全外顯子測(cè)序在青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸病因?qū)W中的研究進(jìn)展

丁子豪 程云忠 海涌 周立金 劉玉增 何觀平 潘愛星

青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸 (adolescent idiopathic scoliosis，AIS) 是一種主要發(fā)生在青春期的脊柱側(cè)凸亞型，多見于骨骼發(fā)育期階段中的快速發(fā)育期[1-3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，AIS 的總發(fā)病率為 0.47%～5.20%[4-6]，在一般人群中的發(fā)病率約 3.00%[7]。盡管 AIS 的病因和發(fā)病機(jī)制尚未確定，但家族遺傳與雙生子相關(guān)研究表明，遺傳因素在脊柱彎曲的形成和發(fā)展中起著重要作用[8]。眾所周知，遺傳和環(huán)境因素都是導(dǎo)致散發(fā)性 AIS 的原因[9]。全外顯子測(cè)序技術(shù)[10-11]的應(yīng)用和發(fā)展促使研究人員對(duì) AIS 的病因在病因?qū)W層面上進(jìn)一步發(fā)掘和探索，這對(duì) AIS 患者的預(yù)防和治療具有指導(dǎo)意義。

一、全外顯子測(cè)序在 AIS 中的應(yīng)用

外顯子又稱表達(dá)序列，是真核生物基因的一部分，指基因組 DNA 中出現(xiàn)在成熟 RNA 分子上的序列，存在于最初的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中以及成熟的 RNA 分子中的核苷酸序列。盡管外顯子測(cè)序技術(shù) (whole exome sequencing，WES) 中捕獲探針僅覆蓋人類基因組的 1.0%～1.5%[12]，但該基因區(qū)域卻涵蓋了約 85.0% 的已知致病基因變異[13]，這也使得研究人員更加關(guān)注編碼區(qū)信息。WES 將基因組中該部分區(qū)域 DNA 捕捉并富集后進(jìn)行高通量測(cè)序[14-15]，是鑒別疑似遺傳病患者分子缺陷的一種診斷方法[16]。WES 是利用一組針對(duì)已知外顯子基因序列的寡核苷酸雜交探針，通過(guò)探針實(shí)現(xiàn)捕獲富集基因組 DNA 蛋白質(zhì)的編碼區(qū)，利用這種測(cè)序方法可以分析癌癥樣本和腫瘤，以此來(lái)尋找到新的治療靶點(diǎn)[17-18]。2010 年，美國(guó)華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員通過(guò)外顯子組測(cè)序方法發(fā)現(xiàn)了致命性眼癌的一類關(guān)鍵基因，這一研究成果可能成為未來(lái)治療這類癌癥的方向[19]。

外顯子測(cè)序可對(duì)多個(gè)體的蛋白編碼信息進(jìn)行測(cè)序研究，其成本相對(duì)于全基因組測(cè)序，具有準(zhǔn)確性高，覆蓋范圍廣，高效且經(jīng)濟(jì)等眾多優(yōu)勢(shì)，可用于遺傳性疾病及癌癥等病因?qū)W研究。近些年來(lái)，眾多研究聚焦于 WES 在 AIS 病因?qū)W方面探究，筆者將在此進(jìn)行綜述。

2014 年，Buchan 等[20]利用 WES 對(duì) 852 例 AIS 患者和 669 例對(duì)照者的纖維蛋白-1 (fibrillin 1，F(xiàn)BN1) 及其相關(guān)基因 FBN2 進(jìn)行了測(cè)序。該研究確定 FBN1 是與 AIS 最顯著相關(guān)的基因。他們通過(guò)對(duì)歐洲血統(tǒng)個(gè)體以及獨(dú)立的漢族血統(tǒng)個(gè)體研究中發(fā)現(xiàn) FBN1 和 FBN2 罕見變異可能是預(yù)測(cè)脊柱側(cè)凸進(jìn)展?fàn)顩r的指標(biāo)，這為診斷和治療 AIS 提供了新的思路與方法。

2015 年，Azimzadeh 等[21-22]對(duì)幾個(gè)受特發(fā)性脊柱側(cè)凸 (idiopathic scoliosis，IS) 影響的大家庭采用了遺傳連鎖分析結(jié)合 WES 整合分析，發(fā)現(xiàn)了中心粒蛋白基因 POC5[23-24]中三個(gè)罕見的錯(cuò)義變異 p.A446T、p.A455P 和 p.A429V，該變異與受脊柱側(cè)凸影響的家系及患者的疾病共分離。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分，他們還利用斑馬魚模型證明 3 個(gè)與人類 IS 相關(guān)的 POC5 變異 mRNA 均會(huì)導(dǎo)致脊柱畸形的發(fā)生，而不會(huì)影響其它骨骼結(jié)構(gòu)。研究表明 POC5 基因突變與脊柱側(cè)凸的發(fā)生有關(guān)。

2015 年，Baschal 等[25]對(duì)患有 IS 的多代家庭中的 3 名成員進(jìn)行了外顯子組測(cè)序，研究發(fā)現(xiàn)位于 HSPG2 基因中變異體 p.Asn786Ser 在 IS 的隊(duì)列中有過(guò)高的表達(dá)。此外，該研究發(fā)現(xiàn)另外一些罕見的 HSPG2 變異，這些變異可能在兩個(gè)獨(dú)立的 IS 患者隊(duì)列中具有破壞性。HSPG2 基因能夠編碼一種在細(xì)胞外基質(zhì)中普遍存在的多功能蛋白?；蜃儺愔率沟鞍坠δ苁軗p，會(huì)導(dǎo)致小鼠和人類的肌肉骨骼表型發(fā)生異常。研究結(jié)論表明在 IS 患者中，HSPG2 基因的罕見變異可能與 IS 的表型有關(guān)。

2017 年，Einarsdottir 等[26]對(duì) IS 常染色體顯性遺傳的瑞典家系進(jìn)行了遺傳連鎖分析。該研究在此基礎(chǔ)上，對(duì) 2 個(gè)受影響的個(gè)體通過(guò)外顯子測(cè)序確定了 rs141489111 為 CELSR2 基因中一種罕見的非同義變異，是第 21 外顯子 NM_001408 的 ac.G6859A 改變，導(dǎo)致預(yù)測(cè)的 p.V2287I (NP_001399.1) 改變。團(tuán)隊(duì)對(duì) 1739 例瑞典丹麥脊柱側(cè)凸患者和 1812 例對(duì)照個(gè)體的 CELSR1-3 標(biāo)記變異的分析顯示，與 CELSR2 中常見的同義變異 rs2281894 有顯著關(guān)聯(lián)，但在日本和美國(guó)的病例對(duì)照隊(duì)列中未發(fā)現(xiàn) CELSR1 和 CELSR3 中的變異之間存在關(guān)聯(lián)。該研究結(jié)果表明在顯性分離的家庭，CELSR2 基因的一種罕見變異是導(dǎo)致 IS 的發(fā)生的原因，并進(jìn)一步突出了 CELSR2 基因在 IS 的瑞典 -丹麥人群中的一般易感性。

2018 年，Haller 等[27]對(duì) 457 例嚴(yán)重 AIS 病例和 987 例對(duì)照個(gè)體進(jìn)行了外顯子測(cè)序相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)在 SLC39A8 (p.Ala391Thr，rs13107325) 中存在與重度 AIS 相關(guān)的錯(cuò)義單核苷酸多態(tài)性 (single nueleotide polymorphism，SNP)，這種多效性 SNP 與體質(zhì)量指數(shù) (body mass index，BMI)、血壓、膽固醇和血錳水平相關(guān)。該隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn) rs13107325 的次要等位基因與更大的脊柱彎曲度、更低的身高、更高的 BMI 和更低的血漿錳相關(guān)，功能研究中則發(fā)現(xiàn) SLC39A8P 介導(dǎo)的錳內(nèi)流減少。在對(duì) SLC39A8P 突變斑馬魚中的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中證明了 Ala391Thr 變異會(huì)導(dǎo)致脊椎異常、生長(zhǎng)情況受損以及運(yùn)動(dòng)活動(dòng)性降低。研究結(jié)果表明預(yù)防脊柱側(cè)凸的發(fā)生發(fā)展需要飲食干預(yù)。

2019 年，Sadler 等[28]利用 WES 對(duì) 1197 例 AIS 病例和 1664 例內(nèi)部對(duì)照病例的外顯子組序列數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，利用覆蓋數(shù)據(jù)鑒定罕見拷貝數(shù)變體 (copy number variants，CNVs)。結(jié)果0.7% 的 AIS 病例 (8/ 1197) 中發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)端染色體 16p11.2 微重復(fù)體含有 SH2B1 基因。此外，對(duì)來(lái)自 geisinger 健康系統(tǒng)的 92 455 例的數(shù)據(jù)分析顯示，含有 SH2B1 染色體 16p11.2 微重復(fù)的患者中有 30% (20/ 66) 出現(xiàn)脊柱側(cè)凸，而對(duì)照組為 7.6% (10/ 132)。研究結(jié)果表明存在遠(yuǎn)端染色體 16p11.2 微重復(fù)的個(gè)體應(yīng)篩查脊柱側(cè)凸，以便早期進(jìn)行預(yù)防治療。

2021 年，Mathieu 等[29]對(duì)一個(gè) 5 代英國(guó)家系使用 WES，在微管蛋白酪氨酸連接酶樣基因 11 (tubulin tyrosine ligase like member 11，TTLL11) 中發(fā)現(xiàn)了這個(gè)家系的致病基因 c.1569_1570insTT。在研究同一隊(duì)列另外 2 例 AIS 病例中也發(fā)現(xiàn)了 TTLL11 變異。另外，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分，通過(guò)促使 TTLL11 基因發(fā)生突變以及對(duì) TTLL11 基因敲除的研究證實(shí)了該基因?qū)Π唏R魚視的脊椎發(fā)育和睫毛功能存在相關(guān)作用。研究結(jié)果表明纖毛基因 TTLL11 的突變與特發(fā)性脊柱側(cè)凸的發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性。

2016 年，Li 等[30]對(duì) 10 例中國(guó)漢族個(gè)體進(jìn)行了全外顯子測(cè)序、Sanger 測(cè)序和實(shí)時(shí)熒光定量 (quantitative realtime PCR，QPCR) 來(lái)鑒定候選基因并測(cè)量可能的致病基因的表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn) AKAP2 基因內(nèi)的突變 c.2645A＞c (p.E882A) 與 AIS 表型共分離。該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn) AKAP2 位于染色體 9q31.2-q34.2 上的連鎖基因座中，且與骨骼發(fā)育相關(guān)。實(shí)驗(yàn)研究中的實(shí)時(shí)定量 PCR 顯示，與對(duì)照組相比，患者的 mRNA 表達(dá)水平顯著增加。研究結(jié)論表明 SAKAP2A 為 AIS 中突變的新基因，可進(jìn)一步從該疾病的遺傳學(xué)和發(fā)病機(jī)制來(lái)驗(yàn)證結(jié)果。

2017 年，Gao 等[31]對(duì) 4 個(gè)常染色體顯性遺傳性 (autosomal dominant，AD) AIS 家系和 86 例單純型患者通過(guò)全外顯子測(cè)序和連鎖分析，該研究在絲裂原活化蛋白激酶 7 基因 (mitogen-activated protein kinase 7，MAPK7) 中發(fā)現(xiàn)了 3 個(gè)與疾病相關(guān)的錯(cuò)義變異 (c.886G＞A、c.1943C＞T 和 c.1760C＞T)。研究通過(guò)在體外的細(xì)胞模型，證明了 MAPK7 突變體擾亂了細(xì)胞模型中的核轉(zhuǎn)位過(guò)程。此外，該團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了 CRISPR/ Cas9 介導(dǎo)的 MAPK7 在斑馬魚中缺失的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，再現(xiàn)了 IS 的特征表型。研究結(jié)果表明 MAPK7 中罕見的編碼變體促使 AIS 疾病過(guò)程的發(fā)生發(fā)展，為發(fā)掘 AIS 的發(fā)病機(jī)制提供了新的線索。

2018 年，Sheng 等[32]通過(guò) WES 對(duì) 952 例 AIS 患者和 1499 例對(duì)照組的 FBN1 和 FBN2 常見變異進(jìn)行基因分型，該研究進(jìn)一步調(diào)查了 FBN1 在 AIS 的發(fā)生和發(fā)展中的功能及作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn) AIS 易感位點(diǎn) rs12916536。研究發(fā)現(xiàn) FBN1 的常見變異與 AIS 的易感性顯著相關(guān)。此外，F(xiàn)BN1 的表達(dá)降低與 AIS 的曲度嚴(yán)重程度顯著相關(guān)[22]。

2020 年，Wang 等[33]對(duì) 10 個(gè)三胎家族進(jìn)行了全外顯子組測(cè)序，對(duì) 103 例單胎患者進(jìn)行了全基因組測(cè)序。通過(guò)熒光素酶法檢測(cè)候選雌激素相關(guān)受體 1 (estrogen receptor related-1，ESR1) 和 ESR2 變異的功能變化。研究發(fā)現(xiàn) ESR1 的一個(gè)錯(cuò)義變體 (c.868A＞G) 和 ESR2 致病變異 (c.236t＞C) 作為 AIS 的候選基因。研究結(jié)論表明 113 例 AIS 患者中發(fā)現(xiàn)了 ESR1 和 ESR2 的潛在致病性變異，ESR1 與 ESR2 的基因突變與 AIS 的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。

2020 年，Jiang 等[34]利用 WES 分析了 40 例 AIS 三聯(lián)體和 183 例散發(fā)性 AIS 患者，通過(guò)以基因?yàn)榛A(chǔ)的負(fù)荷測(cè)試發(fā)現(xiàn)了最高信號(hào)位于絲狀蛋白 B (filamin B，F(xiàn)LNB)，且樣本個(gè)體在 FLNB 基因中存在罕見的破壞性變異。此外，該研究團(tuán)隊(duì)在功能研究方面發(fā)現(xiàn)了 FLNB 變異體改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象和亞細(xì)胞定位，與 AIS 的其它蛋白質(zhì) (TTc26 和 OFD1) 的存在相互作用。研究結(jié)論表明 AIS 是一種寡基因疾病，F(xiàn)LNB 是 AIS 的一種易感基因。

2020 年，Wang 等[35]對(duì) 195 例中國(guó)南方的 AIS 患者進(jìn)行了外顯子測(cè)序，分析鑒定出 237 個(gè)與 AIS 相關(guān)的新的罕見變異以及 232 個(gè)新的易感基因位點(diǎn)。在功能研究方面，使用 CRISPR/ Cas9 靶向篩選，研究動(dòng)力蛋白基因 dnali1、dnah1、dnaaf 和 zmynd10 以及纖維蛋白相關(guān)基因的候選變異對(duì)斑馬魚的損傷效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)去除 dnaaf1 和 zmynd10 后，重現(xiàn)了成活成年斑馬魚的脊柱側(cè)凸。研究結(jié)果表明動(dòng)力蛋白相關(guān)因子的改變可能與中國(guó)南方人群的 AIS 易感性相關(guān)。

2021 年，Wu 等[36]在 96 例 AIS 患者中進(jìn)行了全外顯子組測(cè)序。收集了 43 例 AIS 患者和 38 例腰椎間盤突出癥患者的椎旁肌用于評(píng)估基因表達(dá)。該研究發(fā)現(xiàn)色素域解旋酶 DNA 結(jié)合蛋白 7 (chromodomain helicase DNA binding protein 7，CHD7) 的變異體 rs121434341 與 AIS 的發(fā)生發(fā)展顯著相關(guān)。此外，CHD7 表達(dá)降低可能與 AIS 患者的骨量異常有關(guān) (表 1)。

表1 WES 在 AIS 中研究Tab.1 Research of exome sequencing technology in AIS

二、WES 的局限性

全外顯子測(cè)序技術(shù)是在基因組范圍內(nèi)將外顯子區(qū)域內(nèi) DNA 進(jìn)行捕捉并進(jìn)行高通量測(cè)序，來(lái)進(jìn)一步確定與疾病相關(guān)的基因，這對(duì)鑒別遺傳性疾病、預(yù)防及治療遺傳性疾病提供了高效準(zhǔn)確的方法。但是 WES 亦存在一定的局限性。

首先，WES[37-38]檢測(cè)的基因大多位于編碼區(qū)，而對(duì)非編碼區(qū)的基因不能進(jìn)行抓捕檢測(cè)，故對(duì)結(jié)構(gòu)變異區(qū)域和非編碼區(qū)如增強(qiáng)子、啟動(dòng)子等研究具有局限性；并且該技術(shù)需要以大量樣本的基礎(chǔ)之上進(jìn)行分析研究，人群樣本混雜以及各個(gè)人種之間的差異性會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏倚，這也是 WES 中難以攻克的挑戰(zhàn)；再者 WES 需要較大的樣本量以及數(shù)據(jù)，研發(fā)費(fèi)用較高以及數(shù)據(jù)分析工作難度較 高[39-40]；而且 WES 目前局限于對(duì) AIS 家系的分析，未能廣泛分析各類遺傳學(xué)疾病。WES 是驗(yàn)證遺傳性疾病相關(guān)基因良好的技術(shù)方式，未來(lái)相關(guān)研究成本的下降可使其更大范圍地投入使用。

三、總結(jié)與展望

多年來(lái)，國(guó)內(nèi)外眾多的學(xué)者利用 WES 篩選了大量 AIS 相關(guān)基因。國(guó)內(nèi)外研究人員通過(guò) WES 在 AIS 中的研究成果詳見表 1，主要是外籍學(xué)者對(duì)其相關(guān)研究較多，發(fā)表了許多高影響因子文章，國(guó)內(nèi)研究人員對(duì) WES 的相關(guān)研究起步較晚，需要進(jìn)一步更加深入地研究。WES 仍存在一定的局限性，隨著基因組學(xué)在 AIS 中研究的不斷深入，WES 與其它相關(guān)基因組學(xué)技術(shù)相互補(bǔ)充各自局限性，基因組學(xué)相關(guān)技術(shù)的綜合應(yīng)用將會(huì)是未來(lái)研究遺傳學(xué)疾病的方向和趨勢(shì)。