卡格列凈通過SIRT1-FOXO3α信號通路改善小鼠腎小球系膜細(xì)胞自噬功能*

蔡 翔 ， 王美君 ， 徐 芬 ， 梁小奇 ， 梁 華 ， 石 怡 ， 周安東 ， 蔡夢茵 △

（1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝疾病學(xué)科，廣東 廣州 510630；2廣東省糖尿病防治重點(diǎn)實驗室，廣東 廣州 510630）

糖尿病在中國已經(jīng)成為一個重大的公共衛(wèi)生問題，至2017年，中國糖尿病患病率已達(dá)11.2%［1］。糖尿病患者中，大約40%的病人伴有糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease， DKD）。如今，DKD已經(jīng)成為慢性腎臟疾病的首要原因，給家庭和社會帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［2］。

DKD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，遺傳因素、氧化應(yīng)激和炎癥等均參與了DKD的發(fā)生發(fā)展［3］。近年來，越來越多的研究表明自噬功能障礙參與了DKD的發(fā)生發(fā)展，恢復(fù)自噬功能起著有效的腎臟保護(hù)作用［4］。作為治療糖尿病的新型藥物，鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2抑 制 劑（sodium-glucose cotransporter 2 inhibitor，SGLT2i）受到廣泛關(guān)注。SGLT2i在DKD中的腎臟保護(hù)作用顯著，大型隨機(jī)雙盲對照試驗CREDENCE顯示，SGLT2i卡格列凈（canagliflozin）可有效降低2型糖尿病合并腎臟病患者腎衰竭的風(fēng)險［5］。然而，SGLT2i腎臟保護(hù)功能的分子機(jī)制尚未完全明確，既往研究顯示，改善自噬功能可能參與其中［6］，但SGLT2i調(diào)控自噬的具體機(jī)制尚未完全闡明。

沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1（sirtuin1， SIRT1）是一種去乙?；福诰S持葡萄糖代謝穩(wěn)態(tài)和改善胰島素抵抗上發(fā)揮重要作用［7］。SIRT1是自噬的正向調(diào)控蛋白［8］， DKD中，SIRT1表達(dá)下降可導(dǎo)致腎臟細(xì)胞自噬功能的損傷［9］。既往研究證實，SIRT1和叉頭框蛋白O3α（FOXO3α）在DKD中下調(diào)，激活SIRT1進(jìn)而上調(diào)FOXO3α的表達(dá)，可以改善氧化應(yīng)激或促進(jìn)FOXO3α下游自噬基因的轉(zhuǎn)錄，從而改善DKD［10-11］。已有研究顯示，SIRT1的上調(diào)參與了SGLT2i在DKD的腎臟保護(hù)作用［12］，但 SIRT1-FOXO3α信號通路是否參與了卡格列凈對腎臟細(xì)胞的自噬調(diào)節(jié)作用尚待研究。腎臟纖維化是糖尿病腎病主要的病理改變之一，而腎臟纖維化是導(dǎo)致終末期腎功能衰竭的最終共同途徑［13］。既往研究顯示，自噬功能受損促進(jìn)腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展，一方面，在自噬調(diào)控關(guān)鍵蛋白beclin-1敲減的小鼠模型中，自噬功能受損直接導(dǎo)致原代腎臟系膜細(xì)胞I型膠原蛋白表達(dá)升高［14］；另一方面，自噬活性的下降也可以通過減少TGF-β的降解而導(dǎo)致腎小管TGF-β的累積，進(jìn)而促進(jìn)腎臟間質(zhì)纖維化的發(fā)生［15］。在糖尿病腎病患者的腎臟標(biāo)本中，研究人員檢測到腎臟纖維化與自噬功能受損有關(guān)［16］。既往研究觀察到，提高腎臟細(xì)胞的自噬功能可以改善糖尿病腎病腎臟纖維化［17-19］。因此，調(diào)節(jié)自噬功能成為治療腎臟纖維化的靶點(diǎn)之一。

本研究通過體外細(xì)胞實驗，檢測卡格列凈對高糖干預(yù)的小鼠腎小球系膜細(xì)胞（SV40 Mes13）自噬功能和纖維化指標(biāo)的調(diào)節(jié)作用，并探究SIRT1-FOXO3α信號通路是否參與其中。

材料和方法

1 主要試劑和儀器

小鼠SV40 Mes13細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；攜帶SIRT1shRNA的慢病毒購自上海吉凱基因化學(xué)有限公司；自噬雙標(biāo)腺病毒mRFP-GTP-LC3購自上海漢恒生物科技有限公司；D-葡萄糖、DMEM液體培養(yǎng)液和胎牛血清購自Gibco；核蛋白提取試劑盒購自Beyotime；兔抗SIRT1、FOXO3α、p62、微管相關(guān)蛋白1輕鏈 3B（LC3B）及β-actin抗體購自Cell Signaling Technology；兔抗αSMA抗體，COL1A1和COL3A1抗體購自Abcam；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）偶聯(lián)的Ⅱ抗購自Abcam；Trizol購自Invitrogen；PrimeScript? RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和TB Green Premix Ex Taq Ⅱ均購自TaKaRa；所用引物由廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司設(shè)計合成，見表1。垂直電泳-轉(zhuǎn)膜裝置和化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad）。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. Sequences of the primers for RT-qPCR

2 主要方法

2.1 SV40 Mes13細(xì)胞的培養(yǎng)和分組 取小鼠腎小球系膜細(xì)胞SV40 Mes13細(xì)胞種植于6孔板中，分為3組，分別用5.6 mmol/L葡萄糖（NG）、30 mmol/L葡萄糖（HG）［20］及 100 nmol/L卡格列凈［21］和30 mmol/L 葡萄糖共干預(yù)48 h。

2.2 敲減SIRT1的SV40 Mes13細(xì)胞系構(gòu)建 取生長良好的SV40 Mes13細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，細(xì)胞密度達(dá)到30%時，用表達(dá)SIRT1短發(fā)夾RNA （shRNA）序列的慢病毒載體或空載慢病毒作為對照轉(zhuǎn)染SV40 MES13細(xì)胞，并按照說明書在病毒轉(zhuǎn)染12 h后進(jìn)行細(xì)胞換液，換上新鮮培養(yǎng)液。病毒轉(zhuǎn)染72 h后對SV40 Mes13細(xì)胞采用Western blot檢測SIRT1表達(dá)情況，驗證慢病毒干擾效率。確認(rèn)慢病毒轉(zhuǎn)染成功后進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.3SIRT1敲減后SV40 Mes13細(xì)胞培養(yǎng) 慢病毒轉(zhuǎn)染SV40 Mes13細(xì)胞36 h后，將細(xì)胞分別置于NG、HG或HG和100nmol/L卡格列凈共干預(yù)3種條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

2.4 細(xì)胞核漿蛋白分離 用PBS清洗細(xì)胞后，用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，得到的細(xì)胞懸液經(jīng)100×g離心得到細(xì)胞沉淀，按照試劑盒說明書依次加入試劑盒中的細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A和細(xì)胞漿蛋白抽提試劑B，于4 ℃、15 000×g離心得到的上清為漿蛋白，最后向沉淀中加入試劑盒中的細(xì)胞核蛋白抽提試劑，每3 min高速渦旋混勻一次，30 min后于4 ℃、15 000×g離心，得到的上清保存為核蛋白。分別將得到的漿蛋白和核蛋白置于-80 ℃保存，用于后續(xù)Western blot實驗。

2.5 Western blot 用細(xì)胞裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，蛋白上樣量為30 μg。用12.5% PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離蛋白，后采用280mA恒流進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時間為80 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF摸放入5%脫脂奶粉封閉液，室溫封閉1 h后分別加入相應(yīng)的Ⅰ抗：兔抗 LC3B 抗體（1∶500）、兔抗 p62抗體（1∶1 000）、兔抗SIRT1抗體（1∶1 000）、兔抗FOXO3α抗體（1∶1 000）、兔抗 α-SMA 抗體（1∶1 000）、兔抗COL1A1抗體 （1∶1 000）、兔抗 COL3A1抗體（1∶1 000）和兔抗β-actin抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜。然后加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）偶聯(lián)的Ⅱ抗（1∶10 000）常溫孵育60 min后，使用化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)觀察蛋白質(zhì)條帶。

2.6 自噬雙標(biāo)腺病毒mRFP-GFP-LC3轉(zhuǎn)染實驗觀察細(xì)胞內(nèi)自噬流 將慢病毒轉(zhuǎn)染成功后的SV40 Mes13細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞鋪滿30%時采用自噬雙標(biāo)腺病毒mRFP-GFP-LC3轉(zhuǎn)染細(xì)胞，按照說明書觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況并進(jìn)行換液［22］。腺病毒轉(zhuǎn)染36 h后將細(xì)胞分組，分別給予NG、HG或HG和100 nmol/L卡格列凈共干預(yù)48 h。干預(yù)結(jié)束后，用0.4%多聚甲醛固定細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察。每孔取5個視野觀察并拍照。紅、綠熒光合并后可觀察到黃色斑點(diǎn)為自噬體，紅色斑點(diǎn)為自噬溶酶體，記錄每組每個細(xì)胞黃色斑點(diǎn)和紅色斑點(diǎn)的數(shù)目，進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2.7 RNA提取和RT-qPCR檢測 用Trizol提取細(xì)胞RNA。參考試劑盒說明書，將RNA用PrimeScript RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，再使用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，參照試劑盒說明書配制反應(yīng)體系。采用2-△△Ct方法分析計算目的基因的相對表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)并繪制統(tǒng)計分析圖。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，用單因素方差分析檢測多組之間的差異，進(jìn)一步兩兩比較使用Tukey檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 卡格列凈改善高糖干預(yù)下SV40 Mes13細(xì)胞的自噬功能

Western blot結(jié)果顯示，與NG組相比，HG組SV40 Mes13細(xì)胞自噬底物p62蛋白水平上升，LC3B-II/LC3B-I下降（P＜0.05），100 nmol/L卡格列凈與HG共干預(yù)48 h后，SV40 Mes13細(xì)胞p62蛋白水平較HG組下降，LC3B-II/LC3B-I較HG組上升（P＜0.05），見圖1。

Figure 1. Canagliflozin （Cana） improved autophagy in SV40 Mes13 cells under high glucose （HG） condition. Western blot analysis for p62 and LC3B expression in SV40 Mes13 cells treated with normal glucose （NG； 5.6 mmol/L glucose）， HG （30 mmol/L glucose） and HG with Cana （100 nmol/L）. Mean±SD. n=4. *P＜0.05 vs NG group； #P＜0.05 vs HG group.圖1 卡格列凈改善高糖環(huán)境下SV40 Mes13細(xì)胞的自噬水平

2 卡格列凈上調(diào)高糖干預(yù)下SV40 Mes13細(xì)胞中SIRT1與FOXO3α的表達(dá)水平

用Western blot檢測3組細(xì)胞中SIRT1與FOXO3α達(dá)情況。結(jié)果顯示，與NG組相比，HG組中SV40 Mes13細(xì)胞中SIRT1和FOXO3α蛋白水平下降， 100 nmol/L卡格列凈與HG共干預(yù)48 h后，SIRT1與FOXO3α的蛋白水平較HG組上調(diào)（P＜0.05），見圖2。RT-qPCR結(jié)果顯示，與NG組相比，HG組SV40 Mes13細(xì)胞中FOXO3α及FOXO3α下游與自噬靶基因BNIP3水平下降，100 nmol/L卡格列凈與HG共干預(yù)48 h后，F(xiàn)OXO3α和BNIP3 mRNA水平較HG組上調(diào)（P＜0.05），見圖3。

3 卡格列凈上調(diào)SV40 Mes13 細(xì)胞中FOXO3α核轉(zhuǎn)位的作用依賴于SIRT1

用攜帶SIRT1shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染SV40 Mes13細(xì)胞，敲減SIRT1，以進(jìn)一步明確SIRT1在卡格列凈上調(diào)FOXO3α中的作用。Western blot結(jié)果顯示，與空載病毒對照組相比，SIRT1敲減組中SIRT1蛋白表達(dá)量降低大于 75%（P＜0.05），說明敲減SIRT1的SV40 Mes13細(xì)胞系構(gòu)建成功。對照組中，卡格列凈上調(diào)HG干預(yù)下FOXO3α蛋白核漿比及FOXO3α和BNIP3水平（P＜0.05），敲減SIRT1后，卡格列凈上調(diào)HG干預(yù)下FOXO3α蛋白核漿比、FOXO3α和BNIP3的作用消失（P＞0.05），見圖4、5。

4 卡格列凈改善SV40 Mes13細(xì)胞自噬水平的作用依賴于SIRT1

Western blot結(jié)果顯示，SIRT1敲減組，卡格列凈與HG共干預(yù)后，SV40 Mes13細(xì)胞p62蛋白及LC3BII/LC3B-I水平與HG組相比無統(tǒng)計學(xué)差異，卡格列凈改善SV40 Mes13細(xì)胞自噬功能的作用消失（P＞0.05），見圖6。自噬雙標(biāo)腺病毒mRFP-GFP-LC3實驗結(jié)果顯示，空載病毒對照組中，與NG組相比，HG組SV40 Mes13細(xì)胞中黃色斑點(diǎn)增多，紅色斑點(diǎn)相對減少，即自噬溶酶體減少，自噬小體增多；卡格列凈與HG共干預(yù)48 h后，SV40 Mes13細(xì)胞中黃色斑點(diǎn)相對HG組減少，紅色斑點(diǎn)增多，自噬溶酶體增多，自噬流得到改善。而敲減SIRT1后，卡格列凈改善自噬流的作用消失，見圖7。

5 卡格列凈改善SV40 Mes13細(xì)胞纖維化的作用依賴于SIRT1

Figure 2. Canagliflozin （Cana） up-regulated SIRT1 and FOXO3α in SV40 Mes13 cells under high glucose （HG） environment. Western blot analysis for SIRT1 and FOXO3α expression in SV40 Mes13 cells treated with normal glucose（NG）， HG or HG with Cana. Mean±SD. n=4. *P＜0.05 vs NG group； #P＜0.05 vs HG group.圖2 卡格列凈上調(diào)高糖環(huán)境下SV40 Mes13細(xì)胞SIRT1和FOXO3α蛋白表達(dá)

Figure 3. Canagliflozin （Cana） up-regulated the mRNA levels of FOXO3α （A） and BNIP3 （B） in SV40 Mes13 cells under high glucose （HG） environment. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs normal glucose（NG） group； #P＜0.05 vs HG group.圖3 卡格列凈上調(diào)高糖環(huán)境下SV40 Mes13細(xì)胞中FOXO3α及BNIP3的mRNA表達(dá)水平

在空載病毒對照組中，與NG組相比，HG組SV40 Mes13細(xì)胞纖維化指標(biāo)α-SMA、COL1A1和COL3A1蛋白水平上升，α-SMA與COL1A1 mRNA水平上升（P＜0.05）；100 nmol/L卡格列凈與HG共干預(yù)48 h后，α-SMA、COL1A1和COL3A1蛋白水平較HG組下降，α-SMA與COL1A1水平較HG組下降（P＜0.05），SIRT1敲減后，卡格列凈干預(yù)組纖維化指標(biāo)蛋白水平及mRNA水平與HG組相比無顯著差異（P＞0.05），見圖8。

討 論

DKD作為一種糖尿病并發(fā)癥，已成為我國終末期腎病的首要病因。系膜細(xì)胞等腎臟固有細(xì)胞的自噬功能受損參與到了 DKD 的發(fā)生發(fā)展中［4，19，23］。因此，改善腎臟細(xì)胞的自噬功能對延緩DKD進(jìn)展起著十分關(guān)鍵的作用。SGLT2i在DKD中腎臟保護(hù)作用顯著，恢復(fù)腎臟細(xì)胞自噬功能是其可能的腎臟保護(hù)機(jī)制之一［6］。已有多項研究證實SGLT2i促進(jìn)腎臟細(xì)胞自噬。既往研究報道，高糖條件下，達(dá)格列凈激活人腎小管細(xì)胞AMPK，并抑制mTOR，改善細(xì)胞自噬［24］。Lee等［25］觀察到，在STZ誘導(dǎo)的DKD小鼠模型腎臟以及高糖干預(yù)的人腎小管細(xì)胞中，恩格列凈通過激活A(yù)MPK增強(qiáng)細(xì)胞自噬。卡格列凈是首個在腎臟終點(diǎn)研究中被證實腎臟硬終點(diǎn)獲益的降糖藥［5］，但目前關(guān)于其調(diào)節(jié)腎臟細(xì)胞自噬功能的研究尚少。在本研究中，我們觀察到在高糖環(huán)境中，小鼠腎系膜細(xì)胞系SV40 Mes13細(xì)胞自噬功能受損，而卡格列凈可以促進(jìn)SV40 Mes13細(xì)胞自噬。

Figure 4. Canagliflozin （Cana） up-regulated FOXO3α nuclear translocation in SV40 Mes13 cells in a SIRT1-dependent manner.Western blot analysis of SIRT1， nuclear FOXO3α and cytoplasmic FOXO3α in SV40 MES13 cells transfected with lentiviral SIRT1 shRNA or scrambled shRNA and treated with normal glucose （NG）， high glucose （HG） and HG with Cana.Mean± SD. n=3. *P＜0.05 vs NG group； #P＜0.05 vs HG group.圖4 卡格列凈促進(jìn)SV40 Mes13細(xì)胞FOXO3α核轉(zhuǎn)位的作用依賴于SIRT1

Figure 5. Canagliflozin （Cana） up-regulated the mRNA expression of FOXO3α （A） and BNIP3 （B） in a SIRT1-dependent manner.Mean±SD. n=4. *P＜0.05 vs normal glucose （NG） group； #P＜0.05 vs high glucose （HG） group.圖5 卡格列凈上調(diào)SV40 Mes13細(xì)胞FOXO3α和BNIP3的作用依賴于SIRT1

Figure 6. The effect of canagliflozin（Cana） on improving autophagy in SV40 Mes13 cells was dependent on SIRT1. Western blot analysis of p62 and LC3B in SV40 Mes13 cells transfected with lentiviral SIRT1 shRNA or scrambled shRNA and treated with normal glucose （NG）， high glucose（HG） and HG with canagliflozin. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs NG group； #P＜0.05 vs HG group.圖6 卡格列凈改善SV40 Mes13細(xì)胞自噬水平的作用依賴于SIRT1

Figure 7. Changes of autophagy in SV40 Mes13 cells transfected with mRFP-GFP-LC3. The autophagic flux was observed by mRFPGFP-LC3（the yellow dots indicate autophagosomes， while the red dots indicate autophagolysosomes in merged images）.Numbers of autophagosomes （yellow dots in merged images） per cell and numbers of autophagolysosomes （red dots in merged images） per cell were shown. Mean±SD. n=5. *P＜0.05 vs normal glucose（NG） group； #P＜0.05 vs high glucose（HG） group.圖7 mRFP-GFP-LC3腺病毒轉(zhuǎn)染后SV40 Mes13細(xì)胞內(nèi)自噬流情況的變化

SGLT2i促進(jìn)腎臟細(xì)胞自噬的分子機(jī)制研究尚未完全闡明，目前已有的研究主要集中于AMPK/mTOR信號通路［6，24-25］，而與 SIRT1有關(guān)的自噬信號通路少有報道。既往研究結(jié)果顯示，在DKD小鼠模型中，腎臟組織SIRT1表達(dá)下調(diào)［26-29］。本研究觀察到，高糖環(huán)境下，小鼠SV40 Mes13細(xì)胞SIRT1的表達(dá)下降。SIRT1在DKD中起腎臟保護(hù)作用，可以通過去乙?；揎椬允傻鞍状龠M(jìn)腎臟細(xì)胞自噬，延緩DKD［8-9］。Packer［30］總結(jié)，SGLT2i通過促進(jìn)葡萄糖排泄，模擬機(jī)體營養(yǎng)剝奪的生理狀態(tài)，上調(diào)腎臟的SIRT1表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，高糖環(huán)境中，卡格列凈恢復(fù)SV40 Mes13細(xì)胞SIRT1的表達(dá)水平。研究顯示，在DKD大鼠足細(xì)胞中，SGLT2i上調(diào)SIRT1，同時增強(qiáng)足細(xì)胞自噬，緩解足細(xì)胞損傷［31］。但該研究并未通過敲除大鼠腎臟SIRT1來進(jìn)一步明確SIRT1是否介導(dǎo)了SGLT2i改善足細(xì)胞自噬的作用。本研究觀察到，高糖環(huán)境中，SIRT1被敲減后，卡格列凈改善SV40 Mes13細(xì)胞的自噬功能的作用消失。以上結(jié)果說明，SIRT1介導(dǎo)了卡格列凈促進(jìn)SV40 Mes13細(xì)胞自噬的作用。

除了直接乙酰化調(diào)節(jié)自噬蛋白，SIRT1還可以通過去乙酰化修飾轉(zhuǎn)錄因子FOXO3α，激活FOXO3α的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)FOXO3α下游自噬靶基因的表達(dá)［32］。既往研究顯示，在DKD小鼠腎臟足細(xì)胞中，SIRT1-FOXO3α通路受抑制，P2Y2R敲減后，SIRT1和FOXO3α表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)OXO3α的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，足細(xì)胞自噬功能改善［11］。本研究觀察到，在小鼠腎系膜細(xì)胞系SV40 Mes13細(xì)胞中，高糖環(huán)境中，隨著SIRT1表達(dá)下降，F(xiàn)OXO3α的表達(dá)下降，核轉(zhuǎn)位減少，Mammucari等［33］報道，F(xiàn)OXO3α主要通過上調(diào)Bnip3改善自噬，因此，Bnip3可以作為反映FOXO3α轉(zhuǎn)錄活性的指標(biāo)之一。并且，BNIP3在DKD中起腎臟保護(hù)作用。BNIP3的下降與DKD患者微量蛋白尿的發(fā)生有關(guān)［34］。通過上調(diào)BNIP3，可以促進(jìn)自噬，改善DKD腎臟纖維化［35］。本研究觀察到，在SV40 Mes13細(xì)胞中，高糖環(huán)境中，隨著SIRT1表達(dá)下降，F(xiàn)OXO3α的表達(dá)下降，核轉(zhuǎn)位減少，下游Bnip3下降；卡格列凈增強(qiáng)FOXO3α核轉(zhuǎn)位的同時上調(diào)Bnip3；SIRT1被敲減后，卡格列凈上述作用消失。以上結(jié)果說明，在SV40 Mes13細(xì)胞中，高糖抑制SIRT1-FOXO3α通路，而卡格列凈激活SIRT1-FOXO3α通路，進(jìn)而促進(jìn)其下游自噬基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞自噬。

Figure 8. The effect of canagliflozin（Cana） on fibrosis in SV40 Mes13 cells was dependent on SIRT1. A： Western blot analysis of COL1A1， COL3A1 and α-SMA in SV40 Mes13 cells transfected with lentiviral SIRT1 shRNA or scrambled shRNA and treated with normal glucose （NG）， high glucose （HG） and HG with Cana； B and C： the mRNA levels of α-SMA and COL1A1 in SV40 Mes13 cells treated with NG， HG and HG with Cana transfected with lentiviral SIRT1 shRNA or scrambled shRNA. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs NG group； #P＜0.05 vs HG group.圖8 卡格列凈改善SV40 Mes13細(xì)胞纖維化的作用依賴于SIRT1

系膜細(xì)胞自噬功能受損是小鼠腎臟纖維化的原因之一。Kim等［14］觀察到，抑制系膜細(xì)胞自噬功能導(dǎo)致胞外膠原蛋白I的沉積，而誘導(dǎo)自噬可促進(jìn)膠原蛋白I的降解，從而改善腎臟纖維化。既往研究顯示，在DKD體內(nèi)及體外模型中，增強(qiáng)腎系膜細(xì)胞自噬功能有利于改善其纖維化［23，36］。Chen 等［23］觀察到，在STZ誘導(dǎo)的DKD小鼠模型及體外高糖培養(yǎng)的小鼠腎系膜細(xì)胞中，lncRNA SOX2OT通過抑制Akt/mTOR促進(jìn)腎系膜細(xì)胞自噬，改善系膜細(xì)胞的過度增殖和纖維化，延緩DKD的進(jìn)展。另有研究結(jié)果顯示，在高糖培養(yǎng)的SV40 Mes13細(xì)胞中，F(xiàn)BW7通過抑制mTOR改善細(xì)胞自噬，從而改善SV40 Mes13細(xì)胞炎癥和纖維化［36］。在腎小管細(xì)胞中，恩格列凈通過改善高糖環(huán)境下細(xì)胞的自噬功能，下調(diào)纖維化指標(biāo)［37］。本研究結(jié)果顯示，在小鼠腎系膜細(xì)胞系SV40 Mes13細(xì)胞中，卡格列凈改善高糖環(huán)境下自噬功能，同時下調(diào)纖維化指標(biāo)α-SMA、COL1A1和COL3A1的表達(dá)。SIRT1被敲減后，卡格列凈改善SV40 Mes13細(xì)胞自噬功能和改善纖維化的作用同時消失。因此，通過改善自噬可能是卡格列凈改善SV40 Mes13細(xì)胞纖維化的機(jī)制之一。

綜上所述，本研究顯示，高糖抑制SV40 Mes13細(xì)胞SIRT1-FOXO3α通路，導(dǎo)致細(xì)胞自噬功能受損及細(xì)胞纖維化。高糖環(huán)境下，卡格列凈可通過激活SIRT1-FOXO3α通路，增強(qiáng)SV40 Mes13細(xì)胞自噬，并改善SV40 Mes13細(xì)胞纖維化。本研究為進(jìn)一步理解卡格列凈對腎臟系膜細(xì)胞的保護(hù)作用提供參考資料。由于本研究僅在小鼠腎系膜細(xì)胞系中進(jìn)行實驗，此后還需在其他不同類型的腎臟細(xì)胞和DKD動物模型中進(jìn)一步探索卡格列凈對SIRT1-FOXO3α通路的影響。