基于席夫堿配體構(gòu)筑的LnⅢ2配合物的結(jié)構(gòu)、熒光性質(zhì)及生物活性

辛?xí)云G 陳鳳姣 李文鈺 王 捷楊 晨 李 敏 石 瑛＊, 王文敏＊,,

(1太原師范學(xué)院化學(xué)與材料學(xué)院，晉中 030619)

(2太原師范學(xué)院碳中和研究院，晉中 030619)

近年來(lái)，稀土配合物由于其新穎獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，在磁性[1?4]、發(fā)光[5?7]、催化[8?10]以及生物活性[11?13]等領(lǐng)域存在潛在的應(yīng)用價(jià)值而備受關(guān)注。在發(fā)光材料方面，一種優(yōu)良的發(fā)光材料應(yīng)在熒光分析中不僅具有高靈敏度，而且具有高選擇性[14]。稀土元素中的EuⅢ和TbⅢ作為代替放射性同位素和非同位素標(biāo)記的熒光探針具有很大的應(yīng)用潛力。TbⅢ已被廣泛用于研究DNA和生物體內(nèi)鎂離子的作用。稀土離子作為發(fā)光探針，不僅可用于研究生物分子和金屬離子結(jié)合部位和結(jié)構(gòu)類型[15]，還可用來(lái)研究特定的物理化學(xué)條件下蛋白質(zhì)具體的平衡構(gòu)象。根據(jù)配合物的結(jié)構(gòu)，一般可獲得配合物的中心離子的格位數(shù)、中心離子的局部對(duì)稱性、配位體形式電荷之和、直接與金屬離子鍵合水的數(shù)目及2個(gè)金屬離子間的距離等結(jié)構(gòu)信息[16]。使用稀土離子作為生物分子的熒光探針，具有量子產(chǎn)率高、Stokes位移大、發(fā)射峰窄、激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)理想及熒光壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)[17]。此外，可以通過(guò)熒光探針?lè)治龇椒▽?duì)某些含有特殊結(jié)構(gòu)的化合物進(jìn)行特異性檢測(cè)，因此熒光探針?lè)治龇椒ǖ膽?yīng)用相對(duì)于其他檢測(cè)方法更為廣泛[18]。

在生物活性方面，稀土配合物具有抑菌譜廣以及殺菌能力強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，將其作為殺菌與消炎藥物的效果較為顯著。據(jù)大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，稀土金屬離子與席夫堿組合而成的稀土配合物具有一定的生物活性，能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)、抗病毒以及抗腫瘤，由于協(xié)同效應(yīng)，稀土配合物的生物活性比席夫堿化合物更強(qiáng)[19?20]。2017 年 Yousif和 Majeed 等[21]研究了稀土席夫堿配合物的抗菌活性。研究表明，稀土席夫堿配合物具有良好的生物活性，特別是抑菌活性。席夫堿化合物具有豐富的配位原子和多種配位模式，因此稀土席夫堿配合物的合成比較靈活。近幾年，關(guān)于稀土配合物在生命科學(xué)領(lǐng)域的研究不斷深入，稀土配合物與DNA相互作用的研究有不少報(bào)道[22?24]。DNA分子具有平行堆積的堿基聚合的陰離子磷酸骨架和2條核苷酸鏈螺旋形成的大溝和小溝，構(gòu)成了金屬配合物與DNA相互結(jié)合的位點(diǎn)，其結(jié)合方式可分為共價(jià)結(jié)合和非共價(jià)結(jié)合，非共價(jià)結(jié)合又可分為插入結(jié)合、溝面結(jié)合和靜電結(jié)合。金屬配合物與DNA相互作用研究成為當(dāng)前生物無(wú)機(jī)化學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

基于以上研究背景，我們探索了一種有效的合成策略，通過(guò)設(shè)計(jì)與合成具有豐富配位點(diǎn)(N、O原子)和多種配位模式的多齒席夫堿配體(E)?N′?(3?乙氧基?2?羥基亞芐基)?3?羥基吡啶甲酰肼(H2L，圖1)，與稀土鹽Ln(acac)3·2H2O(Ln=Tb、Ho、Er；acac-=乙酰丙酮根)反應(yīng)，構(gòu)筑了3例結(jié)構(gòu)新穎的雙核稀土配合物1～3。通過(guò)X射線單晶衍射、元素分析、熱重分析和紅外光譜等分析手段對(duì)配合物進(jìn)行了表征。采用打孔抑菌圈法研究了配合物的抑菌活性。用熒光光譜儀測(cè)試了該類配合物的熒光發(fā)光性能。采用循環(huán)伏安(CV)法、紫外可見光譜法、瓊脂糖凝膠電泳法和熒光光譜法研究了該類配合物與DNA相互作用機(jī)理，為該類配合物在抗菌和光致發(fā)光領(lǐng)域的研究和應(yīng)用提供一定的依據(jù)。

圖1 配體H2L的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of H2L

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

3?乙氧基水楊醛、3?羥基?2?吡啶甲酰肼、2，4?戊二酮和六水合硝酸稀土鹽(Ln(NO3)3·6H2O)購(gòu)于安耐吉化學(xué)有限公司。常用溶劑(乙醇、乙腈、二氯甲烷、DMSO)購(gòu)于科密歐試劑有限公司。大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)、白色念珠菌(C.albicans)購(gòu)于北京陸橋科技有限公司。營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基成分生化試劑(分析純)購(gòu)于北京奧博興生物科技有限公司。三羥甲基氨基甲烷(Tris)、6X Glycerol Gel Loading Buffer、小牛胸腺DNA(CTDNA)和溴化乙錠(EB)購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司。根據(jù)已報(bào)道的文獻(xiàn)中的方法合成了多齒席夫堿配體H2L[25?26]。按照文獻(xiàn)[27]報(bào)道的方法合成了Ln(acac)3·2H2O(Ln=Tb、Ho、Er)。

配合物1～3的元素分析是在Perkin?Elmer 2400分析儀上進(jìn)行。用Bruker Tenor 27分光光度計(jì)測(cè)試紅外光譜數(shù)據(jù)。粉末X射線衍射(PXRD)數(shù)據(jù)使用Rigaku Ultima Ⅳ儀器測(cè)試，采用CuKα射線為入射光源(λ=0.154 056 nm)，掃描速度為 5(°)·min-1，掃描范圍2θ=5°～50°，工作電壓為40 kV，電流為25 mA。使用NETZSCHTG 409PC熱重分析儀記錄熱重分析數(shù)據(jù)。紫外可見光譜測(cè)試在PERSEE TU?1950型紫外可見分光光度計(jì)上進(jìn)行。熒光光譜測(cè)試在港東科技的F?320型熒光光譜儀上進(jìn)行。生物活性試驗(yàn)采用YXQ?LS?30SII立式滅菌器、LRH?150F生化培養(yǎng)箱、JB?CJ?1000FX超凈工作臺(tái)、辰華CHI750E電化學(xué)工作站。

1.2 配體H2L和配合物1～3的合成

稱取 3?羥基?2?吡啶甲酰肼(20.0 mmol，3.08 g)、3?乙氧基水楊醛(20.0 mmol，3.32 g)于10 mL甲醇中，室溫下攪拌4 h，抽濾收集白色沉淀物，用甲醇洗滌。粗品在真空環(huán)境下干燥24 h，得到配體H2L(圖2)。元素分析按 C15H15N3O4的計(jì)算值(% )：C，59.74；H,4.97；N，13.93。實(shí)驗(yàn)值(% )：C，59.69；H，4.90；N，13.94。 IR(KBr，cm-1)：3 287(m)，3 072(w)，2 947(w)，2 931(w)，2 891(w)，2 362(m)，1 661(s)，1 627(m)，1 611(m)，1 551(m)，1 532(m)，1 489(m)，1 446(s)，1 415(m)，1 354(w)，1 337(m)，1 278(w)，1 247(s)，1 205(s)，1 187(w)，1 137(w)，1 095(w)，1 072(m)，949(w)，910(w)，874(w)，817(w)，751(s)，711(w)，643(w)，533(w)(圖S1，Supporting information)。1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ11.61(s，1H)，10.86(s，1H)，8.43(s，1H)，8.09(dd，J=4.2，1.5 Hz，1H)，7.39(qd，J=8.5，2.8 Hz，2H)，7.26(s，1H)，7.06～6.75(m，3H)，4.14(q，J=7.0 Hz，2H)，1.48(t，J=7.0 Hz，3H)(圖S2)。

圖2 配體H2L的合成路線Fig.2 Synthetic route of H2L

配合物1～3的合成方法相似，以下以1的合成為例說(shuō)明。稱取 Tb(acac)3·2H2O(0.025 mmol，0.021 g)、H2L(0.025 mmoI，0.008 g)加入到體積為20 mL的玻璃小瓶中，加入15 mL CH3OH/CH2Cl2/CH3CN(3∶1∶1，V/V)混合溶液后室溫下攪拌30 min。在80℃下恒溫反應(yīng)24 h。然后冷卻到室溫，得到了適合單晶衍射的黃色塊狀晶體。配合物1～3的合成方法如圖3所示。

圖3 配合物1～3的合成路線Fig.3 Synthetic routes of complexes 1?3

[Tb2(acac)2(L)2(C2H5OH)2](1)的產(chǎn)率為 38% (基于Tb(acac)3·2H2O)。元素分析按 C44H52Tb2N6O14的計(jì)算值(% )：C，43.75；H，4.30；N，6.96。實(shí)驗(yàn)值(% )：C，43.76；H，4.29；N，6.95。IR(KBr，cm-1)：3 427(m)，2 983(w)，2 953(w)，2 927(w)，2 897(w)，2 874(w)，2 365(w)，1 600(s)，1 568(m)，1 551(m)，1 537(m)，1 459(s)，1 406(m)，1 383(w)，1 362(w)，1 343(w)，1 287(s)，1 248(s)，1 223(m)，1 197(s)，1 164(w)，1 076(s)，1 029(w)，992(w)，943(w)，914(w)，883(w)，860(w)，833(w)，797(w)，748(s)，721(w)，665(w)，615(w)，586(m)，540(m)(圖S1)。

[Ho2(acac)2(L)2(C2H5OH)2](2)的產(chǎn)率為38% (基于Ho(acac)3·2H2O)。元素分析按C44H52Ho2N6O14的計(jì)算值(% )：C，43.32；H，4.26；N，6.89。實(shí)驗(yàn)值(% )：C，43.33；H，4.25；N，6.90。IR(KBr，cm-1)：3 427(m)，2 983(w)，2 953(w)，2 378(w)，1 600(s)，1 568(m)，1 551(m)，1 537(m)，1 461(w)，1 406(m)，1 383(w)，1 362(w)，1 343(w)，1 281(s)，1 254(w)，1 223(m)，1 197(s)，1 164(w)，1 155(m)，1 135(w)，1 082(s)，1 029(w)，943(w)，897(w)，883(w)，860(w)，833(w)，797(w)，745(w)，721(w)，665(w)，615(w)，586(m)，543(m)(圖 S1)。

[Er2(acac)2(L)2(C2H5OH)2](3)的產(chǎn)率為 39% (基于Er(acac)3·2H2O)。元素分析按 C44H52Er2N6O14的計(jì)算值(% )：C，43.15；H，4.25；N，6.86。實(shí)驗(yàn)值(% )：C，43.14；H，4.26；N，6.87。IR(KBr，cm-1)：3 427(m)，2 983(w)，2 953(w)，2 378(w)，1 600(s)，1 568(m)，1 551(m)，1 537(m)，1 461(w)，1 406(m)，1 383(w)，1 362(w)，1 343(w)，1 281(s)，1 254(w)，1 223(m)，1 197(s)，1 164(w)，1 118(s)，1 029(w)，992(w)，943(w)，914(w)，883(w)，860(w)，833(w)，797(w)，745(s)，721(w)，665(w)，619(s)，583(m)，543(m)(圖 S1)。

1.3 配合物1～3晶體結(jié)構(gòu)的測(cè)定

選取形狀規(guī)則、大小合適的配合物1～3的固態(tài)單晶樣品，其大小為0.39 mm×0.26 mm×0.16 mm(1)、0.36 mm×0.25 mm×0.13 mm(2)和0.36 mm×0.26 mm×0.21 mm(3)。將單晶樣品放在CCD單晶衍射儀上測(cè)定并收集晶體衍射數(shù)據(jù)，測(cè)試配合物1和配合物3單晶采用MoKα射線(λ=0.071 073 nm)為入射光源，配合物2單晶采用CuKα射線(λ=0.154 178 nm)為入射光源，在150 K時(shí)，以ω?φ的掃描方式收集衍射點(diǎn)。晶體結(jié)構(gòu)用SHELXS?97[28]中的直接法解出，并用SHELXL?97[29]對(duì)結(jié)構(gòu)中的非氫原子坐標(biāo)及其各向異性熱參數(shù)進(jìn)行基于F2的全矩陣最小二乘法修正至收斂。所有氫原子均為理論加氫并按跨式模型(riding model)精修，其Uij為其母原子Uij的 1.2 倍～1.5倍。由上述方法得到的配合物1～3的主要晶體學(xué)數(shù)據(jù)列于表1，重要的鍵長(zhǎng)和鍵角見表S1～S3。

表1 配合物1～3的晶體學(xué)數(shù)據(jù)和精修參數(shù)Table 1 Crystallographic data and structure refinements for complexes 1?3

CCDC：2183865，1；2183867，2；2183869，3。

1.4 生物活性測(cè)定

1.4.1 抑菌圈試驗(yàn)

將配合物1～3用DMSO分別配成溶液，采用打孔抑菌圈法[30?31]測(cè)定了配合物對(duì)4種細(xì)菌(E.coli、B.subtilis、S.aureus、C.albicans)的抑菌活性。將活化好的細(xì)菌稀釋成不同濃度的菌液，移取100 μL稀釋后的各不同濃度的菌液，在LB固體培養(yǎng)基上涂布均勻，放置在37℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h左右，最終確定合適的菌液濃度為8×104CFU·mL-1，用來(lái)測(cè)試抑菌圈。用已滅菌的4 mm不銹鋼管在平板上打孔，孔內(nèi)注入60 μL抗菌劑(0.01 g·mL-1)，4 ℃下預(yù)擴(kuò)散2 h，在37℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h左右，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑大小。

采用微量液體培養(yǎng)基倍比稀釋法測(cè)定配合物對(duì)不同菌株的最小抑菌濃度(minimal inhibitory cconcentration，MIC)值(4種供試細(xì)菌都用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng))。將不同濃度的抑菌劑混合液溶解于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后接種細(xì)菌，通過(guò)細(xì)菌的生長(zhǎng)與否，確定抑菌劑抑制受試菌生長(zhǎng)的最低濃度，即 MIC 值[32?37]。

1.4.2 配合物1～3與DNA相互作用

1.4.2.1 紫外可見光譜法

稱 取 Tris(0.302 5 g)、HCl(6 mol·L-1，0.55 mL)、NaCl(0.146 3 g)，加蒸餾水配制 Tris?HCl/NaCl(500 mL，5 mmol·L-1)緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH=7.25。取1.1 mL CTDNA 母液(2 μg·mL-1)，用紫外可見光譜測(cè)定其A260/A280，使其在 1.8～2.0 之間。以 Tris?HCl/NaCl(5 mmol·L-1)緩沖液(pH=7.25)為參比溶液，以 CTDNA溶液為空白對(duì)照。將配合物1～3用Tris?HCl/NaCl緩沖溶液稀釋，濃度為 0.45、0.22、0.11、0.055、0.028、0.014 mmol·L-1。 將 10 μL 配 合 物 加 入 到 3 mL CTDNA溶液中，在190～500 nm處測(cè)定其紫外可見吸收光譜。

1.4.2.2 CV法

CV法測(cè)試中，工作電極為玻碳電極，參比電極為飽和甘汞電極，對(duì)電極為鉑絲電極。掃描電位范圍為-0.15～0.8 V，掃描速度為0.1 V·s-1，采樣間隔為0.001 V，靜置時(shí)間為2 s，樣品濃度為0.45 mmol·L-1，DNA的質(zhì)量濃度為2 μg·mL-1。

1.4.2.3 凝膠電泳法

向1.5 mL Eppendorf管中分別加入1 μL的不同濃度梯度的配合物溶液(0.4、0.2、0.1、0.05、0.025 mmol·L-1)、2 μL的pBR322DNA 溶液(0.5 mg·mL-1)、7 μL的Tris?HCl/NaCl反應(yīng)緩沖溶液(5 mmol·L-1，pH=7.25)，使反應(yīng)體系總體積保持10 μL，高速離心混合均勻，放置于37℃恒溫槽避光反應(yīng)20 min。隨后恒溫反應(yīng)20 min，加入6X Glycerol Gel Loading Buffer終止反應(yīng)，瓊脂糖凝膠電泳20 min后分析結(jié)果。

1.4.2.4 熒光光譜法

熒光光譜法測(cè)試中，CTDNA和EB的質(zhì)量濃度分別穩(wěn)定在 2 μg·mL-1和 0.06 mg·mL-1。按體積比1∶1充分混合，避光放置1 h。向樣品池中加入3 mL EB?CTDNA混合溶液，在285 nm激發(fā)波長(zhǎng)下，在540～700 nm范圍內(nèi)測(cè)量其熒光發(fā)射光譜。然后，將配合物溶液(0.45 mmol·L-1)每次滴加1 μL 到EB?CTDNA體系中，滴入后混合均勻，室溫孵育1 min，測(cè)量其熒光發(fā)射光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 配合物1～3晶體結(jié)構(gòu)分析

單晶X射線衍射數(shù)據(jù)表明，配合物1～3是同構(gòu)的，因此以配合物1為例進(jìn)行具體的晶體結(jié)構(gòu)描述(圖4)。1屬于單斜晶系P21/c空間群，其結(jié)構(gòu)主要由2個(gè)TbⅢ離子、2個(gè)乙酰丙酮根(acac-)、2個(gè)L2-及2個(gè)C2H5OH組成。中心的Tb1離子是八配位(圖5a)，與Tb1離子配位的6個(gè)氧原子來(lái)自2個(gè)L2-的3個(gè)氧原子(O3、O2和O2a)、1個(gè)乙醇分子的O7氧原子和1個(gè)acac-的2個(gè)氧原子(O5和O6)，2個(gè)氮原子來(lái)自2個(gè)L2-(N1和N3)。如圖5b所示，八配位的TbⅢ離子呈三角形十二面體配位構(gòu)型，根據(jù)SHAPE 2.0軟件計(jì)算得出(表S4)。L2-和acac-的配位模式如圖6所示，L2-通過(guò)多齒螯合方式包裹2個(gè)中心TbⅢ離子，acac-通過(guò)雙齒螯合方式連接每個(gè)中心TbⅢ離子。2個(gè)中心TbⅢ離子通過(guò)2個(gè)L2-的2個(gè)μ2?O(O2和O2a)橋聯(lián)形成一個(gè)平行四邊形的Tb2O2核心。在Tb2O2核心結(jié)構(gòu)中，Tb1…Tb1a間的距離為 0.397 11(6)nm，Tb1—O2—Tb1a和 O2—Tb1—O2a的鍵角分別是112.03(17)°和 67.97(17)°，在 1 中，Tb—O 的鍵長(zhǎng)為0.2357(5)～0.2391(5)nm，Tb—N的鍵長(zhǎng)為0.2485(6)～0.256 3(6)nm。 O—Tb—O 鍵角在 67.97(17)°～146.28(16)°范圍內(nèi)，O—Tb—N 鍵角在 63.63(17)°～113.32(17)°范圍內(nèi)，所有鍵長(zhǎng)和鍵角都在正常范圍內(nèi)，與文獻(xiàn)報(bào)道的雙核Tb的鍵角一致[38?40]。

圖4 配合物1的橢球率50% 的晶體結(jié)構(gòu)圖Fig.4 Molecular structure of complex 1 shown with 50% probability displacement ellipsoids

圖5 配合物1中Tb2的配位環(huán)境(a)和Tb2離子的幾何多面體(b)Fig.5 Coordination environment of Tb2(a)and geometric polyhedron of Tb2ions(b)in complex 1

圖6 L2-(a)和acac-(b)的配位模式Fig.6 Coordination modes of L2-(a)and acac-(b)

2.2 配合物1～3的PXRD和熱重分析

為了檢驗(yàn)配合物1～3的相純度，在室溫下對(duì)3個(gè)配合物的單晶樣品分別進(jìn)行了PXRD測(cè)試。將測(cè)試得到的PXRD數(shù)據(jù)與通過(guò)單晶結(jié)構(gòu)模擬計(jì)算的理論值進(jìn)行了對(duì)比，如圖S3所示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖與擬合的PXRD圖主要峰的位置和形狀基本吻合，表明收集的1～3的晶體樣品具有較高的相純度。

為了進(jìn)一步探究配合物1～3的熱穩(wěn)定性，在N2保護(hù)下，對(duì)它們的晶體粉末進(jìn)行熱重測(cè)試(溫度范圍20～800℃，升溫速率10℃·min-1)，其熱重曲線如圖S4所示。隨著溫度的升高，1～3的失重過(guò)程相似，故僅對(duì)3進(jìn)行詳細(xì)描述。在80℃之前3可以穩(wěn)定存在，80～207℃之間失重7.31%，對(duì)應(yīng)失去2個(gè)配位的乙醇分子(理論值為7.53% )。207～350℃之間失重16.43%，對(duì)應(yīng)失去2個(gè)配位的輔助配體acac-離子(理論值為16.36% )。隨后，3的骨架在350～800℃的溫度范圍內(nèi)逐漸分解。

2.3 配合物1～3的紫外可見吸收光譜

室溫下，在甲醇溶液中獲得了多齒席夫堿配體H2L、Tb(acac)3·2H2O和配合物1～3的紫外可見光譜(圖S5)?？梢郧宄赜^察到H2L分別在206、236和323 nm處有吸收帶，歸屬于芳香環(huán)和C=N的n→π*和π→π*躍遷。Tb(acac)3·2H2O 在 202、241和290 nm處出現(xiàn)3個(gè)吸收帶，這是acac-中羰基(C=O)的π→π*躍遷引起的。1～3表現(xiàn)出相似的吸收帶，可以觀察到在336 nm處的吸收帶歸屬于席夫堿配體L2-，在202和239 nm處的吸收帶，應(yīng)歸屬于acac-輔助配體。此外對(duì)比1～3與H2L的紫外可見譜圖可見，300～338 nm處的吸收帶發(fā)生了紅移，這可能是由于H2L與稀土離子的配位效應(yīng)。

2.4 熒光性質(zhì)

如圖7所示，配體H2L用260 nm波長(zhǎng)激發(fā)時(shí)，在518 nm處有特征發(fā)射峰。在296 nm波長(zhǎng)激發(fā)下，配合物1的發(fā)射光譜表現(xiàn)出中心離子TbⅢ的特征發(fā)射。1在490、545、585和620 nm處觀察到4個(gè)特征發(fā)射峰，對(duì)應(yīng) TbⅢ離子5D4→7FJ(J=6、5、4、3)的躍遷。1在乙腈溶液中測(cè)得的熒光壽命是139 μs(圖S6)。在260 nm波長(zhǎng)激發(fā)下，配合物2和3分別在532和530 nm處觀察到一個(gè)特征發(fā)射峰，均可歸因于配體H2L的熒光發(fā)射。2和3的發(fā)光均為配體發(fā)光，但最強(qiáng)發(fā)射峰發(fā)生紅移且強(qiáng)度增大，說(shuō)明中心離子對(duì)配體的發(fā)光有敏化作用。

圖7 室溫下配合物1～3和配體H2L的固體熒光譜圖Fig.7 Solid?state fluorescent spectra of complexes 1?3 and ligand H2L at room temperature

2.5 抑菌活性分析

根據(jù)文獻(xiàn)[41?43]報(bào)道的方法，采用打孔抑菌圈法和MIC法測(cè)定了配合物、配體H2L以及稀土離子的抗菌活性。圖S7是配合物1～3對(duì)E.coli、B.subtilis、S.aureus、C.albicans的抑菌圈圖。圖8數(shù)據(jù)顯示，DMSO對(duì)4種細(xì)菌的抑菌圈小于7 mm，沒(méi)有抑菌作用；稀土離子對(duì)E.coli的抑菌作用略強(qiáng)于其他3種細(xì)菌；H2L和1～3對(duì)4種細(xì)菌具有良好的抑菌作用，尤其對(duì)C.albicans的抑菌作用略強(qiáng)于其他3種細(xì)菌。1～3對(duì)4種細(xì)菌的抑菌圈均大于20 mm，表明1～3的抑菌作用強(qiáng)于單一配體或稀土離子，這可能是配體和稀土離子之間的協(xié)同作用導(dǎo)致的[44]。用MIC法測(cè)定的抑菌試驗(yàn)結(jié)果如表S5所示。結(jié)果表明，1～3對(duì)4種測(cè)試菌的MIC低于50 μg·mL-1，這也說(shuō)明1～3的抑菌效果強(qiáng)于配體和稀土離子。

圖8 配合物1～3、配體H2L及Ln(acac)3·2H2O(Ln=Tb、Ho、Er)的抑菌活性圈直徑Fig.8 Antibacterial activity circle diameters of complexes 1?3,ligand H2L,and Ln(acac)3·2H2O(Ln=Tb,Ho,Er)

2.6 配合物1～3與DNA相互作用

2.6.1 紫外可見光譜法分析

紫外可見吸收光譜法是研究小分子與核酸相互作用機(jī)制的一種簡(jiǎn)單而常用的方法[45?48]。由于DNA分子中嘌呤堿基和嘧啶堿基的共軛雙鍵的影響，DNA分子在240～290 nm處會(huì)有較強(qiáng)的紫外吸收帶，最大吸收峰在260 nm左右，而金屬配合物也有吸收帶，因此，可以根據(jù)配合物與DNA分子相互作用前后譜帶的變化來(lái)判斷配合物的作用方式。從圖9可以看出，1～3與CTDNA相互作用后，配合物?CTDNA復(fù)合物體系的紫外吸收光譜比單獨(dú)的CTDNA有明顯的紅移，隨著濃度的增大，紅移幅度也增大，而且在260 nm處發(fā)生減色效應(yīng)，2和3的減色效應(yīng)最明顯。由這種現(xiàn)象可以推斷1～3與DNA發(fā)生插入結(jié)合。

圖9 配合物1～3與CTDNA相互作用的紫外光譜圖Fig.9 UV Spectra for the interaction between complexes 1?3 and CTDNA

2.6.2 CV法分析

根據(jù)加入DNA前后配合物電化學(xué)性質(zhì)的變化，可以判斷配合物與DNA的相互作用模式。當(dāng)配合物分子與DNA發(fā)生插入結(jié)合時(shí)，配合物的擴(kuò)散系數(shù)減小，導(dǎo)致其還原峰電流減小，配合物分子的CV曲線式量電位會(huì)正移；當(dāng)配合物與DNA中帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)靜電結(jié)合時(shí)，配合物分子的CV曲線式量電位會(huì)負(fù)移[49?51]。從圖10可以看出，配合物1～3的CV曲線式量電位正移，其中3的正移最明顯，這表明1～3與DNA可能發(fā)生了插入結(jié)合[52?54]。

圖10 配合物1～3與DNA相互作用的CV曲線Fig.10 CV curves for the interaction between complexes 1?3 and CTDNA

2.6.3 凝膠電泳法分析

當(dāng)配合物與超螺旋DNA相互作用時(shí)，共價(jià)的閉合DNA雙螺旋將被打開，DNA分子被切割成多個(gè)小分子DNA。凝膠電泳法可以揭示配合物引起的DNA分子結(jié)構(gòu)的變化。因?yàn)榕浜衔?～3是同構(gòu)的，我們選取2、3作為代表分析它們與pBR322DNA之間的相互作用。如圖S8所示，當(dāng)配合物與pBR322DNA反應(yīng)時(shí)，超螺旋pBRDNA條帶的亮度明顯比空白pBR322DNA低，可以很明顯看到pBR322DNA切割出另一條條帶，這表明超螺旋pBRDNA條帶的數(shù)量減少，并被切割成幾條相對(duì)分子質(zhì)量較低的DNA條帶。因此，配合物2、3與pBRDNA相互作用較強(qiáng)，與pBRDNA發(fā)生了較強(qiáng)的切割作用。

2.6.4 熒光光譜法分析

已知EB與DNA結(jié)合以后能發(fā)射熒光，可利用其與DNA的結(jié)合研究配合物與DNA之間作用機(jī)制。EB本身發(fā)射的熒光強(qiáng)度弱且與DNA的結(jié)合能力較強(qiáng)，配合物與DNA分子結(jié)構(gòu)發(fā)生特異性結(jié)合會(huì)引起熒光的部分猝滅現(xiàn)象[55?59]。由熒光光譜法實(shí)驗(yàn)可以計(jì)算配合物與DNA的結(jié)合常數(shù)進(jìn)而判斷二者間的作用力大小。根據(jù)Stern?Volmer方程[60]：I0/I=1+Ksqr，其中I0為未加配合物時(shí)EB?DNA體系的熒光強(qiáng)度，I為加入不同濃度的配合物后EB?DNA復(fù)合體系的熒光強(qiáng)度，r為配合物與DNA濃度之比，Ksq是猝滅常數(shù)，當(dāng)I0/I與r呈線性關(guān)系，Ksq可以由直線斜率求出，該常數(shù)可用于比較配合物分子與DNA的結(jié)合能力。圖11為配體H2L和3個(gè)配合物與EB?DNA復(fù)合體系的熒光猝滅圖，由Stern?Volmer方程擬合結(jié)果得到H2L和配合物1～3的Ksq分別為0.08、0.82、1.28和0.77，說(shuō)明1～3與DNA的作用強(qiáng)于配體H2L，配合物分子與DNA發(fā)生了插入結(jié)合。

圖11 配體H2L和配合物1～3對(duì)EB?DNA復(fù)合體系的熒光猝滅Fig.11 Fluorescence quenching of EB?DNA complex system by ligand H2L and complexes 1?3

3 結(jié)論

以多齒席夫堿H2L為配體與Ln(acac)3·2H2O(Ln=Tb、Ho、Er)反應(yīng)，設(shè)計(jì)、合成了3例新的雙核Ln配合物[Ln2(acac)2(L)2(C2H5OH)2](Ln=Tb(1)、Ho(2)、Er(3))。單晶X射線衍射結(jié)構(gòu)表明：中心LnⅢ離子通過(guò)2個(gè)μ2?O原子相互連接，形成一個(gè)平行四邊形的Ln2O2核心。采用抑菌圈法和最小抑菌濃度法研究了配合物1～3對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的抑制作用。結(jié)果表明，配合物的抑菌作用強(qiáng)于單一配體或稀土離子。用循環(huán)伏安法、紫外光譜法和熒光光譜法研究了配合物1～3與DNA的相互作用機(jī)理。研究結(jié)果對(duì)設(shè)計(jì)、合成新的抗菌金屬配合物藥物具有一定意義。

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