抑制HDAC11減輕OGD/R所致的HT22細(xì)胞損傷*

鄭琪雪 ， 楊 洋 ， 費(fèi)慧芝 ， 楊俊卿 △

（1重慶醫(yī)科大學(xué)，重慶 400016；2重慶醫(yī)科大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)院，重慶 400021；3重慶市婦幼保健院，重慶 400021）

新生兒缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage， HIBD）是由圍產(chǎn)期胎兒因缺乏血流或氣體交換障礙導(dǎo)致［1］。新生兒的大腦需要高水平的氧氣供應(yīng)，因此對缺氧極為敏感。嚴(yán)重的HIBD導(dǎo)致諸多神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，包括智力遲鈍，認(rèn)知障礙，腦癱和癲癇等［2］。目前，臨床上主要采用亞低溫治療、對癥治療和營養(yǎng)支持等方法。HIBD的病理生理機(jī)制并不完全清楚，臨床治療效果并不理想，因此需深入探究其發(fā)展機(jī)制，尋找HIBD干預(yù)新靶點(diǎn)。

組蛋白脫乙酰酶（histone deacetylases， HDACs）包含4類，家族成員眾多，發(fā)揮的功能作用并不相同。抑制Ⅰ類HDACs改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的β-淀粉樣蛋白沉積［3］；抑制Ⅱ類HDACs調(diào)節(jié)組蛋白H2A及α-微管蛋白乙酰化水平改善腦缺血大鼠神經(jīng)元損傷［4-5］；與Ⅰ類和Ⅱ類作用不同，Ⅲ類HDACs可能有神經(jīng)保護(hù)作用，抑制Sirt1（Ⅲ類）會加重小鼠腦缺血損傷，其機(jī)制與P5及P65乙酰化水平增加有關(guān)［6-7］；HDAC11屬于第Ⅳ類中唯一的成員，在腦內(nèi)表達(dá)豐富，影響小鼠腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育，HDAC11是一種涉及多種細(xì)胞途徑的酶，但關(guān)于所涉及的分子機(jī)制仍不清晰［8］，且HDAC11在不同環(huán)境中的調(diào)節(jié)作用呈現(xiàn)差異性。雖有研究表明［9］，抑制HDAC11促進(jìn)抗炎因子白細(xì)胞介素10（interleukin-10，IL-10）的表達(dá)，但另有研究顯示，敲除HDAC11基因會增加嗜中性粒細(xì)胞促炎因子腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha， TNF-α）及IL-6的表達(dá)［10］。HDAC11在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的作用研究尚少，HDAC11在HIBD中是否發(fā)揮作用，是保護(hù)作用還是損傷性作用，其作用機(jī)制如何，這些均不清楚，值得研究。

氧化應(yīng)激是氧化劑與抗氧化劑平衡的紊亂。由于新生兒的特性，更容易受到氧化應(yīng)激損傷。新生兒大腦富含脂肪酸，容易受到自由基和脂質(zhì)過氧化損傷，未成熟腦組織對自由基高度敏感且抗氧化功能不完善［11］。氧化應(yīng)激是HIBD發(fā)生后神經(jīng)元死亡的重要原因。HIBD發(fā)生后，細(xì)胞內(nèi)Ca2+、Na+和二磷酸腺苷（adenosine diphosphate， ADP）升高導(dǎo)致線粒體產(chǎn)生有害活性氧，導(dǎo)致多不飽和脂肪酸氧化成丙二醛（malondialdehyde，MDA），同時(shí)活性氧介導(dǎo)分子信號傳導(dǎo)，其中轉(zhuǎn)錄因子p53激活產(chǎn)生促凋亡蛋白如BAX，促進(jìn)壞死和細(xì)胞凋亡［12］。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）及還原型谷胱甘肽（glutathione， GSH）保護(hù)細(xì)胞免受自由基的侵害，內(nèi)源性抗氧化物GSH的含量的增加減輕神經(jīng)損傷［13］。MDA，SOD，GSH是氧化應(yīng)激的標(biāo)志性物質(zhì)。

小鼠HT22細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation， OGD/R）能夠部分模擬HIBD的病理生理過程變化［14］，因此本研究旨在觀察N'-十六烷基噻吩-2-碳酰肼（N'-hexadecylthiophene-2-carbohydrazide， SIS17）特異性抑制 HDAC11對OGD/R致小鼠HT22細(xì)胞損傷的作用，并從酪氨酸激酶（Mer tyrosine kinase， MerTK）調(diào)控氧化應(yīng)激損傷和凋亡通路初步探討其機(jī)制。

材料和方法

1 細(xì)胞

小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元HT22細(xì)胞系購自上海中喬新舟生物科技有限公司。

2 主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)液、DMEM無糖培養(yǎng)液及0.25%胰蛋白酶購自Gibco；青霉素-鏈霉素溶液（C0222）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；胎牛血清購自蘇州依科賽生物科技有限公司；HDAC11特異性抑制劑SIS17（HY-128918）購自MedChemExpress；LDH（A020-2），SOD（A001-3），GSH（A006-2-1）和MDA（A003-1）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所有限公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（MA0220）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；抗β-Tubulin抗體（10068-1-AP）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；抗HDAC11抗體（bs-2894R）及抗 caspase12抗體（bs-23014R）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司； 抗MerTK抗體（DF7344），抗ATF6抗體（DF6009）及抗Bax抗體（AF0120）均購自Affinity；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG購自北京蘭杰柯科技有限公司。

3 實(shí)驗(yàn)儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱（311，Thermo Scientific）；三氣培養(yǎng)箱（3423，Thermo Scientific）；低溫離心機(jī)（Icen-24R，Thermo Scientific）；垂直電泳儀（041BR304570，BIORAD）；成像儀（VLBL00D2， BIO-RAD）。

4 實(shí)驗(yàn)方法

4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 完全培養(yǎng)液：10%胎牛血清，1%青霉素鏈霉素溶液，89%DMEM高糖培養(yǎng)液。細(xì)胞傳代：HT22細(xì)胞于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，密度達(dá)到85%時(shí)進(jìn)行傳代，棄置原完全培養(yǎng)液，PBS潤洗2次后加入0.25%胰蛋白酶于培養(yǎng)箱中消化1 min，添加適量完全培養(yǎng)液終止消化，吹打細(xì)胞成均一懸液，1 000 ×g離心4 min，取新配置完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種至新的培養(yǎng)瓶中。

4.2 OGD/R模型建立及實(shí)驗(yàn)分組 培養(yǎng)HT22細(xì)胞至85%密度時(shí)，除對照（control）組，其他各組棄去培養(yǎng)液后用PBS潤洗2次，添加工作體積DMEM無糖培養(yǎng)液并置于三氣培養(yǎng)箱（95% N2，1%O2，4% CO2）中進(jìn)行氧糖剝奪4 h，再更換為DMEM高糖完全培養(yǎng)液于普通培養(yǎng)箱復(fù)糖復(fù)氧24 h。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)對HDAC11特異性抑制劑SIS17安全范圍篩查以及文獻(xiàn)報(bào)道SIS17具有劑量依賴性［15］，本研究對SIS17劑量 的 設(shè) 置 為（SIS17-L：3×10-6mol/L，SIS17-M：1×10-5mol/L，SIS17-H：3×10-5mol/L）。本次研究中細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為5組：對照（control）組，模型（OGD/R）組，OGD/R+L組，OGD/R+M組和OGD/R+H組。

4.3 MTT法檢測細(xì)胞活力 HT22細(xì)胞以每孔3 000個(gè)接種于96孔板，高中低劑量SIS17處理24 h后進(jìn)行OGD/R，每孔加入20 μL MTT溶液（5 g/L），37 ℃孵育4 h，低速離心，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO溶解甲瓚，于水平搖床避光震蕩15 min充分溶解，酶標(biāo)儀490 nm處測定吸光度（A）值，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞活力，細(xì)胞活力（%）=［A值（實(shí)驗(yàn)組）-A值（空白組）］/［A值（對照組）-A值（空白組）］×100%，實(shí)驗(yàn)組：OGD/R，OGD/R+L，OGD/R+M，OGD/R+H；對照組：control；空白組：含完全培養(yǎng)液無細(xì)胞。

4.4 細(xì)胞LDH測定 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，依次加入雙蒸水，0.2 mol/L丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液，待測樣本，基質(zhì)緩沖液，輔酶I，混勻。37 ℃溫浴15 min，加入2，4-二硝基苯肼，混勻，37 ℃溫浴15 min，加入0.4 mol/L NaOH溶液混勻，室溫放置5 min，波長450 nm，酶標(biāo)儀測定吸光度值。

4.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 將HT22細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化，1 000 ×g離心5 min，收集細(xì)胞，加入預(yù)冷PBS溶液洗滌離心2次，在細(xì)胞沉淀中加入結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin VFITC和10 μL碘化丙碇（PI）染色液并混勻，室溫避光孵育15 min，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

4.6 TUNEL染色 用PBS潤洗HT22細(xì)胞，4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS潤洗，0.3% Triton X-100室溫反應(yīng)30 min，PBS潤洗，加入平衡緩沖液，室溫反應(yīng)40 min，倒掉液體加入緩沖液，37 ℃孵育1.5 h，PBS潤洗后，加入DAPI溶液復(fù)染10 min，PBS潤洗后，熒光顯微鏡下成像。200倍下選擇4個(gè)具有代表性的視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)和陰性細(xì)胞數(shù)，陽性細(xì)胞百分率%=陽性細(xì)胞總數(shù)/（陽性細(xì)胞總數(shù)+陰性細(xì)胞總數(shù)）×100%，取平均值。

4.7 SOD，GSH和MDA測定 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，根據(jù)試劑盒說明書，參考文獻(xiàn)方法［16］，于孔板加入相應(yīng)試劑，分別于450 nm和405 nm處測定SOD及GSH吸光度值。TBA法測定MDA，PBS潤洗并收集細(xì)胞，破碎細(xì)胞后根據(jù)試劑盒步驟操作，于532 nm處測定MDA吸光度值。

4.8 Western blot檢測蛋白表達(dá)水平 收集細(xì)胞總蛋白，加入蛋白裂解液（RIPA∶PMSF∶磷酸酶抑制劑=100∶1∶2）經(jīng)破碎后低溫離心（4 ℃，12 000 ×g）15 min，取上清測蛋白濃度，按1∶4的比例加入5×蛋白上樣緩沖液，98℃變性15 min，取30 μg進(jìn)行上樣。蛋白經(jīng)電泳（90V，30 min；120 V，60 min）轉(zhuǎn)膜（250 mA，100 min）后經(jīng)5%脫脂奶粉封閉2 h，孵育Ⅰ抗4 ℃過夜，TBST洗3次每次5min，室溫孵育Ⅱ抗（1∶2 000），TBST洗3次，ECL發(fā)光液用于成像。抗體稀釋倍數(shù)：兔多克隆抗體：HDAC11（1∶1 000），MerTK（1∶1 000），Bax（1∶1 000），caspase-12（1∶1 000）和 β-Tubulin（1∶1 000），HRP 標(biāo)記山羊抗兔 IgG（1∶4 000），Image Lab對圖像進(jìn)行灰度值分析。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05具備統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

1 HDAC11特異性抑制劑SIS17在HT22細(xì)胞上的安全范圍

MTT法篩選HDAC11特異性抑制劑SIS17的安全范圍。在10-4～10-13mol/L范圍內(nèi)，SIS17對HT22細(xì)胞活力的影響不顯著（P＞0.05），見圖1A。OGD/R處理HT22細(xì)胞后，細(xì)胞數(shù)量減少，呈現(xiàn)損傷狀態(tài)；不同濃度SIS17處理OGD/R細(xì)胞后，細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞狀態(tài)得到改善，見圖1B。

Figure 1. Effect of HDAC11 inhibitor on viability and morphological of HT22 cells treated with OGD/R. A： cell viability detected by MTT assay； B： morphological alterations of HT22 cells. Mean±SEM. n=4.圖1 抑制HDAC11對小鼠HT22細(xì)胞活力及形態(tài)學(xué)的影響

2 抑制HDAC11對OGD/R處理小鼠HT22細(xì)胞的存活率及LDH影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比于control組，OGD/R組小鼠HT22細(xì)胞的活力顯著降低（P＜0.05）；相比于OGD/R組，OGD/R+L組細(xì)胞活力有上升趨勢但無顯著性差異（P＞0.05），OGD/R+M及OGD/R+H組細(xì)胞活力顯著升高（P＜0.05），見圖2A。如圖2B所示，相比于control組，OGD/R組HT22細(xì)胞LDH活力顯著升高（P＜0.01）；相比于 OGD/R 組，OGD/R+L組，OGD/R+M組及OGD/R+H組HT22細(xì)胞LDH活力均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

Figure 2. Effect of inhibiting HDAC11 on viability and LDH of HT22 cells treated with OGD/R. A： cell viability； B： LDH activity of HT22 cells； Mean±SEM. n=4. *P＜0.05， **P＜0.01 vs control group； #P＜0.05， ##P＜0.01 vs OGD/R group.圖2 抑制HDAC11對小鼠HT22細(xì)胞活力及LDH活力的影響

3 抑制HDAC11對OGD/R處理的HT22細(xì)胞凋亡的影響

為探究HDAC11特異性抑制劑SIS17對OGD/R處理小鼠HT22細(xì)胞凋亡的影響，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，相比于control組（凋亡率6.71%），OGD/R組細(xì)胞凋亡率升高（凋亡率37.14%），相比于OGD/R組，OGD/R+L，OGD/R+M及OGD/R+H組細(xì)胞凋亡率降低（分別為：26.69%，16.64%，15.78%）（P＜0.05，P＜0.01，見圖3A）。如圖3B，TUNEL染色結(jié)果顯示，相比于control組，OGD/R組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；相比于OGD/R組，OGD/R+H組細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）。

4 抑制HDAC11減輕OGD/R處理的HT22細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷

Figure 3. Inhibition of HDAC11 ameliorate apoptosis of HT22 cells damaged by OGD/R. A： the apoptosis rate of HT22 cells was detected by flow cytometry； B： TUNEL staining， blue DAPI， red TUNEL （scale bar=100 μm）. Mean±SEM. n=3. **P＜0.01 vs control group； #P＜0.05 vs OGD/R group.圖3 抑制HDAC11改善小鼠HT22細(xì)胞凋亡

為探究HDAC11特異性抑制劑SIS17對OGD/R致小鼠HT22細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響。如圖4所示，相比于control組，OGD/R組超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽（GSH）含量顯著降低（P＜0.01，P＜0.05），丙二醛（MDA）顯著升高（P＜0.01），細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷明顯。相比于OGD/R組，OGD/R+L組和OGD/R+M組細(xì)胞的SOD及GSH含量有上升趨勢，MDA有降低趨勢但無統(tǒng)計(jì)學(xué)（P＞0.05）；相比于OGD/R組，OGD/R+H組SOD及GSH含量顯著升高（P＜0.05），MDA含量顯著降低（P＜0.05）。

Figure 4. Inhibition ofHDAC11 ameliorate oxidative stress injury in HT22 cells damaged by OGD/R.A： SOD level； B： GSH level；C： MDA level. Mean±SEM. n=4.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group； #P＜0.05 vs OGD/R group.圖4 抑制HDAC11改善小鼠HT22細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷

5 抑制HDAC11對OGD/R處理的小鼠HT22細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

如圖5所示，相比于control組，OGD/R組HDAC11，MerTK，caspase-12及Bax蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）。相較于OGD/R組，OGD/R+L組及OGD/R+M 組Bax表達(dá)顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），而HDAC11，MerTK和caspase-12蛋白表達(dá)水平 均 無 顯 著 性 差 異（P＞0.05）；OGD/R+H 組HDAC11，caspase-12及 Bax顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），而MerTK蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）。

討 論

Figure 5. Effect of HDAC11 inhibitor on protein expression of HDAC11， MerTK， caspase12， BAX in OGD/R treated with HT22 cells. Mean±SEM. n=3. *P＜0.05， **P＜0.01 vs control group； #P＜0.05， ##P＜0.01 vs OGD/R group.圖5 抑制HDAC11對小鼠HT22細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

新生兒缺氧缺血性腦損傷是（HIBD）導(dǎo)致死亡和終身殘疾的主要原因，急需尋求新的治療靶點(diǎn)。小鼠HT22細(xì)胞是一種原代小鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)物中永生化的親本HT4細(xì)胞的亞系，可以很好的體外模擬神經(jīng)元功能。HDACs抑制劑多為非選擇性抑制多個(gè)HDAC，不能針對性抑制特定的靶標(biāo)。而SIS17是一種靶向性HDAC11抑制劑，并不影響其他HDACs的活性及表達(dá)量［14］。本研究在小鼠HT22細(xì)胞上模擬HIBD疾病模型，并初步探討抑制HDAC11對HIBD的作用及機(jī)制。

研究表明，HIBD的發(fā)生導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)釋放異常，小膠質(zhì)細(xì)胞受到刺激產(chǎn)生大量氧自由基，這些物質(zhì)通過氧化還原信號破壞血腦屏障完整性，啟動細(xì)胞凋亡，凋亡的細(xì)胞得不到及時(shí)清除會釋放細(xì)胞因子引起更強(qiáng)的級聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致神經(jīng)元的進(jìn)一步損傷［17-18］。新生兒因自身特性，更易受到凋亡及氧化應(yīng)激損傷，MerTK通路可抑制先天免疫反應(yīng)并促進(jìn)凋亡細(xì)胞的清除，緩解神經(jīng)元的進(jìn)一步損傷，因此針對MerTK調(diào)控凋亡及氧化應(yīng)激通路或可改善HIBD。本次實(shí)驗(yàn)研究中，我們顯示OGD/R致小鼠HT22細(xì)胞活力顯著降低，LDH漏出及細(xì)胞凋亡率明顯增加的同時(shí)，HDAC11及MerTK表達(dá)升高，凋亡蛋白caspase-12和Bax顯著上調(diào)。HDAC11特異性抑制能明顯增強(qiáng)細(xì)胞活力、降低細(xì)胞凋亡率，顯著下調(diào)caspase-12及Bax，而進(jìn)一步上調(diào)MerTK表達(dá)。有報(bào)道，HIBD發(fā)生后，小膠質(zhì)細(xì)胞通過TREM2上調(diào)吞噬功能介導(dǎo)突觸丟失，但適當(dāng)?shù)耐淌勺饔糜欣诰S持穩(wěn)態(tài)［19］。已有研究表明，局灶性腦缺血后，小膠質(zhì)細(xì)胞MerTK瞬時(shí)上調(diào)促進(jìn)凋亡細(xì)胞的清除維持腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)，而敲除MerTK導(dǎo)致凋亡碎片累積加重細(xì)胞損傷［20］。結(jié)合這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為，OGD/R致小鼠HT22細(xì)胞MerTK表達(dá)增加是一種保護(hù)性機(jī)制，而特異性抑制HDAC11可明顯改善OGD/R致小鼠HT22細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能通過進(jìn)一步上調(diào)MerTK，促進(jìn)凋亡細(xì)胞的清除，減輕凋亡細(xì)胞釋放細(xì)胞因子引發(fā)更激烈的級聯(lián)反應(yīng)。

HIBD發(fā)生時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的活性自由基氧化生物分子破壞細(xì)胞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸，并在HIBD發(fā)生后啟動相關(guān)信號通路，導(dǎo)致細(xì)胞死亡和組織損傷［21］。MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一，SOD和GSH具有協(xié)同抗氧化作用。有研究表明MerTK通路的激活能促進(jìn)小鼠原代巨噬細(xì)胞在氧化應(yīng)激損傷中存活［22］。敲除HDAC11基因調(diào)控HO-1及Nrf-2改善果糖誘導(dǎo)的小鼠心肌細(xì)胞凋亡，減少活性氧產(chǎn)生，改善氧化應(yīng)激損傷［23］。本次實(shí)驗(yàn)研究中，我們還發(fā)現(xiàn)，OGD/R致小鼠HT22細(xì)胞損傷、HDAC11及MerTK表達(dá)上調(diào)的同時(shí)，細(xì)胞MDA含量顯著升高，SOD及GSH顯著降低；抑制HDAC11顯著降低OGD/R處理小鼠HT22細(xì)胞MDA含量，顯著升高SOD及GSH水平。綜合我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及文獻(xiàn)報(bào)道，抑制HDAC11明顯改善OGD/R致小鼠HT22細(xì)胞損傷的機(jī)制，可能還涉及通過進(jìn)一步升高M(jìn)erTK水平，進(jìn)而減輕氧化應(yīng)激損傷。

總之，本實(shí)驗(yàn)研究表明，HDAC11上調(diào)MerTK表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)，參與OGD/R致小鼠HT22細(xì)胞損傷。但是需要進(jìn)一步的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)加以深入闡明，并明確HDAC11對MerTK是直接或間接調(diào)控的作用。