gC1qR在敗血癥中的表達及對敗血癥患者巨噬細胞焦亡和線粒體功能改變的影響

王丹 王巍

南京醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科，南京 210000

敗血癥是一種全身感染性疾病，具有高病死率的特點，據(jù)調(diào)查顯示，全球每年約有180萬人患病，其中病死人數(shù)就占30%，嚴重威脅著患者的生命健康，因此揭示敗血癥的病理機制、探索有效的治療方法已經(jīng)迫在眉睫［1］。目前，敗血癥的發(fā)病機制尚未有明確定論，但隨著進一步研究發(fā)現(xiàn)，敗血癥是致病菌及其毒素和代謝產(chǎn)物進入血流后激活并釋放炎癥介質(zhì)而引起的一系列連鎖反應過程，因此如何防止病毒入侵機體、抑制炎性反應是目前臨床工作的重中之重［2］。而固有免疫系統(tǒng)作為機體防御病原體的第一道防線，研究發(fā)現(xiàn)其不僅在清除病毒方面占有重要地位，還可通過免疫細胞在敗血癥炎性反應中發(fā)揮重要的調(diào)控作用［3］。巨噬細胞作為一種重要的固有免疫細胞，近年來越來越多的研究表明，巨噬細胞焦亡及線粒體功能的改變在敗血癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著必不可少的作用，因此其已經(jīng)成為目前醫(yī)學領(lǐng)域研究的熱點及焦點［4］。球狀C1q受體（globular C1q receptor，gC1qR）是一多功能蛋白質(zhì)分子，其表達于所有哺乳動物細胞，在調(diào)控病毒感染、先天免疫、炎性反應、細胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用，且前期研究中，我們用RNA測序及生物信息分析的方法在536個差異表達基因中篩選出gC1qR可能是敗血癥發(fā)生過程中調(diào)控細胞焦亡的關(guān)鍵分子［5］。因此，本文就gC1qR在敗血癥中的表達及對敗血癥患者巨噬細胞焦亡和線粒體功能改變的影響進行研究探討，為致病菌感染致敗血癥的發(fā)生防治提供新線索和潛在的干預靶標。

資料與方法

1.一般資料

選取2020年1月至2022年5月南京醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院的敗血癥患者60例為觀察組，另選取60例健康體檢者為對照組。所有研究對象及家屬均同意，并簽署同意書，本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批通過（2022-0109）。對照組男32例，女28例，年齡（47.23±20.51）歲；觀察組男30例，女30例，年齡（49.21±18.54）歲，病情極危重10例、危重31例、非危重19例；兩組研究對象的性別、年齡等一般資料比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

2.入選標準

（1）納入標準：經(jīng)確診符合敗血癥臨床診斷標準的患者；年齡18～70歲并有平穩(wěn)生命體征的患者；血液細菌培養(yǎng)呈陽性且體溫增高的患者；簽署同意書的患者。（2）排除標準：有嚴重肝腎、心腦血管疾病的患者；合并免疫系統(tǒng)疾病的患者；嚴重精神疾病、活動期癲癇的患者；合并腫瘤和造血系統(tǒng)等嚴重原發(fā)疾病的患者；哺乳期、妊娠期婦女。

3.試驗儀器及試劑

實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）儀（型號：CFX96，上海土森視覺有限公司）；PowerPacTM基礎(chǔ)電泳儀（型號：164-5051，美國 Bio-Rad公司）；RT-qPCR試劑盒（貨號：7000，美國 ABI 公司）；Trizol試劑（貨號：Invitrogen，上海文韌有限公司）；cDNA 第一鏈合成試劑盒（貨號：XY-TE-0738，上海烜雅有限公司）；SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒（貨號：KGP113，江蘇凱基有限公司）；Lipofectamine2000（貨號：YT1317，北京伊塔有限公司）；雪膽乙素（貨號：YG11510，上海韻泰有限公司）；PI染色液（貨號：SY1196，北京伊塔有限公司）；Hoechst 33342染色液（貨號：PR1856，北京普非有限公司）；倒置熒光顯微鏡（型號：BM4000，上海玉研有限公司）；三磷酸腺苷（ATP）檢測試劑盒（貨號：PH0500，北京普非有限公司）。

4.試驗方法

（1）標本采集：于觀察組入院后治療前、對照組體檢時，早晨8點空腹抽取兩組研究對象靜脈血 5 ml，加入抗凝劑后，在3 000 r/min（離心半徑為10 cm）的條件下離心10 min，取上清液放入干凈凍存管內(nèi)置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?）RT-qPCR法檢測gC1qR表達：取兩組研究對象血清，嚴格按照RT-qPCR試劑盒步驟進行檢測，用Trizol試劑提取總RNA，用電泳儀檢測其完整性，根據(jù)cDNA第一鏈合成試劑盒說明，進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；利用RT-qPCR儀，gC1qR引物序列為 ：上 游 CGGAATTCGGTCCTATCTCTAGGGGGCG，下 游GCTCTAGAAGGTGGGATGCTGTTGTTGA，GAPDH 引 物 序列 ： 上 游 GTAAGAAACCCTGGACCACC， 下 游CTGGGATGGAATTGTGAGGG，在95 ℃條件下預變性 5 min，95 ℃ 3 s，58 ℃ 15 s，72 ℃反應 30 s，此循環(huán)進行40次，72 ℃延伸10 min，收集gC1qR熒光信號，反應結(jié)束后進行數(shù)據(jù)分析，以同一樣本中的GAPDH的 Ct值作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt計算其基因相對表達量。（3）巨噬細胞的提?。喝∮^察組患者血清置于離心管中，加入4型膠原酶使其終濃度為1 mg/ml，在37 ℃下，300 r/min（離心半徑為10 cm）的搖床上搖晃1 h后過濾離心，棄掉上清液，重懸后再次離心，棄掉上清液，重懸后在4 ℃下沉淀離心3次，取3次上清液，3次上清液混合后，4 ℃下離心5 min，棄掉上清液，再次重懸后將其小心鋪到25%～50%的Percoll上方，每部分體積為4 ml，然后在室溫、2 000 r/min（離心半徑為10 cm）、降速調(diào)為1的條件下進行梯度離心20 min，離心后在25%與50%界限處的為巨噬細胞。（4）細胞轉(zhuǎn)染：取巨噬細胞，將其分化為空轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染組，每組設6個樣本。然后將構(gòu)建好空載體和gC1qR低表達質(zhì)粒與脂質(zhì)體分別加入不含血清的DMEM培養(yǎng)液中，混合均勻后溫室條件下孵育10 min，然后分別取等量目的基因加入脂質(zhì)體中配置成轉(zhuǎn)染液，巨噬細胞常規(guī)培養(yǎng)24 h后棄掉培養(yǎng)液，將轉(zhuǎn)染液按分組依次加入孔板，并加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基使總體積到達1 ml，轉(zhuǎn)染24 h后，收集各組細胞用于后續(xù)實驗。（5）巨噬細胞焦亡檢測：取轉(zhuǎn)染完成后的巨噬細胞，將其接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h后加入脂多糖反應4 h，加入4 mmol/L ATP刺激1 h，加入2 mg/L碘化丙啶（PI）和5 mg/L Hoechst 33342溫室染色10 min，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞焦亡情況并拍照。（6）巨噬細胞線粒體功能檢測：取轉(zhuǎn)染后的巨噬細胞，接種于24孔板中并置于冰上，預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次后，加入80 μl預冷的細胞裂解液，裂解30 min后，在4 ℃、12 000 r/min（離心半徑為10 cm）的條件下離心10 min，取上清液用生物發(fā)光法檢測ATP含量，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

5.統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內(nèi)比較采用配對樣本t檢驗；計數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗；Pearson相關(guān)性分析評估gC1qR和巨噬細胞焦亡及線粒體功能相關(guān)性；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.兩組gC1qR表達結(jié)果

觀察組、對照組血清gC1qR mRNA表達分別為（2.31±0.21）、（1.00±0.00），觀察組gC1qR表達顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（t=48.320，P＜0.001），見圖1。

圖1 兩組研究對象的球狀C1q受體（gC1qR）表達

2.gC1qR對巨噬細胞焦亡的影響

空轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染組巨噬細胞焦亡率分別為（41.36±5.21）%、（15.44±2.11）%，轉(zhuǎn)染組巨噬細胞焦亡率低于空轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計學意義（t=11.300，P＜0.001），見圖2。

圖2 空轉(zhuǎn)染組（A）與轉(zhuǎn)染球狀C1q受體（gC1qR）組（B）敗血癥患者巨噬細胞焦亡率比較

3.gC1qR對巨噬細胞線粒體功能的影響

空轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染組巨噬細胞ATP含量分別為（8.24±2.56）μmol/L、（38.47±4.89）μmol/L，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（t=13.420，P＜0.001），見圖3。

圖3 空轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染球狀C1q受體（gC1qR）組敗血癥患者巨噬細胞三磷酸腺苷（ATP）含量比較

4.相關(guān)性分析

gC1qR與巨噬細胞焦亡呈正相關(guān)（r=0.879，P＜0.001）、與ATP呈負相關(guān)（r=-0.957，P＜0.001），見圖4。

圖4 60例敗血癥患者的球狀C1q受體（gC1qR）mRNA表達與巨噬細胞焦亡率（A）、三磷酸腺苷（ATP）含量（B）的相關(guān)性分析

討 論

敗血癥是臨床常見疾病，病情復雜且進展迅速，嚴重者可引發(fā)休克、彌漫性血管內(nèi)凝血以及多器官功能衰竭，最終危及生命，因此該病已經(jīng)成為重癥監(jiān)護病房患者最主要的死亡原因之一，這不僅給患者的身心健康造成了嚴重傷害 ，也給患者及其家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔［6］。目前，雖然高效抗生素的不斷問世以及日臻完善的器官支持和重癥監(jiān)護技術(shù)在一定程度上降低了敗血癥的病死率，但由敗血癥引發(fā)的靶器官功能障礙與衰竭而導致的病死率近年來一直居高不下，因此探尋新型有效的治療靶點以及敗血癥發(fā)病機制一直是臨床工作的首要任務［7］。所以，本文就gC1qR在敗血癥中的表達及對敗血癥患者巨噬細胞焦亡和線粒體功能改變的影響進行研究探討，以期為臨床治療及發(fā)生的機制提供理論依據(jù)。

本文研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，觀察組gC1qR表達顯著升高，這說明gC1qR基因有可能參與調(diào)控敗血癥感染。敗血癥主要是由病原菌入侵機體血液而引起的炎癥感染性疾病，其病因和發(fā)病機制極為復雜，至今尚未完全闡明，因此探尋其發(fā)生、發(fā)展機制，尋找糖尿病根治方法是醫(yī)學領(lǐng)域一直關(guān)注的焦點之一［1］。而近年來研究發(fā)現(xiàn)，gC1qR在機體抗病毒、抗感染等生理、病理過程中發(fā)揮重要作用，其可通過與多種病毒、細菌、細胞的蛋白結(jié)合，來參與宿主細胞防御，進而影響機體抗病毒、抗感染途徑，故可推測gC1qR在敗血癥中可能發(fā)揮重要作用［5］。安斌［8］研究發(fā)現(xiàn)，gC1qR在病毒感染的豬組織病變中呈高表達，gC1qR基因敲除后，其病理變化有所減輕，提示gC1qR在病毒感染的豬模型中發(fā)揮重要作用，這與本文類似。

本文結(jié)果顯示，與空轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染組巨噬細胞焦亡率顯著降低，ATP含量顯著升高，這說明抑制gC1qR表達可顯著抑制巨噬細胞焦亡，并改善線粒體功能。近年來研究發(fā)現(xiàn)，敗血癥的發(fā)生、發(fā)展與固有免疫過程密切相關(guān)，而巨噬細胞作為固有免疫過程中的第一響應細胞，其在機體抵御病原菌入侵以及多種微生物引發(fā)的敗血癥感染的控制中發(fā)揮重要作用［3］。細胞焦亡是一種新的促炎性細胞死亡方式，研究表明，適度的細胞焦亡可有效殺滅病原體，是機體防御的重要組成部分，但過度細胞焦亡，則會引起機體炎性反應失控，導致過度免疫應答及炎癥因子釋放，最終引發(fā)多臟器衰竭和死亡，因此調(diào)控細胞焦亡有望成為一種全新的防治敗血癥手段，而線粒體功能障礙是近年來提出的有關(guān)細胞焦亡的重要機制之一，因此越來越受到臨床的關(guān)注及重視［4］。對于敗血癥患者，低表達gC1qR可能是通過調(diào)節(jié)機體內(nèi)gC1qR的轉(zhuǎn)錄及翻譯，從而影響細胞因子表達，抑制氧化應激及炎性反應，抑制半胱天冬酶-1等，進而達到抑制細胞焦亡并改善線粒體功能的目的，最終有效治療疾病。梁譯丹［9］研究發(fā)現(xiàn)，敗血癥小鼠中巨噬細胞焦亡顯著增加，給予治療后巨噬細胞顯著受抑制，這與本文結(jié)果類似。

為證實gC1qR基因在敗血癥發(fā)生中的重要作用，我們提取敗血癥全血巨噬細胞，初步觀察了低表達對巨噬細胞細胞焦亡及線粒體功能的影響，并對其做了相關(guān)性分析，本文結(jié)果顯示，gC1qR與巨噬細胞焦亡呈正相關(guān)、與ATP呈負相關(guān)，這說明gC1qR與敗血癥巨噬細胞焦亡及線粒體功能改變具有相關(guān)性。ATP是反映線粒體功能的有效指標，故本文檢測其水平的變化以觀察線粒體功能的變化情況［17］。對于敗血癥患者，低表達gC1qR可能是通過促進其與配體結(jié)合成復合體，從而抑制gC1qR進入細胞線粒體內(nèi)蓄積，相關(guān)炎性因子及促凋亡因子的分泌，進而促進ATP的合成，改善線粒體膜電位，到達有效調(diào)控細胞焦亡的目的，最終有效改善疾病癥狀。陳廣基和馬雪楓［10］研究表明，脂多糖（LPS）誘導后，巨噬細胞焦亡顯著增加，給予雪膽乙素可顯著抑制NLRP3炎癥小體活化與細胞焦亡，這與本文結(jié)果類似。

綜上所述，gC1qR在敗血癥患者中呈現(xiàn)顯著高表達，gC1qR可促進巨噬細胞焦亡，并導致線粒體功能紊亂。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突