主動脈瘤動物模型研究進展

臧晗偉 楊麗娟 杜昭啟 李偉

1濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院心臟大血管外科，濱州 256603；2濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院醫(yī)學研究中心，濱州 256603

主動脈瘤是指主動脈局部或彌漫性的擴張，通常主動脈直徑超過正常直徑的50%即可診斷為主動脈瘤，絕大多數(shù)的主動脈瘤患者無明顯癥狀，但瘤體發(fā)生破裂后病死率極高［1-2］。近年來，受社會壓力和不良生活習慣的影響，主動脈瘤的患病率呈上升趨勢，隨著影像學技術(shù)的發(fā)展和醫(yī)療資源的改善，主動脈瘤的就診率和檢出率也相應(yīng)提高。介入技術(shù)的逐步成熟及廣泛應(yīng)用使得大部分患者得到了及時的救治。但該病當前并無有效的預(yù)防和藥物治療手段，因此研究疾病的發(fā)病機制、發(fā)現(xiàn)潛在治療靶點是主動脈瘤防治的重中之重。

不同于其他組織，主動脈瘤臨床樣本的獲取難度較大，因此，主動脈瘤的研究主要通過細胞或動物實驗進行，穩(wěn)定、合理的主動脈瘤模型是開展科學研究的基礎(chǔ)。目前，主動脈瘤動物模型包括藥物誘導(dǎo)模型、基因工程模型和手術(shù)模型，其中藥物誘導(dǎo)模型最為常見。不同的模型模擬了不同的發(fā)病機制，呈現(xiàn)不同的病理表現(xiàn)，適用于不同的實驗研究，且動物存活率、造模費用等也大不相同，本文就主動脈瘤動物模型的構(gòu)建方法及優(yōu)缺點等進行綜述。

主動脈瘤概述

1.主動脈瘤的臨床診療

主動脈瘤根據(jù)發(fā)病部位可分為胸主動脈瘤和腹主動脈瘤［1-2］。無論是胸主動脈瘤還是腹主動脈瘤，在早期多無明顯癥狀，多因查體發(fā)現(xiàn)，部分患者可在后期因瘤體壓迫臨近組織器官或破裂后發(fā)現(xiàn)。而夾層動脈瘤作為主動脈瘤的一種特殊類型，在疾病的早期即可表現(xiàn)為劇烈的疼痛，主動脈夾層發(fā)病急驟，破裂風險高，需盡早治療。彩超檢查由于費用低、無創(chuàng)，是篩查主動脈瘤最常用的影像學手段，主動脈CT血管造影（CTA）可以較為精確地顯示出動脈瘤大小、形態(tài)、附壁血栓、主動脈分支血管受累狀況，是主動脈瘤診斷的金標準。

無論是胸主動脈瘤還是腹主動脈瘤，手術(shù)均為其首選治療方法［1-2］。手術(shù)又包括介入手術(shù)及開放手術(shù)兩種，對于病變位于升主動脈的患者而言，常需選擇創(chuàng)傷較大、風險較高的開放手術(shù)，術(shù)前需嚴格評估瓣膜功能，明確是否需同期行瓣膜置換，術(shù)中常需切除整段病變血管并進行人工血管置換。位于主動脈弓、降主動脈或腹主動脈的動脈瘤多采用介入手術(shù)，其優(yōu)點是創(chuàng)傷小、操作時間短，術(shù)后恢復(fù)快。

2.主動脈瘤的病理特征及發(fā)病機制

主動脈瘤的主要病理表現(xiàn)包括：細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）降解、血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的凋亡及表型轉(zhuǎn)化、管壁炎癥細胞浸潤，這些病理表現(xiàn)相互作用，共同參與了疾病的進展。ECM由彈力蛋白和膠原蛋白構(gòu)成，是構(gòu)成主動脈中膜的重要成分，負責維持血管穩(wěn)態(tài)。處于合成態(tài)的VSMCs可產(chǎn)生大量基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP），并作用于ECM，促使彈力蛋白和膠原蛋白降解，誘導(dǎo)腹主動脈瘤發(fā)生［3］。VSMCs是構(gòu)成主動脈中膜的主要細胞成分，在主動脈瘤疾病進程中，VSMCs發(fā)生異常凋亡，并從收縮態(tài)向合成態(tài)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致彈性蛋白和膠原合成減少，降解增多，動脈管壁發(fā)生退化［4］。炎癥細胞浸潤是主動脈瘤發(fā)病過程中的另一重要病理表現(xiàn)，在主動脈瘤患者的主動脈壁中，可觀察到巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞等多種炎癥細胞，炎癥細胞分泌的多種細胞因子和趨化因子可誘導(dǎo)MMP的活化，引起ECM降解和VSMCs凋亡［5］。

主動脈瘤的病因及發(fā)病機制當前并不明確，主要危險因素包括年齡、性別、吸煙、肥胖、高血壓。除此之外，主動脈瘤還受遺傳因素影響，如與FBN1基因突變相關(guān)的馬凡綜合征（Marfan syndrome，MFS）［6］，與MYH11基因相關(guān)的家族性胸主動脈瘤及夾層［7］，洛伊斯-迪茨綜合征（Loeys-Dietz syndrome，LDS）患者的基因突變類型則可以分為5種亞型，分別是轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）受體1和2基因（TGFBR1、TGFBR2）的突變，TGF-β 途徑中的 TGFB2、TGFB3以及SMAD3基因的突變［6］。

主動脈瘤模型

與胸主動脈瘤動物模型相比，腹主動脈瘤的動物模型較多，也比較成熟。研究表明，在某些腹主動脈瘤的建模過程中，也能觀察到胸主動脈瘤的發(fā)生，但發(fā)病率較低。目前應(yīng)用較多的建模方法主要包括藥物誘導(dǎo)法、基因修飾法和手術(shù)法等。

1.藥物誘導(dǎo)模型

藥物誘導(dǎo)模型是通過局部或全身應(yīng)用藥物，誘導(dǎo)動物形成主動脈瘤。常用藥物有氯化鈣（CaCl2）、彈性蛋白酶（porcine pancreatic elastase，PPE）、血 管 緊 張 素 Ⅱ（angiotensin-Ⅱ，AngⅡ）、β-氨基丙腈（β-aminopropionitrile monofumarate，BAPN）等，這些藥物可單獨使用，也可聯(lián)合應(yīng)用來誘導(dǎo)模型的形成，而不同藥物誘導(dǎo)模型的形成機制、病理表現(xiàn)及藥物使用方法各不相同。

1.1.CaCl2浸潤法誘導(dǎo)模型

CaCl2可引起主動脈中膜血管平滑肌的丟失和內(nèi)膜血管內(nèi)皮細胞的損傷，使管壁增厚、鈣化，彈性纖維斷裂，同時還能引起炎癥細胞（包括巨噬細胞、中性粒細胞和淋巴細胞）浸潤管壁，促使動脈瘤形成［8］。1988年Gertz等［9］使用CaCl2浸潤兔頸總動脈成功建立了頸總動脈瘤的動物模型；在2000年，Chiou等［10］首次使用該方法在C57BL/6小鼠建立了腹主動脈瘤的模型，他們使用0.68 M CaCl2浸泡的濕紗布覆蓋小鼠的腹主動脈10 min，于術(shù)后21 d觀察到了腹主動脈瘤的形成。此后經(jīng)過多次改良，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用。

該模型手術(shù)方式簡單，小鼠麻醉后，取腹部正中切口，游離位于雙側(cè)腎動脈至髂動脈分叉處的主動脈，暴露主動脈外膜，使用CaCl2浸泡的紗布濕敷后，使用生理鹽水沖洗腹腔后關(guān)腹，實驗所需CaCl2濃度及孵育時間在大鼠和小鼠差異較大，小鼠可選用1 mol/L CaCl2孵育50 min，術(shù)后14 d就可發(fā)現(xiàn)腹主動脈擴張。大鼠則可采用1 mol/L CaCl2溶液孵育主動脈10 min，飼養(yǎng)28 d觀察成模情況［8，11］。該模型具體機制并不明確，目前認為血管浸潤CaCl2后，游離的鈣離子轉(zhuǎn)運入細胞內(nèi)，在VSMCs堿性磷酸酶的催化下，鈣離子轉(zhuǎn)化為磷酸鈣，由于鈣離子與彈性蛋白親和力較高，磷酸鈣可在彈性蛋白網(wǎng)上沉淀，引起彈性纖維的斷裂［12-13］。該模型可模擬人腹主動脈瘤平滑肌細胞凋亡、炎癥細胞浸潤、彈性纖維鈣化等特征，但該方法誘導(dǎo)的模型不會破裂，且不會形成粥樣硬化及附壁血栓，與人腹主動脈瘤的病理特征有一定差別。

1.2.PPE灌注法誘導(dǎo)模型

1990年Anidjar等［14］經(jīng)腹主動脈灌注PPE 2 h成功建立了大鼠的腹主動脈瘤模型。2002年國內(nèi)學者將PPE的灌注時間縮短到了30 min，模型成功率在90%左右，灌注時間超過30 min，延長灌注時間，模型成功率無明顯變化［15］。Pyo等［16］在2000年改進建模方法，成功將該方法應(yīng)用于小鼠，并將灌注時間縮短至5 min。

PPE能穿透管壁中層，造成彈性纖維的損傷，引起局部腹主動脈擴張。病理切片發(fā)現(xiàn)，灌注后的第1周彈性纖維無明顯損傷，灌注后第2周開始，管壁出現(xiàn)明顯的彈性纖維降解和炎癥細胞浸潤，巨噬細胞和中性粒細胞是主要的炎癥細胞，并且檢測到了MMP-2和MMP-9的表達增加［16］。

該模型的手術(shù)操作要求較高，且在灌注過程中存在PPE滲漏、血管破裂等風險，對手術(shù)者的操作要求高。此種建模方法可選擇C57BL/6J小鼠或Wistar大鼠作為實驗動物，建模時需暴露雙側(cè)腎動脈至髂動脈分叉處的腹主動脈，暴露區(qū)上下兩端腹主動脈使用絲線結(jié)扎，插入灌注針頭進行灌注。C57BL/6小鼠可使用1.5 U/ml的PPE 30 μl灌注5 min，Wistar大鼠可使用50 U/ml的PPE 1 ml灌注30 min，灌注結(jié)束后沖洗腹腔并逐層關(guān)腹，術(shù)后第14天可觀察到動脈瘤［15-17］。該模型無法誘導(dǎo)形成主動脈夾層、動脈粥樣硬化和附壁血栓，動脈瘤破裂率也較低，但是其組織切片可觀察到炎癥細胞浸潤和中膜的降解，該病理特點與人動脈瘤病理表現(xiàn)相似。

1.3.AngⅡ誘導(dǎo)的模型

AngⅡ誘導(dǎo)形成主動脈瘤是當前常用的建模方法，該方法于2000年被Daugherty等［18］報道，實驗動物常選擇載脂蛋白E缺失（ApoE-/-）小鼠或低密度脂蛋白受體缺陷（LDLR-/-）小鼠［19］，但也有選擇野生型C57BL/6小鼠的報道［20］。AngⅡ進入小鼠體內(nèi)后可損傷主動脈內(nèi)膜，血液由損傷處進入管壁，形成主動脈壁間血腫，最終引起血管擴張［21］。蘇木精-伊紅（HE）染色提示主動脈管壁增厚，中膜及外膜可見炎癥細胞浸潤，彈力纖維染色還可觀察到彈力纖維的降解［22］。

將含有AngⅡ的微量泵植入小鼠背部皮下，以1.44 mg（/kg·d）的劑量持續(xù)泵入，術(shù)后高脂飼料喂養(yǎng)28 d成瘤［23］。AngⅡ誘導(dǎo)的動脈瘤病理表現(xiàn)與人主動脈瘤病理特征相似，可見主動脈中膜降解、主動脈擴張、伴有動脈粥樣硬化和壁內(nèi)血栓的形成。該方法手術(shù)創(chuàng)傷較小，操作簡單，缺點是人類腹主動脈瘤多位于腎下方，而本模型主要形成腎上型腹主動脈瘤，且因為需要使用微量泵及轉(zhuǎn)基因鼠，實驗費用較高。

1.4.BAPN誘導(dǎo)的動物模型

BAPN是一種賴氨酰氧化酶（Lox）強效抑制劑，Lox由VSMCs釋放，能夠氧化膠原和彈性蛋白的賴氨酸殘基，使這些纖維性蛋白共價交聯(lián)產(chǎn)生ECM，BAPN能競爭性地結(jié)合彈性蛋白或氨基烷基，抑制彈性蛋白和膠原蛋白交聯(lián)，使主動脈中膜發(fā)生退化，最終形成夾層［24］。組織學可見彈力纖維破壞、數(shù)量減少，血管壁變薄和炎癥細胞浸潤［25］。

1952年I.V. Ponseti等發(fā)現(xiàn)，將山黧豆種子及正常飼料按照1∶1的比例混合飼養(yǎng)大鼠，5～9周后部分大鼠發(fā)生夾層破裂而死亡，提示山黧豆中的某種成分可致主動脈夾層發(fā)生，隨后的研究證實導(dǎo)致主動脈夾層的有效成分為BAPN，從此，BAPN被逐步運用于動脈瘤模型的制作［26］。BAPN主要誘導(dǎo)夾層動脈瘤的形成，病變多位于胸主動脈，而腹主動脈較少見［25］。因為Lox活性可隨著年齡增長而降低，成年動物使用BAPN處理后可誘導(dǎo)血管硬化和彈力纖維降解，但并不能誘導(dǎo)主動脈瘤的形成，因此該模型多選擇2～3周的雄性C57BL/6小鼠［27-29］。此方法動脈瘤破裂和動物死亡風險較高，但建模費用低，操作簡單。

1.5.醛固酮受體激動劑加高鹽飲水誘導(dǎo)的模型

乙酸脫氧皮質(zhì)甾酮（deoxycorticosterone acetate，DOCA）是醛固酮的前體，Liu等［30］在使用DOCA和鹽誘導(dǎo)小鼠高血壓時發(fā)現(xiàn)部分小鼠因主動脈瘤破裂而死亡，提示DOCA或醛固酮加高鹽飲水可誘導(dǎo)小鼠動脈瘤形成。具體方法為：將50 mg的DOCA緩釋藥片植入10月齡的C57BL/6J小鼠背部，同時給予含有0.9%氯化鈉（NaCl）和0.2%氯化鉀（KCl）的水飼養(yǎng)3周即形成動脈瘤，此方法誘導(dǎo)形成的模型，腹主動脈瘤、胸主動脈瘤和主動脈瘤破裂的發(fā)生率分別為62%、44%和18%，且產(chǎn)生胸主動脈瘤的小鼠均合并有腹主動脈瘤［30］。由于DOCA是醛固酮的前體，該團隊嘗試200 μg（/kg·d）的醛固酮加高鹽飲水飼養(yǎng)動物，也誘導(dǎo)形成了主動脈瘤。與DOCA和鹽誘導(dǎo)的主動脈瘤相比，醛固酮和鹽誘導(dǎo)的主動脈瘤多位于腎上腹主動脈，且主動脈瘤破裂率更高。該模型有明顯的鼠齡限制，10月齡小鼠主動脈瘤發(fā)病率及瘤體最大徑明顯高于10周齡小鼠。由于醛固酮對腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)有負反饋調(diào)節(jié)作用，而該系統(tǒng)可引起高血壓升高，為排除血壓對實驗的影響，研究者使用依那普利和洛沙坦阻斷腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的升壓作用，發(fā)現(xiàn)動脈瘤的發(fā)生率和瘤體擴張程度無明顯變化，而應(yīng)用醛固酮受體拮抗劑螺內(nèi)酯則能明顯縮小主動脈瘤的體積，降低發(fā)病率，說明此類動脈瘤的形成取決于醛固酮的作用，而非血壓的升高［31］。

此模型造模方法簡單，且與人主動脈瘤的病理表現(xiàn)相似，均觀察到彈力纖維降解、MMP分泌增加、巨噬細胞等炎癥細胞浸潤、VSMCs凋亡和主動脈血管壁重塑等。

1.6.多種藥物聯(lián)合誘導(dǎo)的模型

多種藥物聯(lián)合誘導(dǎo)的模型是指為提高模型成功率，聯(lián)合應(yīng)用2種或2種以上藥物誘導(dǎo)構(gòu)建主動脈瘤模型。目前最常用的方法是Tanaka等［32］提出的在PPE灌注的基礎(chǔ)上聯(lián)合CaCl2局部浸潤的方法，在進行PPE灌注的過程中使用CaCl2紗布濕敷主動脈20 min，4周后可成瘤，成功率可達到92.7%。為研究吸煙對主動脈瘤的影響，有學者通過微量泵將4 mg（/kg·d）的尼古丁和0.72 mg（/kg·d）的AngⅡ泵入小鼠體內(nèi)28 d后，發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)合誘導(dǎo)小鼠腹主動脈瘤的成功率顯著高于單獨應(yīng)用AngⅡ組［33］。除此之外，還有部分學者使用AngⅡ聯(lián)合BAPN建立主動脈瘤模型，通過AngⅡ腹腔注射聯(lián)合飲用BAPN水溶液的方法構(gòu)建出的主動脈瘤模型，相較于單獨使用一種藥物的方法而言，模型成功率明顯提高，達到了80%［34］。多藥物聯(lián)合應(yīng)用顯著提高了動脈瘤的擴張比率和發(fā)生率，但也面臨死亡率升高的風險。不同藥物誘導(dǎo)出的主動脈瘤其病理表現(xiàn)也不同，因此通過聯(lián)合用藥的方法所誘導(dǎo)出的主動脈瘤可觀測到更多的病理變化，更能模擬臨床動脈瘤的演變過程。

2.基因工程模型

基因工程模型是通過轉(zhuǎn)基因或基因敲除等基因修飾技術(shù)使動物發(fā)生基因突變或缺失，在此基礎(chǔ)上單獨或聯(lián)合藥物，引起ECM、彈力蛋白、膠原蛋白、主動脈管壁細胞結(jié)構(gòu)或關(guān)鍵酶異常，形成主動脈瘤。由于C57BL/6小鼠已完成全基因組測序，基因操作技術(shù)較為成熟，也就成為了目前最常用的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒瀯游铮?5］?；蚬こ棠Ｐ涂梢詮幕颉⒎肿咏嵌葋硖剿髦鲃用}瘤的發(fā)病機制，尤其適用于MFS等基因異常引起的主動脈瘤，此外，還有部分基因工程模型可增加動物動脈瘤發(fā)生的易感性，并已廣泛應(yīng)用于實驗研究。

建立動脈瘤模型常用的基因工程鼠是ApoE-/-小鼠及LDLR-/-小鼠，主要是因ApoE和低密度脂蛋白基因缺失可引起脂代謝異常，引發(fā)高脂血癥，通過聯(lián)合使用AngⅡ，使VSMCs受損形成腹主動脈瘤。此模型可出現(xiàn)主動脈粥樣硬化、附壁血栓形成等病理特征［22-23］。由于MMP參與了主動脈瘤管壁彈力纖維的降解，因此，Apo與MMP基因雙敲除小鼠應(yīng)運而生。該模型更適用于研究MMP在腹主動脈瘤發(fā)病中的作用，且模型成功率與ApoE-/-小鼠相比明顯升高，但由于敲除了2個關(guān)鍵基因，小鼠早期死亡風險也相應(yīng)增加［36］。

針對基因特征明確的特定疾病，研發(fā)出了專用的基因工程動物模型，如研究MFS的FBN1基因突變小鼠，MFS是一種累及多器官的結(jié)締組織病，其患者由于FBN1基因突變，使主動脈中層彈力蛋白減少［6］。研究LDS的TGFBR1、TGFB2和TGFBR2基因突變小鼠，在組織學上表現(xiàn)為主動脈壁中膜變性及彈力纖維斷裂，這一點與MFS病理學表現(xiàn)相似［6，37］。但是，由于基因突變動物價格昂貴，飼養(yǎng)條件要求較高，使其應(yīng)用受到了限制。

3.手術(shù)模型

手術(shù)模型是指通過手術(shù)方法直接構(gòu)建符合疾病特點的動物模型，其不同于藥物誘導(dǎo)模型和基因工程模型，手術(shù)模型無法呈現(xiàn)動脈瘤的病理特征，因此多用于主動脈瘤的腔內(nèi)治療及血流動力學等方面的研究。

3.1.主動脈修補手術(shù)模型

常用的主動脈瘤模型手術(shù)方法是將主動脈縱形切開后使用補片對切口進行修補，由于所使用補片與主動脈相比結(jié)構(gòu)相對較弱，手術(shù)部位在血壓作用下擴張形成動脈瘤。常選擇腎動脈以下、髂動脈分叉處以上的腹主動脈進行造模，實驗所用的移植物或補片通常來自自體靜脈、腸管等，也可使用人工補片［38-40］。該實驗方法由于所選擇的補片及主動脈切口大小受研究者自行控制，因此其最終形成的動脈瘤瘤體大小相對可控，但手術(shù)操作時間長、創(chuàng)傷大，且無法表現(xiàn)出動脈粥樣硬化、ECM降解、管壁炎癥細胞浸潤等病理變化，僅用于主動脈瘤的形態(tài)學研究。

3.2.脫細胞移植手術(shù)模型

1994年Allaire等［41］將豚鼠腹主動脈經(jīng)十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）脫細胞處理，造成管壁的細胞結(jié)構(gòu)破壞，只保留彈性蛋白和膠原蛋白等ECM成分，經(jīng)脫細胞處理并移植入Lewis大鼠體內(nèi)的主動脈作為外源移植物，成了免疫反應(yīng)的靶器官，在宿主免疫作用下，移植血管表現(xiàn)為ECM破壞和主動脈擴張，術(shù)后8周的病理切片可以觀察到管壁中層變薄，變薄的管壁在血壓的影響下發(fā)生重塑，形成動脈瘤。該方法手術(shù)難度較大，需要術(shù)者具備成熟的血管吻合技術(shù)，目前多用于研究VSMCs對腹主動脈瘤的保護作用及平滑肌細胞對MMP的抑制作用。

3.3.人工血管移植及腔內(nèi)手術(shù)模型

目前腹主動脈瘤多采用介入治療，因此，我國龔萬和等人成功建立了犬的主動脈瘤模型，主要方法是使用將兩段直徑6 mm的人工血管與直徑29 mm的人工血管的兩端進行吻合，制作成為一段中間部位膨大腹主動脈瘤假體，并將假體與腹主動脈進行吻合，術(shù)后5個月解剖見假體部位腹主動脈血流通暢［42］。該模型主要應(yīng)用于主動脈覆膜支架的設(shè)計，但手術(shù)操作難度高，需要術(shù)者掌握熟練的血管吻合技術(shù)，手術(shù)時間長，約120 min，隨時間的延長，動物下肢缺血、癱瘓的風險也相應(yīng)增加。

景在平等學者還曾通過腔內(nèi)手術(shù)操作直接損傷血管內(nèi)膜，在術(shù)后2周成功誘導(dǎo)形成胸主動脈夾層動脈瘤［43］。該方法需要特殊的造瘤器械，并且對操作人員有放射性損傷。但該方法成瘤周期短，尤其適用于夾層動脈瘤破裂、介入手術(shù)治療等的研究。

小 結(jié)

主動脈瘤模型建模方法較多，而理想的模型應(yīng)具備成功率高、死亡率低、可重復(fù)性強、操作簡單、成本低等特點。通過對主動脈瘤動物模型的制作方法、病理表現(xiàn)的研究，我們發(fā)現(xiàn)不同方法構(gòu)建的模型各有特色，但均不能完美地模擬人類主動脈瘤的全部病理生理特征，因此，在研究中我們還需要根據(jù)實驗要求而選擇合適的主動脈瘤模型。