Al0.4CoCrCuFeNi高熵合金在生活環(huán)境中的抗菌性能

肖凌云，武文韜，周沂霖，閆姿霓，周恩澤，孫明月，徐大可，王福會(huì)

表面功能化

Al0.4CoCrCuFeNi高熵合金在生活環(huán)境中的抗菌性能

肖凌云，武文韜，周沂霖，閆姿霓，周恩澤，孫明月，徐大可，王福會(huì)

（東北大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，沈陽(yáng) 110819）

利用高熵合金多主元的設(shè)計(jì)思想，添加高含量的銅制備出具有優(yōu)良機(jī)械性能的新型含銅抗菌高熵合金（Antibacterial High-entropy Alloy），探究其在多種復(fù)雜生活環(huán)境中服役時(shí)的抗菌性能。通過(guò)XRD分析高熵合金的物相組成。通過(guò)拉伸試驗(yàn)研究該高熵合金的機(jī)械性能。采集多種生活環(huán)境下的微生物群落，通過(guò)平板涂布、場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)菌生長(zhǎng)與成膜形貌，對(duì)比分析高熵合金的抗菌性能。通過(guò)基因測(cè)序，經(jīng)由OTU聚類分析與物種分類學(xué)分析等研究手段，統(tǒng)計(jì)和分析菌落結(jié)構(gòu)與物種多樣性。通過(guò)活性氧簇分析，探究高熵合金的殺菌機(jī)理。Al0.4CoCrCuFeNi高熵合金的屈服強(qiáng)度為(308±10) MPa，高于傳統(tǒng)抗菌不銹鋼材料。通過(guò)抗菌試驗(yàn)結(jié)果得出，高熵合金的抗菌率達(dá)到99.99%以上。通過(guò)掃描電鏡分析和活死染色結(jié)果，發(fā)現(xiàn)AHEA表面菌落數(shù)量顯著減少且?guī)缀鯖]有任何活的微生物。此外，通過(guò)測(cè)序結(jié)果可以看出，易黏附于普通金屬樣品表面的優(yōu)勢(shì)菌種多為有害致病菌，包含細(xì)菌和真菌，而AHEA對(duì)它們有著良好的抑制作用。AHEA可以作為一種高效的抗菌材料，不僅能防止細(xì)菌在金屬材料表面繁殖生長(zhǎng)，還能有效抑制真菌生長(zhǎng)和生物被膜的形成，綜合性能遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)抗菌合金。

抗菌材料；高熵合金；抗細(xì)菌；抗真菌；生物被膜；生活環(huán)境

微生物常見于人們的生產(chǎn)生活中，對(duì)人類的健康生存環(huán)境等方面均產(chǎn)生了重要的影響。一方面，微生物對(duì)人類保健具有積極作用，例如生存在人類腸道中的雙歧桿菌，對(duì)病人機(jī)體炎癥和免疫的調(diào)節(jié)都具有積極影響[1]。另一方面，微生物對(duì)人體的健康也有危害，例如在生產(chǎn)加工運(yùn)輸過(guò)程中的食物由于保存不當(dāng)，將極易滋生有害病菌；在醫(yī)院內(nèi)常見的肺炎克雷伯菌，感染人類后可引起較嚴(yán)重的下呼吸道感染甚至死亡[2]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的報(bào)道，全球每年至少有1 600萬(wàn)人因細(xì)菌傳染導(dǎo)致身患疾病而死亡[3]。此外，2019年出現(xiàn)的新型冠狀病毒也迅速席卷全球，至今國(guó)內(nèi)仍時(shí)有接觸感染發(fā)生。在這場(chǎng)全民抗疫的戰(zhàn)斗中，人們對(duì)生活中公共接觸物品殺菌消毒的重視達(dá)到了空前的高度。相對(duì)于病毒，各種致病菌更容易長(zhǎng)期附著在生活環(huán)境中的金屬制品上，其形成的生物被膜可有效抵御外部環(huán)境的變化[4-6]。生活中常用的傳統(tǒng)殺菌方式，如噴灑75%酒精，難以對(duì)真菌生物被膜起到有效的殺滅作用，導(dǎo)致一些常見的真菌感染疾病，例如腳氣、花斑癬等，容易反復(fù)發(fā)作，難以根除[7]。因此，如何避免諸如門把手、電梯扶手、電梯按鈕等這些頻繁接觸的金屬制品成為傳播細(xì)菌的媒介，已經(jīng)成為了當(dāng)下的研究熱點(diǎn)問(wèn)題之一。

銅元素有著天然良好的抗菌性能，為了使普通合金也具有抑菌的能力，近些年研究者們已經(jīng)將具有抗菌功能的銅加入到這些合金中，所得材料可通過(guò)直接接觸或釋放銅離子、亞銅離子殺死附著細(xì)菌[8-9]。然而對(duì)于現(xiàn)有的抗菌不銹鋼合金，如304含銅不銹鋼等，在保證不犧牲材料本身機(jī)械性能的同時(shí)具有良好的抗菌效果，材料中所添加的銅含量都存在極限值（不銹鋼中cu質(zhì)量分?jǐn)?shù)通常低于5%）[10]，但較低的銅含量會(huì)顯著影響合金材料的抗菌效果。此外，抗菌不銹鋼材料僅是通過(guò)添加銅或銀元素對(duì)合金成分進(jìn)行優(yōu)化，難以集中各合金元素的優(yōu)異特性，限制了其發(fā)展應(yīng)用。而高熵合金通常包含5～13種組元，且每一組元的含量介于5%～35%之間，按照等原子比或近于等原子比進(jìn)行合金化形成多主元合金[11]。該多主元合金的設(shè)計(jì)理念可為多功能金屬材料的開發(fā)設(shè)計(jì)帶來(lái)一個(gè)全新的發(fā)展空間。通過(guò)優(yōu)化高熵合金的組成成分，可以使其同時(shí)擁有多種優(yōu)異特性，如高強(qiáng)度、高硬度、耐腐蝕、耐磨損等，因此高熵合金具備很高的研究?jī)r(jià)值與應(yīng)用前景[12-14]。因此，利用具有天然抗菌性的銅元素作為抗菌高熵合金的主元素之一，可以制備出兼具優(yōu)良機(jī)械性能和抗菌性能的新型抗菌合金。但目前關(guān)于含銅高熵合金的抗菌性能研究較少，起步較晚。2016年，wu等[15]研究了CuCoCrFeNi高熵合金對(duì)大腸桿菌的抗菌性能，發(fā)現(xiàn)其抗菌率可達(dá)99.5%。2022年，Gao等[16]進(jìn)一步利用3D打印技術(shù)制備得到具有優(yōu)異抗菌性能的CoCrCuFeNi高熵合金，其對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌效果分別達(dá)到98%和99%以上。此外，Ren等[17]的研究表明，銅的添加可以在不犧牲機(jī)械性能的情況下能提高Co0.4FeCr0.9Cu抗大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌性能。關(guān)于Al0.4CoCrCuFeNi含銅高熵合金的研究結(jié)果也表明，該合金材料對(duì)海洋銅綠假單胞菌、海洋越南芽孢桿菌、多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌和金黃色葡萄球菌均具有十分優(yōu)異的抑菌效果[18-19]。但是，單一菌種并不能完全反映該合金在實(shí)際復(fù)雜菌群環(huán)境中的廣譜抗菌性以及高效性。目前市場(chǎng)上不僅缺少有效可用的抗菌金屬材料，而且對(duì)抗菌金屬材料在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中的抗菌效果知之甚少。

因此，為評(píng)定Al0.4CoCrCuFeNi抗菌高熵合金（Antibacterial High-entropy Alloys，AHEA）對(duì)實(shí)際生活環(huán)境中菌群的抗菌性能，本試驗(yàn)收集來(lái)自3種不同生活環(huán)境中的金屬制品表面的混菌，并采用304不銹鋼（304 SS）、含銅304不銹鋼（304 Cu-SS，4.1%Cu）和純銅（Cu）樣品作為對(duì)照，研究Al0.4CoCrCuFeNi高熵合金對(duì)環(huán)境微生物的實(shí)際抗菌效果。

1 試驗(yàn)

1.1 抗菌高熵合金制備

Al0.4CoCrCuFeNi抗菌高熵合金的制備均選用純度為99%以上的工業(yè)級(jí)純?cè)希ˋl、Co、Cr、Cu、Fe和Ni）。原料依次經(jīng)過(guò)稱量配比、混勻熔煉，最終澆鑄得到合金鑄錠，具體熔煉步驟如下。

首先按各合金元素物質(zhì)的量比進(jìn)行稱量配重，稱量出總質(zhì)量約為2.5 kg的合金料。合金采用真空電弧爐熔煉。熔配合金時(shí)，按照Al原料在下，Co、Cr、Cu、Fe和Ni原料均勻混合在上的順序放入水冷銅坩堝，真空電弧爐抽真空至3×10?3Pa，反沖氬氣至0.05 Pa。合金熔煉前先熔煉Ti合金錠，吸收真空電弧爐內(nèi)殘余氧氣。熔煉合金時(shí)，需要進(jìn)行翻面熔煉，并且至少熔煉6遍，每遍熔煉1～2 min，獲得合金液并澆鑄成鑄態(tài)的Al0.4CoCrCuFeNi高熵合金。

1.2 機(jī)械性能測(cè)試

利用Instron 5569測(cè)試機(jī)對(duì)合金試樣進(jìn)行拉伸試驗(yàn)。棒狀拉伸樣的標(biāo)距長(zhǎng)度為33 mm，直徑為6 mm，以1×10?3s?1的恒應(yīng)變速率進(jìn)行室溫拉伸。拉伸試樣側(cè)面逐級(jí)打磨至1000#，以消除線切割痕跡對(duì)拉伸試驗(yàn)產(chǎn)生的影響。

1.3 菌樣采集

使用經(jīng)滅菌鍋滅菌的醫(yī)用棉簽，將其置于裝有PBS緩沖液（10.9 g/L）的50 mL離心管中，分別隨機(jī)選擇ATM機(jī)金屬按鍵（a）、實(shí)驗(yàn)室金屬門把手（b）、皮膚科門診室門把手（c）3個(gè)環(huán)境刮取采集菌種。利用LB液體培養(yǎng)基對(duì)采集得到的菌種進(jìn)行富集培養(yǎng)，在37 ℃搖床中培養(yǎng)12 h備用。其中，LB液體培養(yǎng)基成分為1 000 mL去離子水、10 g 氯化鈉、10 g 胰蛋白胨和5 g 酵母提取物。

1.4 抗菌測(cè)試

將AHEA對(duì)于生活環(huán)境混菌的抗菌特性與304 SS、304 Cu-SS、Cu進(jìn)行比較，其中AHEA、304 Cu-SS、Cu為抗菌樣，304 SS為對(duì)照樣。表1為304 SS和304 Cu-SS的元素組成及其含量。圖1為抗菌測(cè)試試驗(yàn)的示意圖，具體過(guò)程為：取出搖床中的菌樣，使用分光光度計(jì)測(cè)定菌液OD值，調(diào)整至OD600約為0.5，此時(shí)菌液濃度約為108CFU/mL；用含0.1 g/L酵母提取物的PBS緩沖液作為稀釋劑和培養(yǎng)液，將菌液稀釋到105CFU/mL，采用覆膜法將稀釋后的菌液（100 μL）接種到4種金屬試樣表面（樣品表面積均為1 cm2），將接種3種菌群環(huán)境下的試樣放在37 ℃恒溫箱中分別培養(yǎng)1、3、6 h，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

表1 304 SS和304 Cu-SS的化學(xué)元素成分及含量

之后將AHEA和Cu樣品（表面均含100 μL菌液）輕輕取出置于裝有900 μL PBS緩沖液的離心管內(nèi)，充分震蕩搖勻后，取其中100 μL含菌液（即稀釋10倍后）進(jìn)行平板涂布。此外，對(duì)304 SS和304 Cu-SS的覆膜液再次稀釋10倍接種于LB固體培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，拍攝培養(yǎng)基中菌落的照片并統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，每個(gè)試驗(yàn)至少進(jìn)行3次。抗菌率由式（1）計(jì)算得到。

式中：為抗菌率；為對(duì)照樣活菌數(shù)（CFU/mL）；為抗菌樣活菌數(shù)（CFU/mL）。

1.5 掃描電鏡分析

通過(guò)場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（FESEM，Ultra- Plus，Zeiss，Germany）觀察經(jīng)前述相同方法覆膜6 h后的樣品。首先，將樣品在去離子水中清洗，輕輕洗去表面的覆膜液，將樣品連同附著的生物被膜一同放入4%戊二醛溶液中，在4 ℃冰箱中進(jìn)行2 h的固定處理。戊二醛是一種滲透快的雙交聯(lián)劑，交聯(lián)能力強(qiáng)，可以將細(xì)胞中的蛋白質(zhì)固定且不破壞細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)[19]。接下來(lái)，分別以50%、60%、70%、80%、90%、95%和100%的乙醇溶液逐級(jí)梯度脫水，每個(gè)濃度梯度下放置的時(shí)間為7 min。100%乙醇脫水結(jié)束后將樣品取出吹干。最后，使用導(dǎo)電膠將樣品固定于鋁板表面，利用離子濺射儀對(duì)樣品進(jìn)行噴金處理，以確保樣品表面有良好的導(dǎo)電性，然后再在FESEM高倍數(shù)目鏡下進(jìn)行形貌觀察。同時(shí)利用掃描電鏡對(duì)本試驗(yàn)中的高熵合金表面進(jìn)行金相觀察。

圖1 抗菌試驗(yàn)流程圖

1.6 活死細(xì)胞染色

采用與抗菌測(cè)試中同樣的方法在37 ℃覆膜6 h后，使用LIVE/DEAD?（Invitrogen，USA）細(xì)菌活死染色試劑盒，在暗室（23 ℃）中對(duì)樣品進(jìn)行染色。綠色熒光SYTO-9染料染色活細(xì)胞。紅色熒光碘化丙啶（PI）染料染色死細(xì)胞。著色后使用激光共聚焦顯微鏡（CLSM）（C2 Plus，Nikon，Japan）以3-D模式觀察細(xì)菌生長(zhǎng)與生物被膜厚度[21-22]。

1.7 基因測(cè)序

分別對(duì)細(xì)菌液體樣品和在304 SS試樣表面培養(yǎng)6 h后的生物被膜樣品，進(jìn)行16S基因測(cè)序。根據(jù)OTU聚類（ASV去噪）分析結(jié)果，檢測(cè)OTU（ASV）多樣性指數(shù)和測(cè)序深度；根據(jù)分類信息，對(duì)每個(gè)分類級(jí)別的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 活性氧簇分析

選用實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌，通過(guò)覆膜1、3、6 h后，使用活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）檢測(cè)試劑盒（碧云天，中國(guó)），在暗室（23 ℃）中對(duì)樣品進(jìn)行染色30 min。用激光共聚焦顯微鏡（CLSM）觀察AHEA、304 SS、304 Cu-SS、Cu 4種金屬表面ROS的產(chǎn)量，即綠色熒光強(qiáng)度。

1.9 XRD分析

利用X射線衍射儀（XRD，Shimadzu XRD-6000）進(jìn)行物相組成分析，采用Cu靶，掃描速度為4 (°)/min，2掃描范圍為20°～100°。

2 結(jié)果及分析

2.1 材料組織與機(jī)械性能分析

通過(guò)圖2可以明顯看出，304不銹鋼和304 Cu-SS均為典型的奧氏體結(jié)構(gòu)，內(nèi)部存在少量的馬氏體。但在添加銅的不銹鋼樣品中沒有檢測(cè)到富銅相的存在，這可能是因?yàn)閵W氏體相和析出的富銅相結(jié)構(gòu)相似，均為面心立方結(jié)構(gòu)（FCC），因此富銅相衍射峰與奧氏體相衍射峰接近被覆蓋，也表明了此時(shí)含銅不銹鋼銅含量較少，形成的富銅相體積分?jǐn)?shù)難以檢測(cè)得到。純銅是FCC結(jié)構(gòu)，其衍射峰為(111)、(200)、(220)，不存在其他衍射峰，表明試驗(yàn)所用銅樣品的純度較高，雜質(zhì)較少。XRD結(jié)果也表明，高熵合金主要是FCC結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步利用SEM觀察高熵合金的金相組織可發(fā)現(xiàn)，該抗菌高熵合金具有粗枝晶區(qū)域（）和枝晶間結(jié)構(gòu)（）。通過(guò)能譜儀分析枝晶和枝晶間的化學(xué)成分，結(jié)果見表2。從化學(xué)元素分布結(jié)果可以看出，該合金的枝晶區(qū)富含Co、Cr、Fe和Ni元素，枝晶間富含Cu元素，表明合金材料表面彌散均勻分布著大量的Cu元素，可能有利于增強(qiáng)材料的抗菌能力。

圖2 幾種金屬材料的組織結(jié)構(gòu)分析

表2 抗菌高熵合金的化學(xué)元素成分及含量

經(jīng)測(cè)試，未經(jīng)過(guò)軋制變形或熱處理等增強(qiáng)手段，鑄態(tài)AHEA的屈服強(qiáng)度仍優(yōu)于304不銹鋼（圖3）。鑄態(tài)AHEA的屈服強(qiáng)度為(308±10) MPa，高于304不銹鋼(278±8) MPa以及304 Cu-SS (225±8) MPa的屈服強(qiáng)度。純銅的屈服強(qiáng)度同樣遠(yuǎn)低于Al0.4CoCrCuFeNi高熵合金材料。Xi等[23-24]報(bào)道的316/317 Cu-SS的屈服強(qiáng)度約為230 MPa，也低于該鑄態(tài)AHEA，表明該高熵合金比傳統(tǒng)抗菌不銹鋼材料具有更優(yōu)異的屈服強(qiáng)度。

2.2 抗菌性能分析

采用微生物平板計(jì)數(shù)法（圖1）評(píng)估AHEA、304 Cu-SS和Cu的抗菌性能，抗菌結(jié)果如圖4所示?？梢钥吹剑鳝h(huán)境的304 SS與304 Cu-SS樣品的培養(yǎng)基上均長(zhǎng)出了較多菌株（稀釋100倍）。其中，ATM機(jī)金屬按鍵環(huán)境（a）中的菌在與金屬接觸初期（1 h）生長(zhǎng)緩慢，隨接觸時(shí)間的延長(zhǎng)，微生物開始迅速繁殖，培養(yǎng)6 h后樣品表面黏附菌株數(shù)量可達(dá)到約50 000 CFU/cm2；實(shí)驗(yàn)室金屬門把手環(huán)境（b）中，開始培養(yǎng)時(shí)（1、3 h）僅有少量菌株，而與金屬接觸6 h后，在培養(yǎng)基上可以觀察到大量成蛛網(wǎng)狀的真菌（直徑 2～3 cm），但具體真菌種類還需通過(guò)16s基因測(cè)序進(jìn)行進(jìn)一步鑒定分析；醫(yī)院皮膚科門診室門把手環(huán)境（c）所示結(jié)果與（a）中類似，在培養(yǎng)6 h后存在有大量微生物。不過(guò)經(jīng)過(guò)試驗(yàn)對(duì)比可以看出，在2種金屬表面培養(yǎng)6 h后存活菌數(shù)量相差不大，304 Cu-SS雖然在普通304 SS的基礎(chǔ)上添加了一定量的銅元素，但并沒有表現(xiàn)出良好的抗菌性能。

圖3 金屬材料的應(yīng)力-應(yīng)變曲線

圖4 不同環(huán)境下各金屬抗菌性能測(cè)試結(jié)果

而觀察AHEA的抗菌效果，可以發(fā)現(xiàn)在剛開始進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)（1、3 h），部分樣品稀釋10倍涂板后上雖然也顯示生長(zhǎng)出少量菌落，但數(shù)量相較于304 SS與304 Cu-SS上的已有顯著降低；而當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間到達(dá)6 h后，培養(yǎng)基上的菌落幾乎完全消失。與此同時(shí)，Cu中的菌落數(shù)量極少或者并沒有觀察到菌落。由抗菌率的計(jì)算公式結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果可以得出，37 ℃時(shí)AHEA對(duì)于在前述3種環(huán)境中所采集到的環(huán)境混菌大約只需要3～6 h，便可以達(dá)到99.99%的殺菌率。這些結(jié)果表明，AHEA可以作為一種高效的抗菌材料在實(shí)際環(huán)境中進(jìn)行應(yīng)用。

2.3 成膜性能分析

2.3.1 微生物形態(tài)分析

利用FESEM進(jìn)一步研究4種金屬對(duì)固著微生物細(xì)胞的影響。如圖5所示，在覆膜6 h后，304 SS表面存在大量形態(tài)完好的微生物群落，表明微生物的生長(zhǎng)較好；304 Cu-SS的表面形貌與304 SS相差無(wú)幾，表明304 Cu-SS并未表達(dá)出良好的抗菌性能；而相較于304 SS和304 Cu-SS，AHEA表面已經(jīng)幾乎沒有任何附著的生物被膜，AHEA對(duì)于附著生物被膜的抑制幾乎達(dá)到了100%；Cu表面可以觀察到大量析出物，這可能與Cu容易被氧化有關(guān)，使得對(duì)Cu表面的觀察難度被進(jìn)一步提高，也難以觀察到Cu表面有明顯附著的生物被膜，但結(jié)合平板數(shù)據(jù)可知Cu樣品表面并不存在活細(xì)菌。細(xì)胞染色技術(shù)將有利于進(jìn)一步確定Cu以及其他合金表面的細(xì)菌黏附情況和活死狀態(tài)。這些結(jié)果說(shuō)明AHEA在抑制生物被膜附著上的性能要顯著優(yōu)于304 SS和304 Cu-SS。相關(guān)研究表明，AHEA合金的抗菌性能來(lái)自內(nèi)部銅相的直接接觸和釋放的銅離子，實(shí)現(xiàn)了對(duì)浮游和固著微生物的抑制和殺滅[25-26]。而304 Cu-SS雖然也會(huì)析出一定量的銅離子，但是并不足以對(duì)生物被膜形成起到有效的抑制效果。

圖5 覆膜6 h后不同金屬試樣表面的微生物群落形貌圖

2.3.2 活死細(xì)胞染色

使用活死細(xì)胞染色技術(shù)觀察6 h后4種不同類型金屬上的混菌生長(zhǎng)狀態(tài)。如圖6所示，觀察結(jié)果與平板計(jì)數(shù)所展現(xiàn)出的規(guī)律相似。在Cu樣品上幾乎看不到任何活細(xì)菌和死細(xì)菌的存在，結(jié)合平板涂板結(jié)果，表明Cu能快速有效殺滅細(xì)菌以防止其黏附。在304 SS樣品上仍能觀察到大量存活的厚生物被膜，平均厚度為(56.2±2.5) μm；而在AHEA表面觀察到的生物被膜幾乎都已經(jīng)被殺死，并且其平均厚度為(29.5± 0.5) μm，約為304 SS表面生物被膜厚度的一半；304 Cu-SS表面生物被膜的平均厚度為(42.8±1.0) μm，同樣遠(yuǎn)高于AHEA。這一結(jié)果表明，AHEA對(duì)表面形成的生物被膜的抑制能力和殺滅效率都要顯著高于304 Cu-SS。

2.4 基因測(cè)序

在前文中已經(jīng)證明了Al0.4CoCrCuFeNi新型含銅抗菌高熵合金對(duì)在3個(gè)環(huán)境中所采集到的混菌有著卓越的抗菌效果，但是由于尚不確定采集到的混菌的組成成分，所以無(wú)法判斷AHEA究竟對(duì)哪種或哪幾種菌甚至是真菌都有著良好抗菌效果，所以對(duì)混菌樣品進(jìn)行了16S rDNA測(cè)序分析，通過(guò)得到環(huán)境中各物種的相對(duì)豐度來(lái)說(shuō)明AHEA抗菌性能的積極意義。

2.4.1 細(xì)菌

對(duì)來(lái)自前述3種環(huán)境上的混菌樣品進(jìn)行16S rDNA測(cè)序分析，得到優(yōu)勢(shì)細(xì)菌物種的相對(duì)豐度如表3所示。圖7為表3所對(duì)應(yīng)的柱狀圖。樣本中豐度占比小于1%的物種歸為Others，其余的作為優(yōu)勢(shì)物種進(jìn)行分析。

從試驗(yàn)數(shù)據(jù)中可以觀察到，在ATM機(jī)金屬按鍵上采集到的混菌樣品的菌液（a）中豐度最高的為芽孢桿菌屬（）；而在304 SS樣品表面培養(yǎng) 6 h后（d），克雷伯氏菌屬（）成為了生物被膜中的優(yōu)勢(shì)菌種。多數(shù)芽孢桿菌屬細(xì)菌是無(wú)害的，只有少數(shù)對(duì)人和動(dòng)物具有致病性，例如蠟樣芽孢桿菌可引起食物中毒，臨床表現(xiàn)為嘔吐或腹瀉[27]；而當(dāng)人感染克雷伯氏菌屬后，則會(huì)引起較嚴(yán)重的下呼吸道感染甚至死亡[2]。更為嚴(yán)重的是，近年來(lái)由于抗菌藥物的濫用，使得克雷伯氏菌對(duì)常用抗菌藥物呈現(xiàn)出嚴(yán)重的多重耐藥性，常常使臨床抗感染治療陷入困境，對(duì)臨床和公共衛(wèi)生健康產(chǎn)生巨大威脅[28]。

圖6 覆膜6 h后不同金屬試樣表面的微生物群落活死染色圖

表3 不同環(huán)境下的細(xì)菌組成和豐度

notes: 16S rDNA sequencing was performed after centrifugation and enrichment of bacterial solution and biofilm from three environments, including (a) ATM metal key bacterial solution, (b) laboratory metal door handle bacterial solution, (c) dermatology outpatient door handle bacterial solution, (d) ATM metal key biofilm, (e) laboratory metal door handle biofilm and (f) dermatology outpatient door handle biofilm.

圖7 表3所對(duì)應(yīng)的柱狀圖

在實(shí)驗(yàn)室金屬門把手上采集到的混菌樣品的菌液（b）中豐度最高的是克雷伯氏菌屬和芽孢桿菌屬，此外還有少量的葡萄球菌屬（）和魏斯氏菌屬（）；經(jīng)過(guò)6 h的培養(yǎng)后（e），葡萄球菌屬成為生物被膜中的優(yōu)勢(shì)菌種。少數(shù)葡萄球菌屬可導(dǎo)致疾病，是最常見的化膿性球菌，也是醫(yī)院交叉感染的重要來(lái)源之一，可以對(duì)人類和畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的危害[29]。尤其是最廣為人知的金黃色葡萄球菌，可以引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等局部化膿感染，同時(shí)也可以引起敗血癥甚至是膿毒癥等全身感染[30]。魏斯氏菌屬則沒有那么嚴(yán)重的致病性，主要用途為發(fā)酵以及生物研究[31]。

在皮膚科門診室門把手上所采集的樣品的結(jié)果與其他2種環(huán)境類似，混菌菌液（c）中的優(yōu)勢(shì)菌種為葡萄球菌屬；培養(yǎng)6 h（f）后生物被膜中的優(yōu)勢(shì)菌種被克雷伯氏菌屬所取代，值得一提的是，因這種菌致病的病例中，有95%的患者是在醫(yī)院受到感染[2]。由此可見，這是一種不可忽視且危害極大的醫(yī)院中常見的致病細(xì)菌。

2.4.2 真菌

對(duì)來(lái)自前述3種環(huán)境下的混菌樣品進(jìn)行16S rDNA測(cè)序分析，未能檢測(cè)到ATM機(jī)金屬按鍵以及皮膚科門診室門把手存在真菌物種。從實(shí)驗(yàn)室金屬門把手得到優(yōu)勢(shì)真菌物種相對(duì)豐度如表4所示。圖8為表4所對(duì)應(yīng)的柱狀圖。樣本中豐度占比小于1%的物種歸為Others，其余的作為優(yōu)勢(shì)物種進(jìn)行分析。

在實(shí)驗(yàn)室金屬門把手上采集到的混菌樣品的菌液（a）中，各種類的真菌豐度較為均勻，除了能導(dǎo)致植物根腐病[32]和人類肺真菌病[33]的鐮刀菌屬（）之外并沒有明顯的優(yōu)勢(shì)菌種。但是當(dāng)在304 SS樣品表面培養(yǎng)6 h（b）后，依薩酵母屬（）、曲霉菌屬（）、帚枝霉屬（）以及威克漢姆酵母屬（）的相對(duì)豐度明顯高于其他物種。其中，依薩酵母屬可以在果蠅體表攜帶，這種酵母菌在致病性測(cè)定試驗(yàn)中被證實(shí)為能夠引發(fā)葡萄酸腐病的致病菌，已經(jīng)成為葡萄生長(zhǎng)中后期重要的病害之一，造成葡萄果穗大量腐爛，嚴(yán)重影響葡萄的品質(zhì)與產(chǎn)量[34]；曲霉菌屬則可以導(dǎo)致人體患多種疾病，例如感染性心內(nèi)膜炎[35]、曲霉菌性脊柱炎[36]等；常見于霉變糧食中的黃曲霉菌也是曲霉菌屬的一種，其分泌的黃曲霉素在世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的一類致癌物清單中，對(duì)人體有著極大的危害；帚枝霉屬感染水稻后會(huì)引起水稻鞘腐病，造成20%～85%的產(chǎn)量損失[37]；威克漢姆酵母屬盡管屬于酵母菌屬，但也會(huì)感染人類引起真菌血癥[38]。這4種真菌在生物被膜樣品中的總相對(duì)豐度之和超過(guò)了60%，并且任何一種感染動(dòng)物或植物后都能引起嚴(yán)重的疾病，會(huì)對(duì)生產(chǎn)或是生活產(chǎn)生重大影響。

除了上述4種可以感染人體或植物導(dǎo)致發(fā)病的真菌外，在非優(yōu)勢(shì)物種中，還有一些真菌同樣可以引起各種疾病，例如假絲酵母菌屬（）在一定條件下可侵犯皮膚、黏膜、內(nèi)臟和血液，引起繼發(fā)性感染，表現(xiàn)為急性、亞急性或慢性炎癥[39]，并且假絲酵母菌外陰陰道炎是育齡期女性的常見病和多發(fā)病，其長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作、難以根治的特點(diǎn)嚴(yán)重影響患者的日常生活及身心健康[40]；生絲畢赤酵母屬（）長(zhǎng)期以來(lái)雖然只被用作生物研究，但是近期也被發(fā)現(xiàn)同樣可以感染人類[41]；根毛霉屬（）會(huì)引起皮膚接合菌病，且發(fā)生率正在逐年增加[42]；絕大多數(shù)木霉（）對(duì)人類無(wú)害，但有些種類能夠感染人類造成木霉病，表現(xiàn)形式多樣，臨床極易誤診，臨床表現(xiàn)中以腹膜炎最多見[43]；喙枝孢霉屬（）在2020年被發(fā)現(xiàn)是導(dǎo)致免疫能力差的患者患腦真菌病的致病菌[44]；短梗霉屬（）引發(fā)的感染在臨床上多表現(xiàn)為真菌血癥，腹膜炎或者皮膚感染[45]。

表4 實(shí)驗(yàn)室門把手的真菌豐度和組成

notes: 16S rDNA sequencing was carried out after centrifugation and enrichment of bacterial solution and biofilm from laboratory door handle, including (a) laboratory metal door handle bacterial solution, (b) laboratory metal door handle biofilm.

圖8 表4所對(duì)應(yīng)的柱狀圖

2.5 ROS分析

選用實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下的微生物菌群覆膜于不同金屬表面，觀察其在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)下產(chǎn)生的活性氧（ROS），如圖9所示。與AHEA和純銅相比，304不銹鋼以及304 Cu-SS樣品上幾乎沒有綠色熒光，表明304 Cu-SS在短時(shí)間內(nèi)幾乎沒有ROS產(chǎn)生，因此沒有抗菌性。相比之下，AHEA表面在3 h后便觀察到高水平的ROS（高熒光強(qiáng)度），純Cu材料表面ROS產(chǎn)量最高。結(jié)合合金組織與成分分析（圖2）可知，合金中的Cu含量越多，微生物菌群中的ROS產(chǎn)量越高。而ROS的高表達(dá)也證明了抗菌高熵材料與微生物（包含細(xì)菌和真菌）的直接接觸會(huì)引發(fā)接觸式殺菌反應(yīng)，從而催化ROS表達(dá)，破壞細(xì)菌結(jié)構(gòu)。

圖9 實(shí)驗(yàn)室菌液覆膜1、3、6 h后不同金屬試樣表面的活性氧染色圖

3 結(jié)論

通過(guò)抗菌測(cè)試、活死細(xì)胞染色、微生物形態(tài)分析、活性氧分析，證明了Al0.4CoCrCuFeNi高熵合金對(duì)于多種生活環(huán)境中常見的、可能引起人或各種動(dòng)植物患病的細(xì)菌或真菌都有良好的、接近純銅的抗菌性能，對(duì)環(huán)境微生物的抑制效果顯著高于304 SS與304 Cu-SS。這一結(jié)論有利于更好地將此種新型合金材料應(yīng)用于各種生活環(huán)境，拓展其相關(guān)應(yīng)用，為開發(fā)兼具抗菌性能等綜合性能優(yōu)異的生活用金屬新材料提供新思路及數(shù)據(jù)支撐，為未來(lái)的金屬防護(hù)提供新的有效的材料。

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(School of Materials Science and Engineering, Northeastern University, Shenyang 110819, China)

By using the multi principal component design idea of high entropy alloy and adding high content of copper, the work aims to prepare the new antibacterial high-entropy alloy (AHEA, Al0.4CoCrCuFeNi) containing copper with excellent mechanical properties and to explore the antibacterial performance of it in a variety of complex living environments. The phase composition of high-entropy alloys is analyzed through XRD. Taking of the tensile test to study the mechanical properties of high entropy alloy, and collect microbial communities in various living environments. Furthermore, by plate coating, using field emission scanning electron microscope (FESEM) and confocal laser scanning microscope (CLSM) to observe the bacterial growth and film morphology, and to compare and analyze the antibacterial properties of the high entropy alloy. Through gene sequencing, OTU cluster analysis and species taxonomy analysis were carried out to statistically analyze community structure and species diversity. Through the analysis of reactive oxygen species clusters, the sterilization mechanism of high entropy alloys was explored. The gauge length of the rod tensile specimen is 33 mm and the diameter is 6 mm. A constant strain rate of the room temperature tensile test is executed 1×10?3s?1. And the final yield strength result is (308±10) MPa, which is higher than that of traditional antibacterial stainless steel. In this experiment, a medical cotton swab sterilized in a sterilizer was placed in a 50 mL centrifuge tube containing 10.9 g/L PBS buffer. Three environments are randomly selected: the metal button of ATM (a), the metal door handle of laboratory (b) and the door handle of dermatology clinic (c). Then the collected strains are enriched and cultured with LB liquid medium and cultured in a shaking table at 37 ℃ for 12 hours waiting to be used. Through the calculation formula of antibacterial rate and the experimental results (- the antibacterial rate;- the number of viable bacteria in the control (CFU/ml);- the number of viable bacteria in antibacterial sample (CFU/ml), it is concluded that the antibacterial rate of high entropy alloy is more than 99.99%. The results of scanning electron microscope (FESEM) analysis and live and dead staining results shows that the number of colonies on the surface of AHEA decrease significantly and there are almost no living microorganisms, cause the stained image is basically in red and it sparsely distributes. In addition, the sequencing results shows that the dominant bacteria that are easy to adhere to the surface of common metal samples are mostly harmful pathogens, including bacteria and fungi, after consulting the data, it shows that the collected dominant bacteria will cause serious diseases or have a great impact on production and life, but fortunately, AHEA inhibits them nicely. The above results indicate that AHEA can be used as a long-term broad-spectrum antibacterial material. It can prevent the reproduction and growth of bacteria and fungi on the metal surface and the formation of biofilm. The comprehensive performance is much better than that of traditional antibacterial alloys. The application prospect of copper containing high entropy alloy in daily living environment is confirmed, which provides a new idea for the further development of unique antibacterial metal materials with high antibacterial efficiency and mechanical properties.

antibacterial alloys; high-entropy alloys; anti-bacterial; anti-fungal; biofilm; living-environment

tg172

A

1001-3660(2023)01-0266-12

10.16490/j.cnki.issn.1001-3660.2023.01.027

2022–01–12；

2022–03–05

2022-01-12；

2022-03-05

遼寧省興遼英才計(jì)劃項(xiàng)目（XLYC1907158）

Liaoning Revitalization Talents Program (XLYC1907158)

周恩澤（1991—），男，博士，主要研究方向?yàn)槲⑸锔g。

ZHOU En-ze (1991-), Male, Doctor, Research focus: microbiologically influenced corrosion.

肖凌云, 武文韜, 周沂霖, 等. Al0.4CoCrCuFeNi高熵合金在生活環(huán)境中的抗菌性能[J]. 表面技術(shù), 2023, 52(1): 266-277.

XIAO Ling-yun, WU Wen-tao, ZHOU Yi-lin, et al. Antibacterial Properties of Al0.4CoCrCuFeNi High Entropy Alloy in Living Environment[J]. Surface Technology, 2023, 52(1): 266-277.

責(zé)任編輯：萬(wàn)長(zhǎng)清