響應(yīng)面-主成分分析法優(yōu)化大曲發(fā)酵藤茶工藝

徐靜宜，陳勝，譚燁，屈廷啟*

1(湖北工業(yè)大學(xué) 工程技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢，430068)2(武漢黃鶴樓香精香料有限公司，湖北 武漢，430040)

藤茶是一種葡萄科植物的枝葉嫩芽，俗稱莓茶，主要分布于我國(guó)長(zhǎng)江流域地區(qū)[1]。研究表明，藤茶富含黃酮、多糖、多酚、氨基酸等物質(zhì)[2]以及多種香氣成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，藤茶具有調(diào)節(jié)肝臟、促進(jìn)血液循環(huán)等功效，在抗氧化、抗菌[3]等方面具有顯著的藥理活性[4-5]，是近年來保健產(chǎn)品的新寵[6]。目前市場(chǎng)上用于飲用的藤茶，多為初加工后的藤茶物料，這類飲品“青氣”重，湯色渾濁，味道粗澀[7]，研究者們?cè)噲D通過改變發(fā)酵工藝，改善藤茶品質(zhì)。潘利華等[8]通過改變新老葉莖比例來改善藤茶苦味重及回甘不明顯的問題。陳加勇等[9]將紅茶和綠茶與藤茶進(jìn)行配比，改善了藤茶的風(fēng)味。李翠朵[10]通過黑曲霉發(fā)酵藤茶，使其提取物中黃酮和多酚的含量增加。綜上，為進(jìn)一步改善藤茶飲用的口感、增加風(fēng)味，提高發(fā)酵藤茶中的黃酮、總酚、氨基酸等有益物質(zhì)，本研究選取濃香型大曲對(duì)藤茶進(jìn)行發(fā)酵。大曲作為中國(guó)高品質(zhì)酒類常見的糖化發(fā)酵劑[11]，其代謝產(chǎn)物可生成風(fēng)味物質(zhì)及其前體，且在發(fā)酵過程中生成多種酸、醇類物質(zhì)，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物口感的形成起著重要作用[12]。但是少有人將大曲應(yīng)用于藤茶的發(fā)酵研究中，故探究大曲菌種在藤茶發(fā)酵中的應(yīng)用很有必要，可為藤茶發(fā)酵后風(fēng)味的改善提供參考。本試驗(yàn)通過響應(yīng)面-主成分分析法確定最佳發(fā)酵工藝的條件，以期為人們提供健康茶品。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藤茶(產(chǎn)地：湖北恩施地區(qū))，黃鶴樓香精香料有限公司；中高溫大曲，黃鶴樓酒業(yè)有限公司。

55 mm 0.22 μ混合纖維素脂(水系)微孔濾膜，上海興亞凈化材料廠；80目篩、UPT-Ⅱ-20T超純水制備設(shè)備，成都超純科技有限公司；DK-S22型恒溫水浴箱、DUG-9246A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；CP213型電子天平，國(guó)象斯儀器上海有限公司；STARTER3100型pH計(jì)，OHAUS；100 μL、200 μL、1 000 μL移液槍，邁德飛；752N型紫外分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司；超聲波清洗器，上海生析超聲儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藤茶發(fā)酵工藝流程

藤茶→鹽漬→醋蒸→放涼→揉捻→變溫發(fā)酵→中溫烘焙

原料：黃鶴樓香精香料有限公司提供的來自于湖北恩施地區(qū)的優(yōu)質(zhì)藤茶。鹽漬：將藤茶放入質(zhì)量濃度為2.0 g/L的鹽水中[13]，浸泡10 min。醋蒸：向蒸鍋中加入6 mL/L的陳醋，沸騰后將藤茶均勻分散于隔板上，持續(xù)加熱到大部分藤茶變?yōu)椴杈G色時(shí)停止加熱，不開蓋悶至全部藤茶變色后放涼。揉捻：將放涼的藤茶放入捻茶機(jī)揉捻至茶條柔軟并保持其完整形態(tài)。變溫發(fā)酵：按照一定質(zhì)量比例向藤茶中加入特制大曲及蔗糖，用適量水調(diào)配蔗糖溶液，使大曲活化，過濾后均勻混合于藤茶中，在合適的溫度和濕度下發(fā)酵36 h，為使系統(tǒng)中的大多數(shù)酶發(fā)揮作用，再將溫度調(diào)至60 ℃發(fā)酵12 h。中溫烘焙：將藤茶均勻鋪在烘箱中烘焙，待藤茶含水量為10%左右，散發(fā)清香揉搓可碎裂時(shí)，即烘焙完成。待藤茶回潮后密封保存。

1.2.2 評(píng)價(jià)過程

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在該工藝操作中，烘焙溫度對(duì)藤茶品質(zhì)的影響不可忽略，最終確定單因素試驗(yàn)基本條件為：發(fā)酵濕度50%(以10%為梯度)，大曲接種量為3%(以1%為梯度)，初始糖度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為5%(以1%為梯度)，烘焙溫度80 ℃(以5 ℃為梯度)，發(fā)酵溫度35 ℃(以5 ℃為梯度)；測(cè)定并記錄藤茶中總黃酮、總酚、還原糖、氨基酸、pH值及感官評(píng)價(jià)。經(jīng)客觀權(quán)重賦權(quán)法(criteria importance though intercrieria correlation,CRITIC)對(duì)衡量各單因素的指標(biāo)進(jìn)行客觀賦權(quán)確定最優(yōu)解，由響應(yīng)面軟件的中心組合原理設(shè)計(jì)試驗(yàn)，其中自變量為A(發(fā)酵溫度)、B(大曲接種量)、C(初始糖度)、D(發(fā)酵濕度)、E(烘焙溫度)，響應(yīng)面的響應(yīng)值為規(guī)范化綜合得分，根據(jù)理論最佳工藝確定實(shí)際最佳發(fā)酵參數(shù)。

1.3 品質(zhì)評(píng)價(jià)的測(cè)定方法

1.3.1 總黃酮的測(cè)定

根據(jù)蘆丁濃度的變化繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，取過篩烘至恒重的藤茶粉1.000 g，參照亞硝酸鈉-硝酸鋁法[14]，利用超聲波清洗儀超聲輔助提取后進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 總酚的測(cè)定

根據(jù)沒食子酸濃度的變化繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照Folin-Ciocalteu法[15]測(cè)定。

1.3.3 氨基酸的測(cè)定

參考GB/T 8314—2013《茶 游離氨基酸總量的測(cè)定》。

1.3.4 還原糖的測(cè)定

按照二硝基水楊酸法[16]進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 pH的測(cè)定

利用pH計(jì)[17]進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 藤茶感官評(píng)價(jià)

向湖北圣水茶廠有限責(zé)任公司送樣，參考GB/T 23776—2018《茶葉感官評(píng)審方法》進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果及分析

根據(jù)電子增強(qiáng)出版附圖1～附圖5(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.033290)的數(shù)據(jù)可知，以發(fā)酵參數(shù)為變量的指標(biāo)測(cè)定結(jié)果與參考文獻(xiàn)研究結(jié)果相近。王嵐等[18]測(cè)定藤茶多酚含量為23.64 mg/g，李佳川等[19]發(fā)現(xiàn)藤茶中黃酮含量達(dá)40%，郭桂義等[17]測(cè)定一般優(yōu)質(zhì)茶葉的pH在6.2以上。

根據(jù)DIAKOULAKI等[20]提出的CRITIC法進(jìn)行單因素結(jié)果分析。

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

式中：zij,無量綱處理后的樣本指標(biāo)值；ci,綜合權(quán)重；m,指標(biāo)個(gè)數(shù)；ωi,權(quán)重；zi,第i個(gè)指標(biāo)的樣本均值；si,對(duì)比強(qiáng)度；n,樣本個(gè)數(shù)；dj,樣本綜合評(píng)價(jià)值；rij,指標(biāo)i和j之間的相關(guān)系數(shù)；δi,沖突性。

根據(jù)表1和表2確定單因素最佳條件為發(fā)酵溫度37.5 ℃、大曲接種量3%、初始糖度5%、發(fā)酵濕度40%、烘焙溫度85 ℃。

表1 各單因素對(duì)發(fā)酵藤茶影響的各組權(quán)重Table 1 Weight fractions of each single factor affecting the fermentation of vine tea

表2 各單因素對(duì)發(fā)酵藤茶影響的各組權(quán)重后分?jǐn)?shù)(di)Table 2 Weight fractions of each single factor affecting the fermentation of vine tea

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

按照表3設(shè)計(jì)的變量因素水平完成Box-Behnken(Design-Expert 8.0.6)，共46個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，根據(jù)自動(dòng)生成的隨機(jī)順序進(jìn)行試驗(yàn)，探究5個(gè)變量對(duì)發(fā)酵藤茶中氨基酸、還原糖、黃酮、總酚、pH和感官評(píng)價(jià)的影響(表4)。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 3 Factors and levels table of response surface methodology

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2.2.1 發(fā)酵藤茶主成分分析

對(duì)預(yù)先設(shè)定的6個(gè)評(píng)分指標(biāo)，即感官評(píng)價(jià)、總酚、還原糖、pH、氨基酸和黃酮在SPSS 25中進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見表5。為滿足累計(jì)貢獻(xiàn)率>80%的原則[21]，提取前3個(gè)主成分，此時(shí)累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到81.999%，這3個(gè)主成分足以表征發(fā)酵藤茶的品質(zhì)信息。

表5 藤茶發(fā)酵茶主成分的貢獻(xiàn)率及特征值Table 5 Contribution rate and characteristic value of principal components of fermentation vine tea

由表6可知，根據(jù)特征向量值的絕對(duì)值大小分析，感官品質(zhì)評(píng)價(jià)、黃酮含量對(duì)第1主成分的影響相對(duì)較大，pH值、總酚含量對(duì)第2主成分的影響相對(duì)較大，還原糖含量、黃酮含量對(duì)第3主成分的影響較大。

表6 藤茶發(fā)酵茶的指標(biāo)特征向量值Table 6 Index characteristic vectorial values of fermentation vine tea

為使響應(yīng)面結(jié)果更加規(guī)范，需要將綜合得分Y進(jìn)行規(guī)范化處理，按公式(6)計(jì)算，以解決6個(gè)指標(biāo)之間存在的量級(jí)和單位上的差異。規(guī)范化綜合得分Z參考公式(7)，見表7。

表7 主成分得分及規(guī)范化綜合得分Table 7 Principal component score and standardized comprehensive score

(6)

(7)

式中：C,主成分的累積特征值；Fi,發(fā)酵藤茶各指標(biāo)的規(guī)范化得分；Yi,主成分特征值；Ymin,Y的最小值；Ymax,Y的最大值。

2.2.2.2 規(guī)范化綜合得分的響應(yīng)面分析

對(duì)6個(gè)因素及其對(duì)應(yīng)的規(guī)范化綜合得分進(jìn)行響應(yīng)面模擬，多元回歸擬合模型方程如下。

Z=0.89+0.26A-0.050B+0.066C-0.014D+9.356E-003E+0.022AB-0.073AC+0.20AD-0.046AE+0.037BC+0.079BD-0.076BE+0.015CD-0.011CE-0.016DE-0.29A2-0.16B2-0.12C2-0.033D2-0.23E2

表8 回歸模型方差分析Table 8 Analysis of variance of regression model

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面分析軟件得出的理論工藝參數(shù)及指標(biāo)為：發(fā)酵溫度39.57 ℃，初始糖度5.17%，大曲接種量3.21%，烘焙溫度79.32 ℃，發(fā)酵濕度50%，黃酮含量423.363 mg/g，總酚含量28.408 9 mg/g，氨基酸含量20.100 9 mg/g，還原糖含量111.303 mg/g，pH值為6.356 44，感官評(píng)價(jià)為85.905 5，規(guī)范化綜合得分1.024 2。經(jīng)實(shí)際驗(yàn)證得，該條件下發(fā)酵藤茶中黃酮含量為435.303 mg/g，總酚含量27.68 mg/g，氨基酸含量21.092 5 mg/g，還原糖含量110.875 mg/g，pH 6.32，感官評(píng)分90.50，與軟件預(yù)測(cè)的理論值基本一致，因此該模型的可以用于一定規(guī)模下的藤茶發(fā)酵。

3 結(jié)論

以常見酒類發(fā)酵劑濃香型大曲為菌種，湖北恩施的藤茶為原料，通過響應(yīng)面主成分分析的方法優(yōu)化發(fā)酵藤茶的工藝參數(shù)。為使經(jīng)過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的工藝參數(shù)可以應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，將參數(shù)調(diào)整為：發(fā)酵溫度39.6 ℃，大曲接種量3.2%，初始糖度5.2%，發(fā)酵濕度50%，烘焙溫度80 ℃。通過發(fā)酵參數(shù)的優(yōu)化，增加了藤茶的風(fēng)味物質(zhì)，有效地保留藤茶中的活性成分，改善藤茶原本苦澀、回甘不明顯的弊端。優(yōu)化后的藤茶，茶葉勻整凈度好，茶湯嫩黃明亮且伴有清香，回甘速度快且滋味甘鮮，葉底軟嫩、灰綠明亮。高于優(yōu)質(zhì)茶葉的感官評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。

利用大曲菌種對(duì)藤茶進(jìn)行發(fā)酵的研究鮮有報(bào)道，該研究為改善藤茶飲品的風(fēng)味、為藤茶的開發(fā)和利用提供參考。同時(shí)本文將CRITIC法與單因素分析結(jié)合起來，為單因素分析提供了更加規(guī)范的分析方法。