丁酸梭菌對肉雞生長性能和體液免疫應(yīng)答能力的影響

蔣玲艷，張 在，于 樂，秦張善，王林果

（1.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學 動物科技學院，廣西南寧 530007；2.普萊柯生物工程股份有限公司，河南洛陽 471000）

微生態(tài)制劑具有降低病原體入侵或定植引起疾病的風險，分泌病毒捕捉顆粒，降低病毒的傳染性，提高動物免疫能力、生產(chǎn)性能等多種功能，正在成為抗生素替代品，廣泛用于動物生產(chǎn)。目前應(yīng)用于改善雞生產(chǎn)性能、免疫性能的益生菌種類較多，包括乳桿菌、分支桿菌、芽孢桿菌、酵母菌、丁酸梭菌等。但益生菌調(diào)節(jié)雞的生長性能和免疫性能的效果跟多種因素有關(guān)，需要進行詳細研究（簡宗輝等，2021；劉珂飛等，2021；Alquazlan等，2021）。丁酸梭菌屬于厭氧型芽孢梭菌，存在于人和動物腸道，具有耐胃酸、耐高溫、耐多種抗生素，且能提高機體免疫力、改善腸道組織結(jié)構(gòu)、促進消化吸收、維持腸道屏障能力等功能，作為一種新型綠色的微生態(tài)制劑，已成為人們研究的熱點，并廣泛應(yīng)用于人類疾病治療及動物養(yǎng)殖生產(chǎn)上（王宗偉等，2022；范雪等，2021；Stoeva等2021）。禽流感（Avian influenza，AI）和新城疫（Newcastle disease，ND）是危害養(yǎng)雞業(yè)的兩種主要急性傳染病。禽流感病毒不單攻擊呼吸道，還會對雞的腸道造成破壞，導致雞腸道黏膜上皮細胞連接方式發(fā)生改變，產(chǎn)生嚴重的繼發(fā)感染。疫苗免疫是目前預防雞免遭這些傳染病侵襲的重要手段之一，但由于病毒毒力變異及各種因素的影響，疫苗免疫難以完全有效控制這些傳染病的爆發(fā)，因此，疫苗接種聯(lián)合益生菌使用會成為這些疾病的綜合防控途徑。本試驗聯(lián)合新城疫病毒-禽流感病毒滅活疫苗免疫和丁酸梭菌的使用，研究分析了丁酸梭菌對雞生長性能和體液免疫的影響，為科學應(yīng)用丁酸梭菌飼養(yǎng)肉雞及綜合防控雞新城疫和禽流感提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物分組及免疫 試驗將90只1日齡健康麻黃肉雞（購自廣西富鳳農(nóng)牧集團）隨機分成3組，每組3個重復，每個重復10只雞，采取單層籠養(yǎng)方式飼養(yǎng)在本校動物養(yǎng)殖場，自由采食與飲水，試驗為期84 d。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗組飼喂基礎(chǔ)日糧+丁酸梭菌（低劑量2×105CFU/g和高劑量5×105CFU/g）。各組雞分別于1和21日齡頸部皮下接種新城疫病毒-禽流感病毒二聯(lián)滅活疫苗 0.3 mL/只。

1.2 試驗試劑 丁酸梭菌網(wǎng)購自佳美生物，活菌 數(shù) 5億 CFU/g。 新 城 疫 病 毒（LaSota株）-禽流感病毒（H9亞型）二聯(lián)滅活疫苗（批號為160022133），由普萊柯生物工程有限公司提供。新城疫血凝抑制試驗用抗原、陽性血清與陰性血清（批號為154028082），購自青島立見生物科技有限公司。小雞基礎(chǔ)日糧（破碎顆粒料）：漓源小雞配合飼料121T（3周齡內(nèi)）和511（3周齡以上），購自南寧市元亨獸醫(yī)服務(wù)中心。

1.3 免疫器官指數(shù)和腸道指數(shù)的測定 分別于21、42、63、84日齡時每組隨機挑取 3只雞，分別稱量個體活重，然后屠宰分離出脾、胸腺、法氏囊，稱量三者總重量，計算免疫器官指數(shù)。同時分離出十二指腸、空腸、回腸和盲腸、直腸，除去腸中內(nèi)容物后稱量每只雞整個腸道的重量，計算腸道指數(shù)，具體公式如下：

腸道指數(shù)/%=個體腸道總重量/個體活重×100；

免疫器官指數(shù)/%=個體免疫器官總重量/個體活重×100。

1.4 日增重、日采食量和飼料轉(zhuǎn)化率的測定 每3周稱量一次雞只體重和飼料消耗量，計算雞只平均體重和平均飼料消耗量，然后計算日增重和日采食量，并計算飼料轉(zhuǎn)化率，具體公式如下：

飼料轉(zhuǎn)化率/%=平均日增重/平均日采食量×100。

1.5 血清分離 二免疫后14 d起，每周固定時間分別從對照組和試驗組雞群中隨機采集6只雞翅靜脈血，待血液凝固后收集血清，于3000 rpm離心5 min，保存上清液，用于新城疫抗體（Newcastle disease antibody，ND Ab） 和 禽流 感 H9亞 型 抗 體（Avian influenza H9subtype antibody，AI H9Ab）效價測定，連續(xù)采集血清 8 周。

1.6 新城疫抗體（ND Ab）和禽流感抗體（AI H9Ab）的測定 用血凝試驗和血凝抑制試驗（Hemagglutination inhibition test，HI）測 定 ND Ab效價和 AI H9Ab效價。ND Ab效價測定按照國家標準《新城疫診斷技術(shù)》（GB/T16550-2020）執(zhí)行，記錄測定數(shù)據(jù)，計算HI（log2）結(jié)果平均值。AI H9Ab效價由廣西璞締恩葳生物科技有限公司一次性全部檢測。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗數(shù)據(jù)用Excel整理后，使用GraphPad Prism 6.01軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以“平均值±標準差”表示，采用t檢驗，P＜0.05表示組間差異顯著，P＜0.01表示組間差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁酸梭菌對免疫器官指數(shù)與腸道指數(shù)的影響 由表1可知，21日齡雞丁酸梭菌高劑量（5×105CFU/g）組免疫器官指數(shù)稍高，各組雞的免疫器官重量指數(shù)均在42日齡時最高，其中對照組最高，但丁酸梭菌低劑量（2×105CFU/g）組和高劑量組無顯著差異（P＞0.05），整個試驗期間隨日齡的增加，對照組和試驗組雞的免疫器官指數(shù)變化趨勢基本一致，且同日齡階段各組免疫器官指數(shù)無顯著差異（P＞0.05）。各組雞腸道指數(shù)隨日齡增加呈下降趨勢，21日齡時腸道指數(shù)最高，之后逐漸下降。21日齡時，丁酸梭菌低劑量組和高劑量組雞的腸道指數(shù)均高于對照組（P＞0.05），21～63日齡丁酸梭菌低劑量組腸道指數(shù)高于丁酸梭菌高劑量組和對照組，但各組之間無顯著差異（P＞0.05）。84日齡時，丁酸梭菌低劑量組腸道指數(shù)明顯低于對照組（P＜0.01），丁酸梭菌高劑量組與對照組無顯著差異（P＞0.05）。

表1 丁酸梭菌對肉雞免疫器官指數(shù)和腸道指數(shù)的影響 %

2.2 丁酸梭菌對肉雞生長性能的影響 由表2可知，整體看，對照組和試驗組雞只在前3周內(nèi)生長最慢，日增重最少，但飼料轉(zhuǎn)化率較高，之后生長速度加快，21～42日齡日增重最快。0～21日齡，對照組的平均日增重顯著高于試驗組（P＜0.05），丁酸梭菌低劑量和高劑量組雞平均日增重無顯著差異（P＞0.05）；0～21日齡對照組飼料轉(zhuǎn)化率極顯著高于丁酸梭菌低劑量組（P＜0.01），與丁酸梭菌高劑量組無顯著差異（P＞0.05），且丁酸梭菌高劑量組飼料轉(zhuǎn)化率顯著高于低劑量組（P＜0.01）。21～42日齡，丁酸梭菌高劑量組日增重顯著高于低劑量組和對照組（P＜0.05），飼料轉(zhuǎn)化率極顯著高于低劑量組和對照組（P＜0.01），對照組日增重和飼料轉(zhuǎn)化率與丁酸梭菌低劑量組無顯著差異（P＞0.05）。42～63日齡，丁酸梭菌低劑量組日增重和飼料轉(zhuǎn)化率顯著高于對照組和高劑量組（P＜0.05），丁酸梭菌高劑量組與對照組無顯著差異（P＞0.05）。63～84日齡，丁酸梭菌低劑量組和高劑量組的日增重與對照組無顯著差異（P＞0.05），低劑量組飼料轉(zhuǎn)化率顯著高于對照組和高劑量組（P＜0.05），高劑量組與對照組無顯著差異（P＞0.05）。整體看，丁酸梭菌對雞生長性能的影響與雞的日齡和添加丁酸梭菌的量有關(guān)。與對照組相比，除前三周外，在飼料中添加丁酸梭菌可以提高雞日增重和飼料轉(zhuǎn)化率。42日齡前在肉雞飼料中添加高劑量（5×105CFU/g）丁酸梭菌組的飼料轉(zhuǎn)化率顯著高于低劑量（2×105CFU/g）組（P＜0.05）；42日齡后添加丁酸梭菌低劑量的飼料轉(zhuǎn)化率顯著高于高劑量組和對照組（P＜0.05），高劑量組與對照組無顯著差異（P＞0.05）。三組雞的終末平均體重基本一致，丁酸梭菌低劑量組飼料轉(zhuǎn)化率顯著高于對照組（P＜0.05），與高劑量組無顯著差異（P＞0.05），添加丁酸梭菌組平均日采食量低于對照組。

表2 丁酸梭菌對肉雞生長性能的影響

2.3 丁酸梭菌對肉雞體液免疫應(yīng)答能力的影響為研究丁酸梭菌對雞體液免疫應(yīng)答能力的影響，對照組和試驗組雞全部于1和21日齡頸部皮下接種新城疫病毒-禽流感病毒（H9亞型）二聯(lián)滅活疫苗。第二次免疫后14 d開始，每周定期采血分離雞血清，用HI試驗測定新城疫抗體（ND Ab）效價和禽流感H9亞型抗體（AI H9Ab）效價，計算HI（log2）平均值。由表3可知，二次免疫后14 d時，對照組ND Ab和AI H9Ab的平均效價均高于丁酸梭菌組，但與丁酸梭菌組差異不顯著（P＞0.05）。丁酸梭菌低劑量組和對照組在二免35 d時ND Ab和AI H9Ab平均效價均達到最高值，兩組的ND Ab平均效價最高值一致，均為9.7 log2，但丁酸梭菌低劑量組的AI H9Ab平均效價最高達到 10.7 log2，極顯著高于對照組的 9.0 log2（P＜0.01），而對照組AI H9Ab平均效價顯著高于丁酸梭菌高劑量組（P＜0.05）。二免28 d后，丁酸梭菌低劑量組的ND Ab和AI H9Ab的平均效價均高于對照組和高劑量組，高劑量組略低于對照組（P＞0.05）。在整個試驗期間，各組血清ND Ab和AI H9Ab平均效價變化趨勢基本一致，均表現(xiàn)出一定的波動，在二次免疫后的63 d內(nèi)無明顯的規(guī)律性，其中丁酸梭菌高劑量組的ND Ab和AI H9Ab效價最高值和整體平均效價均低于對照組（P＞0.05），而丁酸梭菌低劑量組的ND Ab和AI H9Ab效價在達到最高值后平均效價稍高于對照組（P ＞ 0.05）。

表3 丁酸梭菌對肉雞體液免疫應(yīng)答能力的影響

3 討論

丁酸梭菌為革蘭氏陽性厭氧桿菌，具有促進腸道有益菌群增殖、發(fā)育，抑制有害菌繁殖，產(chǎn)生多種維生素等作用，其主要代謝產(chǎn)物丁酸是腸道上皮組織細胞再生和修復的主要營養(yǎng)物質(zhì)，不受胃酸、膽汁酸等影響，作為新飼料添加劑在動物養(yǎng)殖方面廣泛應(yīng)用（范雪等，2021）。試驗結(jié)果表明，21日齡內(nèi)的肉雞，與對照組比較，在飼料中添加5×105CFU/g丁酸梭菌可稍微提高免疫器官指數(shù)和腸道指數(shù)，為后期營養(yǎng)消化、吸收和體液免疫打好生理基礎(chǔ)。但試驗持續(xù)到84日齡時發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌低劑量組腸道指數(shù)低于對照組和高劑量組，具體原因需要進一步研究。研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌可增加幼禽腸道重量指數(shù)，并不是增加腸道長度，而是增加了腸道絨毛的長度和厚度（李修宇等，2021；蔣一秀等，2021；韋曉芳等，2021）。因此，21日齡后在飼料中添加2×105～5×105CFU/g丁酸梭菌能顯著提高日增重和飼料轉(zhuǎn)化率，與武麗達等（2022）的研究結(jié)果基本一致。從84 d的試驗期看，在42日齡內(nèi)的肉雞飼料中添加5×105CFU/g丁酸梭菌可以改善雞的免疫器官指數(shù)和腸道指數(shù)，提高飼料轉(zhuǎn)化率。對于42日齡以上的肉雞，日糧中添加2×105CFU/g丁酸梭菌對日增重和飼料轉(zhuǎn)化率的效果優(yōu)于添加5×105CFU/g丁酸梭菌。長期在飼料中添加丁酸梭菌對麻黃肉雞的終末體重影響不顯著，但可以提高飼料轉(zhuǎn)化率，降低飼料成本。

由表3可知，試驗組在二次免疫14 d的ND Ab和AI H9Ab平均效價均低于對照組，且個體差異比較大，存在效價低于免疫臨界值4 log2的個體（1/6），可能跟拌料均勻度有關(guān)。二次免疫21 d后，各組新城疫和禽流感H9個體免疫率和群體免疫率均達到100%。二次免疫35 d后，丁酸梭菌低劑量組和對照組的ND Ab和AI H9Ab平均效價均達到最高值，且丁酸梭菌低劑量組的AI H9Ab最高效價明顯高于其他兩組，而丁酸梭菌高劑量組的ND Ab和AI H9Ab峰值低于其他兩組，且沒有明顯峰值。表明在麻黃肉雞飼料中添加合適劑量（2×105CFU/g）的丁酸梭菌能提高雞對新城疫和AI H9滅活疫苗的免疫應(yīng)答能力，從而提高抗體效價和抗體持續(xù)時間。而在飼料中添加高劑量（5×105CFU/g）的丁酸梭菌反而對雞的體液免疫應(yīng)答能力沒有正向效果，從而導致血清抗體效價不高，其機理需要進一步研究。

4 結(jié)論

綜上所述，在42日齡內(nèi)的肉雞飼料中添加高劑量5×105CFU/g的丁酸梭菌可改善免疫器官指數(shù)和腸道指數(shù)，提高日增重和飼料轉(zhuǎn)化率。對于42日齡以上的肉雞，飼料添加低劑量2×105CFU/g的丁酸梭菌對雞日增重、飼料轉(zhuǎn)化率和體液免疫應(yīng)答能力等綜合性能的提高較好，且能提高麻黃肉雞滅活疫苗免疫后的AI H9Ab峰值和持續(xù)時間，而高劑量5×105CFU/g的丁酸梭菌對麻黃肉雞的新城疫和禽流感疫苗的體液免疫應(yīng)答沒有提高作用。因此，丁酸梭菌對家禽生長性能和免疫性能的效果不僅要考慮使用劑量、飼喂方式，還要考慮家禽的日齡。