固相萃取-同位素稀釋/超高效液相色譜-串聯質譜法測定蜂蜜中甲硝唑、二甲硝咪唑和洛硝噠唑

林 浩，劉 川，張陽陽，肖全偉，毛 銳，萬渝平，戴 琴

（成都市食品檢驗研究院，四川 成都 611130）

硝基咪唑類藥物是臨床常用的廣譜抗生素，由于其殺菌作用強、療效好、價格低廉，被廣泛應用于治療原蟲感染、厭氧菌感染等疾病，并具有較好的抗腫瘤、抗病毒、抗結核等作用[1]。如甲硝唑（metronidazolem，MNZ）、洛硝噠唑、塞克硝唑等在細菌感染、滴蟲病等方面療效顯著，已成為預防和治療人類、畜禽等生物體感染該類疾病主要的藥物[2-3]。然而，由于硝基咪唑類藥物對哺乳動物具有致畸、致癌及遺傳毒性等作用，對人類健康構成潛在威脅[4]，美國和歐盟等國家已規(guī)定在食品中禁用該類物質[5-6]，我國已制定GB 31650—2019《食品中獸藥最大殘留限量》、農業(yè)農村部公告第250號《食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》等相應國家標準對其嚴格監(jiān)管[7-8]。

硝基咪唑類藥物是一類具有咪唑環(huán)和硝基取代基結構的化合物，根據取代基種類和位置差異可分為不同化合物，主要包括MNZ及其代謝產物羥基甲硝唑、二甲硝咪唑（dimetridazole，DMZ）及其代謝產物羥甲基甲硝咪唑、洛硝噠唑（ronidazole，RNZ）、異丙硝唑等[9]。由于硝基取代基具有生物還原特性，被還原為硝基自由基時，能與DNA、蛋白質等生物分子發(fā)生多種相互作用[10]，使硝基咪唑類衍生物與生物體內酶、受體、DNA等許多大分子發(fā)生超分子結合，產生抗寄生蟲、抗癌、抗感染等醫(yī)藥活性[11]。目前硝基咪唑類殘留物的檢測方法較多，已有針對不同基質建立的方法，如：GB/T 21318—2007《動物源食品中硝基咪唑殘留量檢驗方法》[12]、SN/T 1928—2007《進出口動物源性食品中硝基咪唑殘留量檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法》[13]、SN/T 2624—2010《動物源性食品中多種堿性藥物殘留量的檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法》等[14]，測定方法主要包括酶聯免疫吸附法、滴定法、液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜-串聯質譜法、氣相色譜-串聯質譜法等[15]，其中液相色譜-串聯質譜法具有高效、高靈敏度、高特異性等特點[16]，為常用方法。

蜂蜜是由蜜蜂采集的花蜜、蜜露等釀造而成的天然食品，具有改善人體代謝、提高免疫能力等作用，倍受人們青睞[17]。作為有機生命體，蜜蜂因細菌、真菌或病毒侵襲而導致疾病，藥物防治是控制蜜蜂病蟲害的主要技術之一[18]，如MNZ作為抗感染一線藥物，被普遍用于控制和預防蜜蜂微孢子蟲病等。但蜂群中藥物濫用可能會導致蜂蜜中藥物積累，增加蜂蜜及相關制品對人體的危害性，已有相關報道顯示蜂蜜中的確存在氯霉素、MNZ等抗生素蓄積案例[19]。目前蜂蜜中硝基咪唑類物質常用檢測方法為GB/T 23410—2009《蜂蜜中硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留量的測定 液相色譜-質譜/質譜法》[20]，該方法使用二甲硝咪唑-D3（dimetridazole-D3，DMZ-D3）作為DMZ和MNZ的內標，二甲硝咪唑代謝物-D3作為RNZ的內標，但檢測時發(fā)現，不同蜂蜜的基質效應對各目標物的影響存在差異，使用以上定量方法會對MNZ和RNZ的定量結果產生偏離，導致測定結果不準確。該方法前處理中并無凈化過程，導致在定性定量過程中，容易受到蜂蜜雜質干擾而影響結果準確性，降低檢測效率。本實驗對蜂蜜中MNZ、DMZ、RNZ測定方法進行研究，優(yōu)化前處理工藝和定量方法，建立對蜂蜜具有普遍適用性的測定方法，使測定結果更加準確。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂蜜樣品均為市購。

MNZ（純度99.5%） 北京曼哈格生物科技有限公司；DMZ（純度99.46%）、氘代二甲硝咪唑-D3（99.23%）、氘代洛硝噠唑-D3（100.04 μg/mL）美國Dr.Ehrenstorfer公司；RNZ（99.0%）、氘代甲硝唑-D4（100.5 μg/mL） 北京曼哈格生物科技有限公司。

PCX陽離子交換柱、PEP固相萃取柱 天津博納艾杰爾科技有限公司；C18固相萃取柱 美國Water公司；甲酸、甲醇、乙腈、乙酸銨、乙酸乙酯（均為色譜純）德國Merck公司；濃鹽酸、氨水（均為分析純） 重慶川東化工集團有限公司；實驗用水符合GB/T 6682—2008《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》實驗室一級用水。

1.2 儀器與設備

QTRAP5500 三重四極桿串聯質譜儀美國AB SCIEX公司；Centrifuge 5810 R高速離心機德國Eppendorf公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司；ASPE-24固相萃取儀、MTN-2800W氮吹濃縮儀天津奧特賽恩斯公司；Multi reax全能型振蕩器 德國Heidolph公司；BP211D型天平 德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 標準物質的配制

1.3.1.1 標準溶液配制

準確稱取MNZ、DMZ、RNZ標準品各10 mg（準確至0.01 mg）于3 個10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制質量濃度為1000 μg/mL的標準儲備液，4 ℃避光保存，有效期6 個月[20]。

準確移取各標準儲備液100 μL于同一10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，得質量濃度為10 μg/mL混合標準中間溶液。

分別準確移取2 mL、200 μL和20 μL混合標準中間溶液于3 個10 mL棕色容量瓶中，甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，得質量濃度為2 μg/mL、200 ng/mL和20 ng/mL混合標準工作溶液。

1.3.1.2 同位素內標標準溶液配制

準確稱取DMZ-D3標準品10 mg（準確至0.01 mg）于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制質量濃度為1000 μg/mL的DMZ-D3標準儲備液。

準確移取上述DMZ-D3標準儲備液1 mL至10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，配制質量濃度為100 μg/mL的DMZ-D3標準中間溶液。

準確移取上述DMZ-D3標準中間溶液、MNZ-D4標準溶液、RNZ-D3標準溶液各100 μL至同一10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，得質量濃度為1 μg/mL混合同位素內標標準工作溶液。

1.3.1.3 標準工作曲線配制

分別準確移取20 ng/mL混合標準工作溶液50、100、250、500 μL和200 ng/mL混合標準工作溶液100、250、500 μL置于1 mL容量瓶中，再分別加入混合同位素內標標準工作溶液50 μL，用20%甲醇溶液稀釋并定容至刻度，搖勻，得標準工作曲線，質量濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL，內標終質量濃度50 ng/mL。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 樣品提取

1.3.2.2 直接上機測定

向1.3.2.1節(jié)中氮吹管中加入1 mL 20%甲醇溶液復溶，渦旋1 min，過0.22 μm有機濾膜測定。

1.3.2.3 PCX固相萃取小柱凈化

向1.3.2.1節(jié)中氮吹管中加入5 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液復溶，渦旋1 min，傾入已用5 mL甲醇和5 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液活化的PCX固相萃取小柱中，用5 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液和5 mL甲醇淋洗，最后用5 mL洗脫液（甲醇-水-氨水，16∶3∶1，V/V）洗脫至接收管中，40 ℃氮吹至近干，1 mL 20%甲醇溶液復溶，渦旋1 min，過0.22 μm有機濾膜測定。

1.3.3 基質效應考察

1.3.3.1 制備空白基質

準確稱取混合均勻的同一陰性蜂蜜樣品10 份，每份10 g分別置于50 mL具塞離心管中，均加入超純水5 mL，搖勻后加入10 mL乙酸乙酯提取，渦旋5 min，10000 r/min離心5min，取乙酸乙酯層至氮吹管，殘渣中加入10 mL乙酸乙酯重復提取1 次，合并乙酸乙酯層，40 ℃氮吹至干，向氮吹管中加入1 mL 20%甲醇溶液復溶，渦旋1 min，過0.22 μm有機濾膜，合并10 份濾液，搖勻，即得蜂蜜空白基質。分別制備枸杞、野花、洋槐、枇杷、油菜花和益母草6 種不同蜂蜜基質。

4.額外量價格指導下，煉廠出口成品油將由過去的減利因素反轉為增利因素，增加出口的積極性。基礎量政策未實施前，煉廠測算出口價格比留國內出廠價低600 元/噸?；A量政策實施后，煉廠測算出口價格將比額外量價格高1000 元/噸，出口遠好于留國內作額外量。國內競爭對手的經驗也驗證了此結論：2016 年中化泉州煉廠因出口200 萬噸汽油，較留國內批發(fā)增利20 億元。

1.3.3.2 制備高質量濃度混合外標溶劑曲線

分別準確移取200 ng/mL混合標準工作溶液50、100、250、500 μL和2 μg/mL混合標準工作溶液100、250、500 μL置于1 mL容量瓶中，用20%甲醇溶液稀釋并定容至刻度，搖勻，即得高質量濃度混合外標溶劑曲線，質量濃度分別為10、20、50、100、200、500、1000 ng/mL。

1.3.3.3 制備基質及溶劑外標曲線

分別準確移取1.3.3.2節(jié)中高質量濃度混合外標溶劑曲線各質量濃度點100 μL置于1 mL容量瓶中，再用1.3.3.1節(jié)中空白基質分別稀釋并定容至刻度，搖勻，即得蜂蜜基質曲線，質量濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL。按上述方法分別制備枸杞、野花、洋槐、枇杷、油菜花和益母草6 個實驗組的混合外標（MNZ、DMZ、RNZ）基質曲線。以及使用20%甲醇溶液制備同質量濃度外標溶劑曲線。

1.3.3.4 基質效應計算

考察不同種類蜂蜜的基質效應強弱，以曲線斜率計算基質效應，按式（1）[21]計算：

式中：k1為基質匹配標準曲線斜率；k2為溶劑標準曲線斜率。

當基質效應絕對值小于15%時，則表明不存在基質效應，當基質效應絕對值超過20%，則表明存在明顯的基質效應[22-23]，絕對值越大則基質效應越強。若基質效應值為正值，則存在基質增強效應，若為負值，則存在基質抑制效應。

1.3.4 檢測條件

1.3.4.1 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）；流速0.40 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量2 μL。流動相體系：A為甲醇、B為0.1%甲酸溶液；梯度洗脫程序見表1。

表1 MNZ、DMZ、RNZ分離的梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program for the separation of MNZ,DMZ and RNZ

1.3.4.2 質譜條件

電噴霧離子源正離子模式；氣簾氣壓力20 psi；離子化電壓5500 V；溫度550 ℃；噴霧氣壓力50 psi；輔助加熱氣壓力60 psi；噴撞氣：中等；掃描方式為多反應監(jiān)測；監(jiān)測離子參數見表2。

表2 MNZ、DMZ、RNZ特征離子質譜條件Table 2 Mass spectrometric parameters for MNZ,DMZ and RNZ

2 結果與分析

2.1 基質效應考察結果

以質量濃度為橫坐標，標準物質響應為縱坐標作圖，繪制曲線圖，各曲線線性方程相關系數R均大于0.99，線性回歸曲線見表3。根據基質效應計算公式，各蜂蜜基質效應對目標物的影響見圖1。由圖1可知，6 種蜂蜜對MNZ、DMZ、RNZ均存在基質抑制效應，且各目標物所受抑制效應的強度也存在差異。

表3 各蜂蜜中目標物基質曲線線性方程Table 3 Calibration equations for MNZ,DMZ and RNZ in honeys from different floral origins

圖1 不同蜂蜜的基質效應對目標物的影響Fig.1 Matrix effect of honeys from different floral origins

2.2 流動相考察

由于酸性色譜條件有利于正離子模式下的離子化[24]，對色譜條件流動相進行考察，篩選乙腈-水（含0.1%甲酸）系統(tǒng)、乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）系統(tǒng)、甲醇-5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）系統(tǒng)和甲醇-水（含0.1%甲酸）系統(tǒng)，并優(yōu)化流動相梯度。結果發(fā)現，4 種流動相系統(tǒng)對目標物的測定并無明顯影響。因此，選擇對色譜柱損耗較小的甲醇-水（含0.1%甲酸）流動相系統(tǒng)，優(yōu)化后的圖譜見圖2。

圖2 目標化合物離子通道圖Fig.2 Chromatograms of MNZ,DMZ and RNZ using methanol-0.1%formic acid solution as mobile phase

2.3 線性關系、檢出限和定量限結果

配制目標化合物溶劑曲線，以MNZ-D4、DMZ-D3、RNZ-D3分別作為MNZ、DMZ、RNZ的內標進行定量分析，MNZ、DMZ、RNZ在1.0～100.0 ng/mL質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數R均大于0.99。通過梯度稀釋標準溶液法[25]，獲得色譜信噪比為3時的目標化合物質量濃度作為儀器檢出限（limit of detection，LOD），信噪比為10時的目標化合物質量濃度作為儀器定量限（limit of quantitation，LOQ）。通過儀器檢測，LOD為0.7 ng/mL，即0.07 μg/kg。LOQ為2 ng/mL，即0.2 μg/kg。

2.4 前處理優(yōu)化

蜂蜜中含有氨基酸、糖類、有機酸和少量蛋白質等成分，不但會污染質譜離子源，而且會影響目標化合物的測定[26]。在日常檢測中，蜂蜜的基質干擾對硝基咪唑類目標物的測定具有較大影響，需要不斷更改流動相系統(tǒng)或梯度優(yōu)化分離效果，并用標準溶液重新校正，使測定工作變得繁瑣。為了提高檢測效率，節(jié)約成本，在乙酸乙酯提取基礎上，設置凈化流程降低蜂蜜中雜質干擾，以雜質干擾較為嚴重的枇杷蜂蜜作為基質，考察用C18、PEP、PCX三種固相萃取小柱對蜂蜜基質0.5 μg/kg加標的乙酸乙酯提取液中目標化合物的凈化效果，篩選最佳凈化方法。各固相萃取柱凈化情況見圖3。

由圖3可知，3 種凈化小柱對蜂蜜中MNZ和RNZ均有一定的凈化效果，但經C18和PEP小柱凈化所得圖譜依然存在較為明顯的雜峰干擾，而PCX小柱凈化對MNZ、DMZ和RNZ的蜂蜜雜峰消除更為明顯，已基本無任何雜質干擾。這可能與固相萃取柱填料性質及吸附作用有關。C18柱為十八烷基鍵合硅膠柱，對脂類、色素及芳香族化合物成分具有明顯吸附作用[27-28]。PEP柱為官能化聚苯乙烯/二乙烯苯萃取柱，表面同時具有親水性和憎水性基團，對各類極性、非極性化合物具有較均衡的吸附作用。PCX柱為混合型陽離子交換柱，是以陽離子交換混合機理的水可浸潤型聚合物為基質的固相萃取柱，能提供雙重保留模式：即離子交換與反相保留，填料為C18非極性/丙基苯磺酸基聚合而成，在pH 0～14.0范圍內都很穩(wěn)定，具有較大的結合容量[29]。與C18柱和PEP柱相比，PCX柱兼有吸附和反相吸附混合作用力，在離子交換作用力的基礎上還增加了非極性作用力，具有更好的凈化效果[30]，因此，本方法設計PCX固相萃取柱凈化有利于提升檢驗方法的專屬性。

圖3 目標化合物定量離子通道圖Fig.3 Effect of different solid phase extraction cartridges on the purification of MNZ,DMZ and RNZ

2.5 加標回收實驗

以MNZ、DMZ、RNZ檢測均為陰性且基質抑制效應較為明顯的枇杷蜂蜜為基質，設定回收加標量0.2、1.0、2.0、5.0 μg/kg，每組每個添加水平平行6 份，按1.3.2.1節(jié)和1.3.2.3節(jié)方法進行前處理。實驗回收率和精密度測定結果見表4。MNZ回收率范圍為95.0%～101.0%，DMZ回收率范圍為95.7%～101.4%，RNZ回收率范圍為96.0%～100.7%。以MNZ-D4、DMZ-D3、RNZ-D3分別作為MNZ、DMZ、RNZ的內標進行定量分析，受基質效應的影響更小，測定結果更加準確，且相對標準偏差小于5%，具有良好的精密度。

表4 實驗回收率和精密度Table 4 Recoveries and precision for spiked loquat honey

2.6 實際樣品測定

2021年10—12月，本實驗組用此方法對市場購買的蜂蜜樣品進行MNZ、DMZ、RNZ殘留量檢測，共計50 批次，結果均為未檢出，定性結果與平行實驗室相同。50 批次蜂蜜檢測圖譜均無明顯雜質峰干擾，無需更換流動相系統(tǒng)或梯度，既提高檢測效率，又確保了測定結果的準確性。

3 結論

采用超高效液相色譜-串聯質譜法建立一種蜂蜜中MNZ、DMZ、RNZ的測定方法，在GB/T 23410—2009《蜂蜜中硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留量的測定 液相色譜-質譜/質譜法》方法的基礎上，選用混合陽離子交換柱凈化提取液，并優(yōu)化液相條件。以MNZ-D4和RNZ-D3分別作為MNZ和RNZ的內標進行定性定量測定，該方法在1.0～100.0 ng/mL質量濃度范圍內線性關系良好，LOD為0.07 μg/kg，LOQ為0.2 μg/kg，標準添加量在0.2、1.0、2.0、5.0 μg/kg時，MNZ、DMZ、RNZ的加標平均回收率為95.0%～101.4%，表明測定結果受蜂蜜基質效應影響較小，結果更加準確。且相對標準偏差為1.6%～3.7%，具有良好的精密度。結果表明，該方法操作簡便，具有較高的靈敏度和準確度，能夠滿足蜂蜜中MNZ、DMZ和RNZ的日常檢測。