(xiàn)象，國家應(yīng)加強(qiáng)對氟蟲腈的管理，如對食品中氟蟲腈及其代謝物進(jìn)行定期抽檢和風(fēng)險評估，同時還應(yīng)對環(huán)境中氟蟲腈及其代謝物的污染進(jìn)行監(jiān)測，加強(qiáng)監(jiān)管，引導(dǎo)農(nóng)民科學(xué)選購與使用農(nóng)藥，確保農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境及食品安全。

茶葉中氟蟲腈及其代謝物超過最大殘留量也不能說明其對人體有高暴露風(fēng)險，應(yīng)結(jié)合不同人群實(shí)際飲茶量和沖泡方式進(jìn)行綜合分析，可根據(jù)泡茶工藝展開研究并進(jìn)行暴露分析。

3 結(jié)論

本研究建立的氣相色譜-負(fù)化學(xué)源-質(zhì)譜法適用于茶葉中氟蟲腈及其代謝物：氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜的測定。該方法線性范圍較廣、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高，能快速簡便的對茶葉中氟蟲腈及其代謝物進(jìn)行檢測分析。使用本研究建立的氣相色譜-負(fù)化學(xué)源-質(zhì)譜法測定不同市售茶葉中氟蟲腈及其代謝物，結(jié)果準(zhǔn)確、回收率高，能準(zhǔn)確反映市售茶葉被氟蟲腈及其代謝物的污染情況，在氟蟲腈及其代謝物痕量檢測領(lǐng)域可廣泛應(yīng)用。