甜菊醇糖苷生物合成關(guān)鍵基因的導入和鑒定分析

張君 張虹 張芮 路國棟 雍婧姣 郎思睿 陳任

（1.寧夏大學西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室,銀川 750021; 2.寧夏大學生命科學學院,銀川 750021; 3.寧夏大學寧夏優(yōu)勢特色作物現(xiàn)代分子育種重點實驗室,銀川 750021）

甜葉菊（Stevia rebaudianaBertoni）是菊科甜葉菊屬或斯臺比亞屬多年生草本植物，其葉片富含多種甜菊醇糖苷（steviol glycosides,SGs）［1-2］，具有甜度高（甜度是蔗糖的200-300 倍）、熱量低（熱量約為蔗糖的1/300）、安全無毒等特點［3-4］。隨著各國對甜菊醇糖苷作為食品甜味劑安全性的肯定，以及食品安全國家標準的公布，甜葉菊逐漸成為食品和醫(yī)藥領(lǐng)域研究開發(fā)的熱點［5-6］

甜菊醇糖苷是一系列甜菊糖苷類的混合物，由甜菊醇單糖苷（steviolmonoside,SMono）、甜菊醇雙糖苷（steviolbioside,SBio）、甜菊苷（stevioside,ST）、萊包迪苷A-F（rebaudioside A-F,RA-RF）杜爾可苷A、B（dulcoside A,B,DA,DB）等20 多種不同的甜菊醇糖苷組成［7-10］。其中ST 約占60%-70%、RA約占15%-20%。ST 的甜度為蔗糖的250-300 倍，但具有一定的苦味，在一定程度上影響了甜菊醇糖苷的口味，進而也影響了甜菊醇糖苷的商業(yè)利用價值。而RA 的甜度則是蔗糖的350-450 倍［11］，且甜味最接近蔗糖，是理想的甜味成分。RA 含量越高，甜味就越純正，也就會越受消費者的青睞［4,12］。因此，在一定程度上，甜菊醇糖苷的口感和甜度取決于RA的含量，要想改善現(xiàn)有甜菊苷產(chǎn)品風味，就必須想辦法提高甜菊苷產(chǎn)品中RA 的含量。

自從甜葉菊葉片中分離出甜菊醇糖苷［13］以來，人們一直關(guān)注甜菊醇糖苷的生物合成途徑。經(jīng)過多年的研究發(fā)現(xiàn)甜菊醇糖苷的生物合成途徑的上游（前期）與赤霉素生物合成途徑一致［14］。在類異戊二烯及其衍生物的生物合成途徑中（圖1），以雙牻牛兒基二磷酸（geranylgeranyl diphosphate）為原料，在柯巴基二磷酸合酶（copalylpyrophosphate synthase,CPS）的催化作用下生成內(nèi)根柯巴基二磷酸（ent-copalyl diphosphate），然后在貝殼杉烯合酶（kaurene synthase,KS）的作用下生成內(nèi)根貝殼杉烯（ent-kaurene），而貝殼杉烯氧化酶（kaurene oxidase,KO）又將其轉(zhuǎn)化成內(nèi)根-貝殼杉烯酸（ent-kaurenoic acid），這是甜菊醇糖苷生物合成途徑與赤霉素生物合成途徑的分界點，隨后，內(nèi)根-貝殼杉烯酸在內(nèi)根-貝殼杉烯酸羥化酶（kaurenoicacid hydroxylase,KAH）的作用下,發(fā)生C-13 位脫氫氧化形成甜菊醇（stevoil），它是甜菊醇糖苷合成的前體。甜菊醇在不同的UDP（uridine diphosphate）-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucosyltransferases,UGTs）的作用下,最終形成一系列不同甜度的甜菊醇糖苷［14-16］。其中，在甜菊醇苷元的C-19 位上連接一個葡萄糖基和C-13 位上連接數(shù)個葡萄糖基，最終生成RA 的途徑被稱之為RA 生物合成途徑［14-15］。而在甜菊醇苷元的C-13位上連接的葡萄糖基上再連接鼠李糖基，生成DA、DB/RC 的RC 生物合成途徑，以及在葡萄糖基上再連接木質(zhì)糖基，生成RF 的生物合成途徑，有很多步驟仍然不甚明了［17］。

圖1 甜菊醇糖苷的生物合成途徑Fig.1 Biosynthetic pathways of steviol glycosides

在RA 生物合成的十幾步酶促反應中，最后5步酶促反應，即KAH 和4 種不同的UGTs，包括UGT85C2、UGT91D2m、UGT74G1、UGT76G1 的催化是關(guān)鍵步驟［18-24］。編碼這些酶的基因被認為是甜菊醇糖苷生物合成途徑的關(guān)鍵基因。

本研究通過克隆甜菊醇糖苷生物合成途徑中的關(guān)鍵基因UGT85C2、UGT91D2m和UGT76G1，構(gòu)建植物基因過量表達載體，以單獨或組合的形式將這些基因?qū)氲教鹑~菊中，對轉(zhuǎn)基因植株進行各種甜菊醇糖苷成分的變化分析，以期明確這些基因在甜菊醇糖苷生物合成中的單獨作用和相互影響，為培育RA 含量高的高品質(zhì)甜葉菊新品系提供了理論依據(jù)和技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料甜葉菊品系‘中山2 號’、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α 菌株、農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105、質(zhì)粒載體pKAFCR80、pKAFCR100 均由寧夏大學生命科學學院重點實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 甜菊醇糖苷生物合成關(guān)鍵基因的克隆 以甜葉菊葉片為材料，利用天根RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒提取總RNA，并使用天根TIANScript cDNA 第一鏈合成試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。

參照NCBI 等數(shù)據(jù)庫公開的甜葉菊SrUGT76G1（AY345974）、SrUGT85C2（AY345978）、SrUGT91-D2m（EU751291）基因的序列，利用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5.0 設(shè)計PCR 擴增引物，同時加入相應的限制性酶切位點（Sr76G1-S,A; Sr85C2-S,A;Sr91D2m-S,A; 表1）。以上述合成的cDNA 為模板，使用美國NEB Phusion High-Fidelity DNA Polymerase PCR 試劑盒對上述基因的全長進行擴增，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后用德國Qiagen QIAquick PCR Purification Kit 試劑盒提純。

1.2.2 過渡載體的構(gòu)建 利用Qiagen Qiaprep Spin Miniprep Kit 試劑盒，從大腸桿菌DH5α 提取pKAFCR80 和pKAFCR100 的載體DNA，采用本實驗室確定的方法構(gòu)建過渡載體、植物單個或多個基因過量表達載體［25］。

使用相應的限制性內(nèi)切酶將經(jīng)PCR 擴增、提純得到的SrUGT76G1、SrUGT85C2和SrUGT91D2m基因全長和pKAFCR80 過渡用載體進行雙酶切處理并分別進行連接反應，使目的基因的前后連接CAMV 35S 啟動子（cauliflower mosaic virus 35S promoter）和NOS 終止子（nopaline synthase terminator）（稱為基因組合），然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞，進行PCR 鑒定并測序驗證（引物CR80 MCS insert 35SS,A; 表1），構(gòu)建出3 種過渡載體。

1.2.3 單基因過量表達載體的構(gòu)建 3 種過渡載體從大腸桿菌DH5α 中提取后，使用相應的限制性內(nèi)切酶，將這3 個目的基因連同前后的35S 啟動子和NOS 終止子基因組合分別連接到 pKAFCR100 相應的酶切位點上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌以及菌落PCR 鑒定后測序驗證（引物CR100 Cla-S,CR80 MCS insert NOS-A;表1），構(gòu)建出3 種單基因過量表達載體（圖2）。

1.2.4 三基因過量表達載體的構(gòu)建 同樣通過雙酶切將上述SrUGT91D2m基因組合、SrUGT85C2基因組合依次連接到SrUGT76G1單基因過量表達載體上，經(jīng)大腸桿菌轉(zhuǎn)化以及菌落PCR 鑒定后測序驗證（引物Sr76G1-S,A; Sr85C2-S,A; Sr91D2m-S,A; 表1），最終形成1 種三基因過量表達載體（圖2）。

表1 PCR 擴增引物Table 1 Primers for PCR amplification

圖2 單基因或三基因共表達載體構(gòu)建示意圖Fig.2 Schematic structure of co-expression vectors of single genes or three genes

1.2.5 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定 將構(gòu)建好的3 種單基因過量表達載體以及1 種三基因過量表達載體，按照說明書步驟轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105 感受態(tài)細胞。

選取長勢良好的甜葉菊無菌苗的葉片作為實驗材料，利用農(nóng)桿菌介導法分別轉(zhuǎn)化上述4 種基因過量表達載體，轉(zhuǎn)化和培育過程按照實驗室確定的方法進行［26］。長出愈傷組織后觀察sGFP 熒光的表達情況。

利用植物基因組DNA 提取試劑盒提取4 種轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA，以野生型植株為陰性對照，PCR 鑒定導入的目的基因片段（引物Sr76G1-S,CR100 omega-A; CR100 Cla-S,Sr85C2-A; CR80 MCS insert NOS-S,Sr91D2m-A; 表1）。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因植株基因表達量的分析 PCR 鑒定的各種轉(zhuǎn)基因陽性植株和野生型對照植株在溫室培養(yǎng)3 個月（未開花）后，各選取10 株系，每株系頂部的3 對葉混合成1 個樣本。采用本實驗室確定的實時熒光定量PCR 方法檢測并計算SrUGT85C2、SrUGT91D2m和SrUGT76G1基因的相對表達量［27］。

1.2.7 轉(zhuǎn)基因植株甜菊醇糖苷含量的分析 采用實時熒光定量PCR 同樣的樣本提取植株中各種甜菊醇糖苷。甜菊醇糖苷的提取和測定采用本實驗室確定的方法［27-31］。

將甜菊醇糖苷標準品（日本W(wǎng)ako）用乙腈-水（80∶20,V/V）溶液配制成濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20 mg/mL 的標準品溶液系列。分別吸取15 μL 進樣，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標Y，以標準品進樣量（μg）為橫坐標X 進行線性回歸，計算回歸方程。

2 結(jié)果

2.1 甜菊醇糖苷生物合成關(guān)鍵基因的克隆

從甜葉菊葉片提取的總RNA，經(jīng)cDNA 合成，進行PCR 擴增，得到的SrUGT76G1、SrUGT85C2、SrUGT91D2m基因的長度分別為1 425 bp、1 511 bp、1 441 bp，均橫跨各基因的編碼區(qū)序列（coding sequence,CDS）區(qū)域，同時PCR 產(chǎn)物兩端分別引入相應的酶切位點（表1）。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增條帶大小正確（圖3）。

圖3 3 個基因PCR 擴增Fig.3 PCR amplification of 3 target genes

2.2 過渡載體的構(gòu)建

3 個基因的PCR 擴增產(chǎn)物提純后，利用雙酶切方法，將之分別構(gòu)建至pKAFCR80 過渡用載體上使目的基因的前后連接上35S 啟動子和NOS 終止子。獲得3 種過渡載體，分別命名為pNULPGE01001（pKAFCR80+SrUGT76G1）、pNULPGE01002（pKAFCR80+SrUGT85C2）、pNULPGE01003（pKAFCR80+SrUGT91D2m）。經(jīng)大腸桿菌轉(zhuǎn)化后菌落PCR 鑒定，確認陽性菌落里插入到pKAFCR80 過渡載體的目的基因片段條帶大小正確，分別為1 675 bp、1 764 bp、1 693 bp（圖4）。經(jīng)測序，與NCBI 公布的序列一致。

圖4 3 個基因以單獨形式連接至pKAFCR80 過渡載體后菌落PCR 鑒定Fig.4 Colony PCR identification of the 3 genes individually constructed into pKAFCR80 intermediate vector

2.3 單基因過量表達載體的構(gòu)建

3 種過渡載體，雙酶切處理后將目的基因連同前后的35S 啟動子和NOS 終止子的SrUGT76G1、SrUGT85C2和SrUGT91D2m基因組合片段，分別單獨連接到pKAFCR100 上，構(gòu)建出3 種單基因過量表達載體（圖2），分別命名為：pNULPGE01101：pKAFCR100+SrUGT76G1基因組合（35S 啟動子+SrUGT76G1+NOS 終止子）；pNULPGE01102：pKAFCR100+SrUGT85C2基因組合（35S 啟動子+SrUGT85C2+NOS 終止子）；pNULPGE01103：pKAFCR100+SrUGT91D2m基因組合（35S 啟動子+SrUGT91D2m+NOS 終止子）。

根據(jù)大腸桿菌轉(zhuǎn)化后菌落PCR 電泳和測序可以確認陽性菌落里插入到pKAFCR100 的目的基因組合存在，且大小和序列正確，分別為2 901 bp、2 808 bp、2 919 bp（圖5）。

圖5 3 個基因以單獨形式連接至pKAFCR100 二元表達載體后菌落PCR 鑒定Fig.5 Colony PCR identification of the 3 genes individually constructed into pKAFCR100 binary vector

2.4 三基因過量表達載體的構(gòu)建

過渡載體雙酶切后的SrUGT91D2m基因組合、SrUGT85C2基因組合，依次連接到pNULPGE01101（pKAFCR100+SrUGT76G1基因組合）相應的酶切位點上。經(jīng)菌落PCR 和測序驗證無誤（圖6），最終構(gòu)建出含有3 個基因組合的過量表達載體（圖2），pNULPGE01105：pKAFCR100+SrUGT76G1基因組合+SrUGT91D2m基因組合+SrUGT85C2基因組合。

圖6 3 個基因以組合形式連接至pKAFCR100 二元表達載體菌落PCR 鑒定Fig.6 Colony PCR identification of 3 genes in combination constructed into pKAFCR100 binary vector

2.5 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

4 種基因過量表達載體利用農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化甜葉菊無菌苗葉片后，在含有抗生素的培養(yǎng)基上誘導形成了愈傷組織，進一步培育成完整植株。分別以目的基因和表達載體特有序列設(shè)計嵌合引物，經(jīng)基因組PCR 鑒定，獲得陽性再生植株（圖7-圖8），說明了構(gòu)建到基因過量表達載體的SrUGT76G1、SrUGT85C2和SrUGT91D2m三個基因已經(jīng)按單獨或組合的形式導入到這些PCR 陽性的甜葉菊植株。而野生型對照甜葉菊植株，PCR 鑒定為陰性，說明了PCR 引物設(shè)計是正確的。4 種基因過量表達載體的轉(zhuǎn)基因植株分別命名為Sr01101、Sr01102、Sr01103和Sr01105。

圖7 3 個基因以單獨形式轉(zhuǎn)化植株的PCR 鑒定Fig.7 PCR identification of the transgenic plant transferred 3 genes individually

圖8 3 個基因以組合形式轉(zhuǎn)化植株的PCR 鑒定Fig.8 PCR identification of the transgenic plant transferred 3 genes in combination

2.6 轉(zhuǎn)基因植株基因表達量分析

根據(jù)實時熒光定量PCR 的結(jié)果，以野生型甜葉菊植株為對照，相對定量計算出導入基因在轉(zhuǎn)基因陽性植株中的相對表達量和標準誤。單獨導入SrUGT85C2的轉(zhuǎn)基因植株（Sr01102）中，其相對表達量增加了8.3 倍；單獨導入SrUGT91D2m的轉(zhuǎn)基因植株（Sr01103）中其相對表達量增加了10.26倍；單獨導入SrUGT76G1的轉(zhuǎn)基因植株（Sr01101）中其相對表達量增加了15.22 倍；3 個基因組合同時導入的轉(zhuǎn)基因植株（Sr01105）中，三基因的相對表達量分別增加了9.76、8.88、11.69 倍（圖9）。說明這些導入基因甜葉菊轉(zhuǎn)基因陽性植株中達到了過量表達的效果，且各轉(zhuǎn)基因植株生長情況良好（圖10）。

圖9 各種轉(zhuǎn)基因植株的基因相對表達量Fig.9 Gene relative expressions in transgenic plantlets

圖10 各種轉(zhuǎn)基因植株與野生型對照植株Fig.10 Transgenic plantlets and wild-type plantlets

2.7 轉(zhuǎn)基因植株甜菊醇糖苷含量的分析

以野生型甜葉菊植株為對照，利用HPLC 方法分別對4 種不同基因過量表達載體誘導形成的甜葉菊轉(zhuǎn)基因植株進行甜菊醇糖苷含量的分析。

根據(jù)不同濃度的甜菊醇糖苷的標準品溶液的色譜圖，得到各種甜菊醇糖苷的回歸方程。其中ST 的回歸方程為Y= 3 251 326.26X+ 4 582.59,R2= 0.997 5；RA 的回歸方程為Y= 2 394 407.22X+2 280.21,R2= 0.999 1，從而計算得出不同轉(zhuǎn)基因植株中各種甜菊醇糖苷的含量。

結(jié)果表明，在所有的甜葉菊植株中，總甜菊醇糖苷（SGs）含量在12.74%-16.12%。單獨導入SrUGT85C的轉(zhuǎn)基因植株（Sr01102）中，總SGs、ST、RA 含量以及RA/SGs 與對照沒有明顯變化，而SMono 含量最高，達到1.57%，是對照的1.3 倍。單獨導入SrUGT91D2m的轉(zhuǎn)基因植株（Sr01103）的SBio 含量最高，達到1.1%，是對照的1.7 倍；而SMono 含量最低，僅為0.68%，減少1.9 倍；SGs、ST 含量提高，RA 含量沒有明顯變化。單獨導入SrUGT76G1的轉(zhuǎn)基因植株（Sr01101）中，總SGs 含量顯著提高；RA 含量最高，達到10.77%，比對照提高2.0 倍；RA/SGs 也最高，達到71.7%，提高了1.8倍；而ST 的含量最低，僅為2.49%，減少2.2 倍。3個基因共表達的轉(zhuǎn)基因植株（Sr01105）中，總SGs含量顯著提高；RA 含量、RA/SGs 比例比對照分別提高1.8 倍和1.3 倍；Sbio 含量提高而ST 含量降低（表2）。

表2 不同轉(zhuǎn)基因植株中各種甜菊醇糖苷的含量Table 2 Variety of steviol glycosides contents in different transgenic plant

3 討論

本研究從甜葉菊葉片克隆了SrUGT85C2、SrUGT91D2m和SrUGT76G13 個關(guān)鍵基因，構(gòu)建植物基因過量表達載體，以單獨或組合的形式將這些基因?qū)氲教鹑~菊中進行過量表達，對轉(zhuǎn)基因植株進行了導入基因相對表達量以及各種甜菊醇糖苷成分的變化分析。從基因單獨過量表達的結(jié)果看，單獨導入SrUGT85C2的轉(zhuǎn)基因植株中，總甜菊醇糖苷、ST、RA 含量以及RA 占總甜菊醇糖苷含量比例與野生型甜葉菊對照植株相比沒有明顯變化，而SMono 含量提高了1.3 倍。因為SrUGT85C2 能夠催化甜菊醇甜菊醇C-13 位上發(fā)生糖基化連接第一個葡萄糖基，生成第一個甜菊醇糖苷—SMono，從而開啟了各種甜菊醇糖苷的生物合成。但是單獨導入SrUGT85C2的轉(zhuǎn)基因植株的其他甜菊醇糖苷含量與對照相差不大，這可能是由于SrUGT85C2屬于比較上游的基因，合成SMono 后，由于合成途徑分支多，產(chǎn)物分散，效果不容易顯現(xiàn)。RA 合成途徑中從SMono 轉(zhuǎn)化成SBio 也是重要的一步酶促反應，這一過程以前一直未得到確認。從專利和一些基因庫的資料推測該UGT 的序列，克隆了SrUGT91D2m基因。單獨導入SrUGT91D2m的轉(zhuǎn)基因植株的SMono 含量顯著降低1.9 倍，而SBio 含量顯著增加1.7 倍，證明了SrUGT91D2m能夠催化甜菊醇C-13 位上再次連接第2 個葡萄糖基，轉(zhuǎn)化SMono 生成SBio。但SrUGT91D2m仍屬于上游基因，對其他甜菊醇糖苷生物合成的影響作用比較分散；有報道SrUGT91D2m有多種同源基因，甚至能夠催化甜菊醇C-19 位上連接第2 個葡萄糖基，生成RE 或RD［21,32］。

單獨導入SrUGT76G1的轉(zhuǎn)基因甜葉菊植株中，總甜菊醇糖苷含量明顯提高，特別是RA 含量比對照提高了2 倍，達到10%以上；RA 占總甜菊醇糖苷總量比例提高1.8 倍，而ST 含量減少了一半以上。該效果優(yōu)于以前報道的在甜葉菊植株中過量表達該基因（RA 含量從0.79%提高到1.87%）［24］。SrUGT76G1能夠催化甜菊醇苷元C-13 位上連接第3個葡萄糖基（在第一個葡萄糖基上再連接一個葡萄糖基），將ST 生成轉(zhuǎn)化為RA，它是甜菊醇糖苷生物合成途徑中合成RA 的最后一個關(guān)鍵酶［23-24,33］。SrUGT76G1與底物具有很高的親和力，這種高親和力可以提高RA 合成前體物的合成量，從而使RA的合成量也提高［19］。SrUGT76G1基因的表達量與RA 的積累存在極顯著的相關(guān)性，直接影響著RA 的積累［27］。前人利用RNAi 技術(shù)有針對性地研究了SrKAH、SrUGT85C2、SrUGT74G1和SrUGT76G1四個基因的功能，其中，SrUGT76G1的沉默使得甜菊醇糖苷的減少量最多。本研究也證明了單獨導入過量表達SrUGT76G1基因，能顯著提高甜葉菊細胞內(nèi)RA 的合成，該提高是由于SrUGT76G1催化ST 生成轉(zhuǎn)化為RA 的結(jié)果。ST 具有一定的苦味，RA 的甜味最接近蔗糖，是最理想的甜味成分，通過過量表達SrUGT76G1基因能夠提高RA 含量，而且甜味更純正，達到了我們轉(zhuǎn)基因培育甜葉菊優(yōu)良品系的目的。

3 個基因同時導入SrUGT85C2、SrUGT91D2m和SrUGT76G1的轉(zhuǎn)基因植株與單獨導入SrUGT76G1的轉(zhuǎn)基因植株沒有太大的差別，總甜菊醇糖苷總量明顯提高；RA 含量、RA 占總甜菊醇糖苷總量比例比對照分別提高1.8 倍和1.3 倍，但ST 含量降低沒有那么明顯。說明了多個基因的共同作用和影響是相當復雜的，甜葉菊體內(nèi)各種甜菊醇糖苷的生物合成可能存在一定的平衡，上游基因SrUGT85C2、SrUGT91D2m的過量表達牽涉到其他甜菊醇糖苷以及其他代謝物的合成。有報道各種甜菊醇糖苷的生物合成不單單受功能基因即各種UGTs 的影響，還受到轉(zhuǎn)錄因子如SrWRKY71 和miRNA 如miRStv_11、miR319g 的調(diào)控［34-35］，其規(guī)律還有待以后進一步研究。

甜菊醇糖苷生物合成途徑中還有一個關(guān)鍵基因SrUGT74G1。與SrUGT76G1 不同，SrUGT74G1主要催化甜菊醇苷元在C-19 位上發(fā)生糖基化連接第一個葡萄糖基，在RA 生物合成途徑中催化Sbio 生成ST。因為ST 帶有一定的苦味，影響了甜菊醇糖苷的口味和商業(yè)利用價值，所以本研究沒有對該基因進行過量表達實驗。以上這些結(jié)果為以后通過分子生物學技術(shù)來調(diào)控甜菊醇糖苷生物合成關(guān)鍵基因的表達，培育RA 含量高的高品質(zhì)甜葉菊新品系提供了理論依據(jù)和技術(shù)方法。

4 結(jié)論

從甜葉菊葉片克隆到SrUGT85C2、SrUGT91D2m和SrUGT76G1基因，將這些基因以單獨或組合形式在甜葉菊中過量表達，單獨導入SrUGT76G1能夠顯著提高總糖苷，特別是RA 的含量。