靜脈應(yīng)用高劑量氨甲環(huán)酸對(duì)新西蘭兔股靜脈血栓形成的影響

張東風(fēng) 吳小東 孔清泉 王玉 伍椰 郭川 李韋龍

氨甲環(huán)酸 (tranexamic acid，TXA) 是一種人工合成的賴氨酸衍生物，1962 年由 Okamoto 首次發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于臨床[1]。它通過競(jìng)爭(zhēng)性連接纖溶酶 (原) 上的賴氨酸位點(diǎn)，抑制纖溶系統(tǒng)活性，減少了止血栓的溶解[2-3]。TXA 作為一種抗纖溶止血?jiǎng)壳耙呀?jīng)廣泛用于骨科、心胸外科、泌尿外科等出血量較大的外科手術(shù)當(dāng)中，可明顯減少圍術(shù)期出血量和輸 血率[3-6]。

目前臨床多項(xiàng)研究表明，高劑量 TXA 比低劑量 TXA 在減少出血和輸血需求方面更有效[7-8]。但 TXA 作為一種抑制纖溶止血的藥物，在體內(nèi)發(fā)揮抗纖溶止血作用時(shí)可破壞凝血與纖溶之間的平衡狀態(tài)，理論上可導(dǎo)致機(jī)體的高凝狀態(tài)而增加血栓形成事件的風(fēng)險(xiǎn)，特別是在高劑量時(shí)，包括深靜脈血栓 (deep venous thrombosis，DVT)、肺栓塞 (pulmonary embolism，PE)、心肌梗死、缺血性腦梗死等，這也是臨床當(dāng)中應(yīng)用 TXA 最為擔(dān)心的方面[9-11]。雖然大量隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn) (randomized controlled trial，RCT) 研究結(jié)果表明 TXA 并不會(huì)增加血栓事件的發(fā)生率，但也有研究發(fā)現(xiàn) TXA 與靜脈血栓形成發(fā)生率增加具有相關(guān)性[12-14]。但截至目前，尚缺乏直接證據(jù)表明其與 DVT、PE 等并發(fā)癥無(wú)直接相關(guān)性。本研究通過建立新西蘭兔股靜脈血栓模型，進(jìn)行彩色多普勒超聲及病理學(xué)檢查，研究靜脈應(yīng)用高劑量 TXA 對(duì)新西蘭兔股靜脈血栓形成的影響，探討術(shù)前使用高劑量 TXA 的安全性。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)對(duì)象

選取健康新西蘭兔 30 只。雌雄不限，體重 2.0～2.5 kg，年齡 5 個(gè)月左右。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由四川大學(xué)華西醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng) ＞ 1 周，自由飲水、進(jìn)食。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)協(xié)議都經(jīng)四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn) (倫理備案號(hào)：2020244A)。

二、實(shí)驗(yàn)主要試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑與儀器如表 1 所示。

表1 實(shí)驗(yàn)主要試劑與儀器Tab.1 Reagents and instruments

三、實(shí)驗(yàn)分組及實(shí)驗(yàn)過程

將 30 只健康新西蘭兔應(yīng)用電腦產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)表的方法隨機(jī)分為 TXA 組 (T 組，n=15) 和空白組 (P 組，n=15)。每組再應(yīng)用電腦產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)表的方法隨機(jī)分為 5 個(gè)時(shí)間亞組，即 1 天、3 天、5 天、7 天、14 天組，每組 3 只。T 組于術(shù)前 30 min 給予靜脈注射 50 mg/ kg TXA，P 組予以等量生理鹽水。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用“縮窄法+凝血酶注射法”建立股靜脈血栓模型。選取兔一側(cè)耳緣靜脈予以 3% 戊巴比妥鈉 1 ml/ kg 進(jìn)行麻醉，麻醉滿意后給予家兔肌肉注射青霉素 40 萬(wàn) U 預(yù)防感染。按照分組分別于術(shù)前 30 min 緩慢靜脈注射 50 mg/ kg TXA 或等量生理鹽水。選取一側(cè)腹股溝進(jìn)行備皮，充分裸露手術(shù)區(qū)域后碘伏消毒并鋪洞巾。在腹股溝區(qū)股動(dòng)脈波動(dòng)最強(qiáng)處做一長(zhǎng)約 3 cm 斜形手術(shù)切口，鈍性剝離并充分暴露股神經(jīng)、股動(dòng)脈、股靜脈，避免損傷股動(dòng)脈及股神經(jīng)，游離股靜脈約 2 cm。無(wú)損傷血管夾夾閉股靜脈近端以阻斷血流，向遠(yuǎn)心端靜脈腔內(nèi)注射凝血酶 0.1 ml (100 U/ 0.1 ml)，血管夾保留 2 h，觀察股靜脈管腔內(nèi)生成暗黑色血栓，使用 5-0 絲線在近心端血管夾放置處將股靜脈做不完全結(jié)扎，縮窄股靜脈管腔至 0.45 mm 頭皮針針頭粗細(xì)。有效止血觀察無(wú)活動(dòng)性出血后，逐層縫合切口，傷口消毒。術(shù)后第 1 天、第 2 天分別予以肌注青霉素 40 萬(wàn) U，自由水、進(jìn)食。

四、超聲影像學(xué)和組織病理學(xué)檢查

1.彩色多普勒超聲檢查：分別于建模前、建模后 1 天、3 天、5 天、7 天、14 天進(jìn)行檢測(cè)，檢查實(shí)驗(yàn)側(cè)股靜脈，每次檢查固定超聲檢查參數(shù)，如深度、增益等。檢查內(nèi)容包括股靜脈管徑、血流情況、血栓形成情況等，保存圖像并記錄數(shù)據(jù)。

2.組織病理學(xué)檢查：按照術(shù)后 1 天、3 天、5 天、7 天、14 天時(shí)間分組超聲檢查后進(jìn)行取材，將血栓血管段組織放置于 4% 多聚甲醛組織固定液中，固定 24 h 以上后制作石蠟病理切片，切片進(jìn)行 HE 染色，在顯微鏡下鏡檢觀察分析血栓形成、血管壁情況等，進(jìn)行圖像采集，保存圖像。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。管徑數(shù)據(jù)為計(jì)量資料，以表示，經(jīng)檢驗(yàn)各組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，采用方差分析進(jìn)行顯著性分析。P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、血栓形成大體情況觀察

30 只新西蘭兔經(jīng)“縮窄法+凝血酶注射法”等血栓制備步驟造成股靜脈血栓，注射凝血酶后，近無(wú)損傷血管夾放置處可見一暗紅色血栓迅速形成，血栓的長(zhǎng)度逐漸增加，血管逐漸增粗、變暗黑色，2 h 后觀察見股靜脈血管夾遠(yuǎn)端形成血栓。術(shù)后 24 h 進(jìn)行彩色多普勒超聲診斷檢查，實(shí)驗(yàn)側(cè)股靜脈均發(fā)生靜脈血栓，100% 建模成功；取材時(shí)發(fā)現(xiàn)部分新西蘭兔實(shí)驗(yàn)側(cè)皮膚可見明顯靜脈血管曲張 (圖 1)。

圖1 兔股靜脈血栓模型制備及取材 a：分離股神經(jīng)、股動(dòng)脈、股靜脈，無(wú)損傷血管夾夾閉股靜脈近端，并向遠(yuǎn)端管腔注射凝血酶；b：保留無(wú)損傷血管夾觀察 2 h 后可見股靜脈管腔內(nèi)生成暗黑色血栓；c：股靜脈做不完全結(jié)扎，縮窄管腔至 0.45 mm 頭皮針針頭粗細(xì)；d：逐層縫合切口；e：取材時(shí)切口愈合情況，部分新西蘭兔實(shí)驗(yàn)側(cè)皮膚可見明顯靜脈曲張；f：術(shù)后 3 天時(shí)取材股靜脈血栓大體表現(xiàn)；g：血栓股靜脈血管段標(biāo)本 (A，股動(dòng)脈；B，股神經(jīng)；C，股靜脈；D，無(wú)損傷血管夾；E，暗黑色血栓形成；F，0.45 mm 頭皮針針頭)Fig.1 Preparation and sampling of rabbit femoral vein thrombosis model a: Blunt dissection and full exposure of the femoral artery,femoral vein and femoral nerve;block the blood flow of femoral vein;b: Black thrombus were observed clearly;C: The femoral vein was narrowed to the thickness of 0.45mm;d: Incision after the suture;e: Healed incision;f: The model of femoral vein thrombus 3 days after operation;g: Specimens of femoral vein with thrombosis (A: Femoral artery;B: Femoral nerve;C: Femoral vein;D: Atraumatic bulldog clamp;E: Thrombus;F: 0.45 mm scalp needle)

二、超聲影像學(xué)結(jié)果

T 組與 P 組 6 個(gè)時(shí)間點(diǎn)彩色多普勒超聲檢測(cè)的管徑值詳見表 2，兩組的管徑變化趨勢(shì)如圖 2 所示。從圖表中可以直觀看出，術(shù)前兩組間管徑平均值基線一致，兩組管徑變化均為建模后 1 天、3 天時(shí)較術(shù)前管徑顯著增粗，建模后 3～7 天時(shí)管徑逐漸回縮，建模后 7～14 天時(shí)管徑基本回縮至建模前水平。比較 T 組和 P 組管徑變化結(jié)果顯示：建模后 1 天時(shí) T 組管徑平均值較 P 組稍大，但建模后 1 天、3 天、5 天、7 天、14 天時(shí)兩組間的管徑值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞ 0.05)。

圖2 各組股靜脈管徑變化趨勢(shì)Fig.2 Trend of femoral vein diameter in each group

表2 各組股靜脈管徑比較 (mm)Tab.2 Comparison of femoral vein diameter in each group (mm)

超聲圖像表現(xiàn)兩組血栓情況未見明顯差異，術(shù)后 1 天及術(shù)后 3 天時(shí)各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物股靜脈血管腔內(nèi)充滿均勻?qū)嵸|(zhì)性低回聲影，未見明顯血流信號(hào)通過，超聲探頭加壓管腔時(shí)不能完全壓閉靜脈腔；術(shù)后 5 天 時(shí)實(shí)驗(yàn)側(cè)股靜脈管腔內(nèi)充滿低回聲影，部分區(qū)域可見弱強(qiáng)回聲影，靜脈管壁略增厚，未見明顯血流信號(hào)，加壓管腔時(shí)不能完全壓閉靜脈腔；術(shù)后 7 天時(shí)靜脈管腔內(nèi)可見少量血流信號(hào)通過，血栓信號(hào)較前回聲增強(qiáng)，加壓管腔時(shí)不能完全壓閉；術(shù)后 14 天時(shí)股靜脈管腔內(nèi)見強(qiáng)弱不均勻回聲信號(hào)，可見部分血流信號(hào)通過，加壓管腔不能完全壓閉 (圖 3)。

圖3 各組股靜脈血栓彩色多普勒超聲圖像表現(xiàn)Fig.3 Color doppler ultrasonography of femoral vein thrombosis in each group

三、組織病理學(xué)結(jié)果

HE 染色顯微鏡下觀察可見，兩組間血栓形成、機(jī)化及再通過程均未見明顯差異。血栓形成術(shù)后 1 天時(shí)，T 組與 P 組均為紅色血栓充滿股靜脈管腔，血栓由大量紅細(xì)胞和少量白細(xì)胞組成，血栓內(nèi)未見纖維蛋白機(jī)化現(xiàn)象，血栓與血管壁未見明顯粘連。血栓形成術(shù)后 3 天時(shí)，P 組血栓開始有少量纖維蛋白機(jī)化，血栓周圍可見少量?jī)?nèi)皮細(xì)胞脫落；相比之下，T 組較 P 組血栓纖維蛋白機(jī)化程度稍增加，血栓與血管壁同樣未見明顯粘連。血栓形成術(shù)后 5 天時(shí)，T 組與 P 組均可見血栓纖維蛋白機(jī)化程度進(jìn)一步增加，可見肉芽組織長(zhǎng)入血栓內(nèi)，血栓失水后開始回縮裂解，血栓與管壁有部分粘連，兩組間未見明顯差異。血栓形成術(shù)后 7 天時(shí)，T 組與 P 組兩組血栓均明顯機(jī)化，血栓與管壁可見明顯粘連。同時(shí)，血栓被肉芽組織生長(zhǎng)包裹，靜脈周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。血栓形成術(shù)后 14 天時(shí)，兩組血栓內(nèi)明顯機(jī)化，肉芽組織明顯深入血栓內(nèi)部，血栓已被肉芽組織取代，血栓與管壁嚴(yán)重粘連，血栓纖維蛋白機(jī)化程度及新生肉芽組織血栓再通過程未見明顯差異 (圖 4)。

圖4 各組股靜脈血栓病理學(xué)表現(xiàn) a～f：依次為 T 組術(shù)后 1 天血栓情況 (HE × 4)，術(shù)后 1 天、3 天、5 天、7 天、14 天血栓轉(zhuǎn)歸情況 (HE × 10)；g～l：依次為 P 組術(shù)后 1 天血栓情況 (HE × 4)，術(shù)后 1 天、3 天、5 天、7 天、14 天血栓轉(zhuǎn)歸情況 (HE × 10)Fig.4 Pathological of femoral vein thrombosis in each group a -f: The images of the femoral venous specimens of T-group 1 day after modeling (HE × 4) and 1,3,5,7 and 14 days after modeling (HE × 10);g -l: The images of the femoral venous specimens of P-group 1 day after modeling (HE × 4) and 1,3,5,7 and 14 days after modeling (HE × 10)

討 論

TXA 作為一種抗纖溶止血?jiǎng)壳耙褟V泛應(yīng)用于骨科、心胸外科、泌尿外科、婦產(chǎn)科等的圍術(shù) 期[3-10]。TXA 因具有減少圍術(shù)期出血量和降低圍術(shù)期輸血風(fēng)險(xiǎn)的優(yōu)勢(shì)，逐漸成為臨床止血?jiǎng)┑难芯繜狳c(diǎn)。使用 TXA 的并發(fā)癥包括血栓形成 (DVT、PE、缺血性腦栓塞、心肌梗死等)、癲癇發(fā)作、視物模糊、低血壓、胃腸道反應(yīng)等，是影響外科應(yīng)用 TXA 的關(guān)鍵因素。TXA 在圍術(shù)期使用的最為顧忌的一點(diǎn)是，尤其是高劑量時(shí)，理論上會(huì)增加血栓事件發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，包括 DVT、PE、心肌梗死、缺血性腦梗死等[11-13]。Myers 等[14]研究認(rèn)為 TXA 是創(chuàng)傷后靜脈血栓形成的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Nishihara 等[15]研究結(jié)果顯示 TXA 可增加全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后 7 天的 DVT 發(fā)生率。但多數(shù)研究并不認(rèn)為 TXA 有此風(fēng)險(xiǎn)，其結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，TXA 對(duì)凝血酶原時(shí)間 (prothrombin time，PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間 (activated partial thromboplastin time，APTT)、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值 (international normalized ratio，INR) 等值并無(wú)明顯影響，其作用機(jī)制只是抑制纖溶，并不促進(jìn)凝血功能[16-19]。Benoni 等[20]研究認(rèn)為 TXA 強(qiáng)大的抗纖溶止血作用只局限在手術(shù)部位，而對(duì)外周血液的纖溶及凝血無(wú)明顯影響。目前，多項(xiàng)研究認(rèn)為 TXA 減少失血的作用具有劑量依賴性，高劑量使用 TXA 時(shí)會(huì)進(jìn)一步減少圍術(shù)期出血量和降低圍術(shù)期輸血率[21-23]。截至目前，尚沒有足夠的證據(jù)表明高劑量 TXA 對(duì)血栓栓塞事件的發(fā)生沒有影響。

DVT 作為一種靜脈腔內(nèi)血栓產(chǎn)生而引起的血流障礙性疾病，于下肢深靜脈多發(fā)，是圍術(shù)期常見的血栓栓塞并發(fā)癥，它可能引起 PE 而有生命危險(xiǎn)[24]。由于人體自然狀態(tài)下靜脈血栓發(fā)生不可控及實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則，針對(duì)血栓研究的臨床試驗(yàn)受限，且體外血栓形成過程與體內(nèi)自然血栓形成存在很大差異，因此血栓形成的動(dòng)物模型是目前研究血栓發(fā)生、發(fā)展及藥物對(duì)于血栓影響的重要研究工具及評(píng)價(jià)方法[25-27]。臨床上雖然將血管造影術(shù)作為診斷 DVT 的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但由于其費(fèi)用高、有創(chuàng)操作等原因限制了其在臨床當(dāng)中的普遍使用，因此臨床當(dāng)中多建議使用簡(jiǎn)單、高效、無(wú)創(chuàng)的方式診斷 DVT[28-30]。文獻(xiàn)報(bào)道，彩色多普勒超聲診斷靜脈血栓的靈敏度為 89%～96%，特異度為 94%～100%[29-31]。

本研究首次通過彩色多普勒超聲和組織病理學(xué)，研究靜脈注射高劑量 TXA 對(duì)新西蘭兔股靜脈血栓模型血栓形成的影響，探討術(shù)前使用高劑量 TXA 的安全性。在本實(shí)驗(yàn)中，如以往報(bào)道中所述，股靜脈血栓在阻斷股靜脈血流并注射凝血酶溶液后逐漸開始形成[26,32]。“縮窄法+凝血酶注射法”成功建立了股靜脈血栓模型，表明該方法是建立血栓模型的一種有效方法。血栓形成后，由于血栓遠(yuǎn)端血管內(nèi)壓力增加，且未形成側(cè)支循環(huán)，早期股靜脈直徑明顯增大。有多篇報(bào)道通過觀察下肢 DVT 形成的自然過程發(fā)現(xiàn)，早期靜脈腔明顯增粗，遠(yuǎn)端肢體血流緩慢。但在亞急性期和慢性期，由于血栓再通和側(cè)支循環(huán)的逐步建立，導(dǎo)致靜脈腔逐漸縮回，血流逐漸增加，血管內(nèi)壓力降低[33-34]。之前的一項(xiàng)研究結(jié)果提示，家兔股靜脈血栓形成 3 天后血栓開始溶解、再通[29]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之一致，術(shù)后 1 天、3 天時(shí)由于血栓阻塞股靜脈使血液瘀滯，尚無(wú)有效側(cè)支循環(huán)形成進(jìn)行血管減壓，血管管徑明顯增粗；而術(shù)后 3～7 天時(shí)由于血栓開始機(jī)化、再通、側(cè)支循環(huán)逐漸建立，血管逐管徑漸回縮，術(shù)后 7～14 天時(shí)管徑基本恢復(fù)至術(shù)前狀態(tài)，在建模 7～14 天后，直徑幾乎縮回到術(shù)前水平。對(duì)比兩組發(fā)現(xiàn)，T 組使用高劑量 TXA 后相較于 P 組，其管徑變化趨勢(shì)基本一致，高劑量 TXA 并不影響血栓的機(jī)化、再通和側(cè)支循環(huán)的建立。這一結(jié)論與臨床研究結(jié)果一致，即圍術(shù)期靜脈應(yīng)用高劑量 TXA 并不會(huì)增加血栓事件的發(fā)生率[21-23]。類似的，對(duì)比 T 組和 P 組的組織病理發(fā)現(xiàn)，兩組均表現(xiàn)為術(shù)后 1 天血栓充滿血管腔，血栓未見明顯機(jī)化，術(shù)后 3 天時(shí)血栓開始機(jī)化，至術(shù)后 14 天時(shí)，血栓明顯機(jī)化，血栓失水纖維蛋白回縮導(dǎo)致血栓逐漸裂解，新生肉芽組織包裹血栓并深入血栓內(nèi)部，這些有助于血栓的再通過程，其病理變化過程也未見明顯差異。

綜上所述，“縮窄法+凝血酶注射法”是建立兔股靜脈血栓模型的一種有效方法；與對(duì)照組相比，高劑量靜脈應(yīng)用 TXA 對(duì)血栓形成、機(jī)化及再通無(wú)明顯影響，表明圍術(shù)期靜脈 TXA 高劑量 50 mg/ kg 是安全的。本項(xiàng)研究由于條件限制，具有樣本量相對(duì)較小，觀察時(shí)間相對(duì)較短，在動(dòng)物體內(nèi)人為制作股靜脈血栓模型與人體術(shù)后自然狀態(tài)下形成下肢靜脈血栓存在差異等局限性，仍須進(jìn)一步驗(yàn)證。