辣椒鋅指蛋白DnaJ-Like基因家族鑒定及對(duì)高溫脅迫的表達(dá)響應(yīng)

段敏杰 李怡斐 楊小苗 王春萍 黃啟中 黃任中 張世才

（1.重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，重慶 401329；2.重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，重慶 401329）

DnaJ 蛋白是一類分子量為41 kD 的熱激蛋白（Hsp40），最早在大腸桿菌（Escherichia coli）中發(fā)現(xiàn)，又稱為J-蛋白［1］。J-蛋白通常包含4 個(gè)功能結(jié)構(gòu)域：N 末端J-結(jié)構(gòu)域、G/F 結(jié)構(gòu)域、鋅指結(jié)構(gòu)域（CxxCxGxG）及羧基末端區(qū)［2-3］。其中J-結(jié)構(gòu)域具有極其保守的組氨酸/脯氨酸/天冬氨酸（His/Pro/Asp，HPD）三肽，是J-蛋白最核心特征［4］。J-蛋白通常作為伴侶蛋白，與熱激蛋白HSP70 結(jié)合，參與蛋白質(zhì)折疊、展開(kāi)、組裝和降解，并維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定［5］。然而越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)DanJ 蛋白的一些活性并不依賴于完整的J-結(jié)構(gòu)域，如當(dāng)HPD 三肽發(fā)生突變甚至缺失的情況下，DanJ 蛋白仍能保持其活性［6-7］，這類蛋白被劃分至J-Like 蛋白。依據(jù)擬南芥（Arabidopsis thaliana）的分類方式［8］，該類蛋白可分為三類：具有類似J-結(jié)構(gòu)域的DNAJD 蛋白，具有類似鋅指結(jié)構(gòu)域和C 末端結(jié)構(gòu)域的DNAJF 蛋白，具有位于羧基端重復(fù)DnaJ CxxCxGxG 或GRXLike（GRL）CxxCx7CxxC 鋅指結(jié)構(gòu)域的DnaJ-like 鋅指蛋白（DNAJE）［8-12］，DNAJE 蛋白是目前研究最多、最為復(fù)雜的一類J-Like 蛋白。

已有研究表明，DNAJE 蛋白在植物光合復(fù)合體組裝中發(fā)揮重要作用，而光合復(fù)合體組裝對(duì)環(huán)境干旱、溫度、光照等的改變非常敏感，每一種變化都會(huì)引起植物氧化還原反應(yīng)的失衡，進(jìn)而影響植物抗逆性［13］。最早在玉米（Zea maysL.）中鑒定到一個(gè)DNAJE基因BSD2［14］，之后在萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）中鑒定到同源BSD2基因［15］，該基因能夠通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控rbcl 蛋白，從而促進(jìn)葉綠體功能的正常發(fā)揮。同時(shí)，在擬南芥［16-20］、百脈根（Lotus corniculatusL.）［20］等中也鑒定到CYO1、SCO2、ANGULATA7等DNAJE基因，其均與葉綠體發(fā)育相關(guān)，在維持氧化還原反應(yīng)和光合作用平衡中發(fā)揮作用。Fristedt 等［21］和Lu等［22］研究也發(fā)現(xiàn)，DNAJE 蛋白在光系統(tǒng)Ⅱ的維護(hù)和光系統(tǒng)Ⅰ積累中發(fā)揮特殊作用。目前，所有分離鑒定已知功能的DNAJE 蛋白中，僅THRUMIN1 屬于GRL CxxCx7CxxC 型，其他均為DnaJ CxxCxGxG 型鋅指蛋白［23］。

植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)遭受諸多不利環(huán)境因子脅迫，如高溫、低溫、干旱、鹽等，導(dǎo)致正常生長(zhǎng)發(fā)育受阻，從而影響產(chǎn)量和品質(zhì)［24］。辣椒（Capsicum annuum）為一年生或多年生茄科（Solanaceae）作物，是全球種植面積最大的蔬菜作物和消費(fèi)量最大的辛辣調(diào)味品［25］。辣椒喜溫不耐熱，最適生長(zhǎng)溫度為22-28℃，溫度超過(guò)32℃，會(huì)產(chǎn)生不可逆熱害癥狀，導(dǎo)致其生長(zhǎng)發(fā)育不良，造成減產(chǎn)，嚴(yán)重制約辣椒產(chǎn)業(yè)發(fā)展［24］。目前在辣椒中還未見(jiàn)DNAJE基因家族的相關(guān)報(bào)道，辣椒全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)［26］的公布為辣椒DNAJE基因家族的鑒定和分析提供了條件。

本研究對(duì)辣椒DNAJE基因家族進(jìn)行鑒定，系統(tǒng)分析基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、進(jìn)化關(guān)系、啟動(dòng)子順式作用元件、共線性關(guān)系及不同組織器官的表達(dá)模式等，并研究其在高溫脅迫下的生理生化和基因表達(dá)特征，為進(jìn)一步探究辣椒DNAJE基因響應(yīng)高溫脅迫機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為課題組耐熱育種骨干親本862。挑選籽粒飽滿一致的辣椒種子，播種于10 cm ×10 cm營(yíng)養(yǎng)缽中，溫室育苗。待幼苗長(zhǎng)至5-6 片真葉時(shí)轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)箱適應(yīng)性生長(zhǎng)，晝夜溫度/光周期設(shè)定為26℃/12 h 和22℃/12 h，光照強(qiáng)度4 000 lx，每日定時(shí)澆水，控制空氣相對(duì)濕度為70%。培養(yǎng)3 d 后調(diào)整培養(yǎng)箱晝夜溫度至40℃/30℃，進(jìn)行高溫脅迫處理，對(duì)照組為26℃/22℃，光周期、光照強(qiáng)度、空氣相對(duì)濕度保持不變。分別于處理0、1、3、5、7、10 d 時(shí)取葉片經(jīng)液氮速凍后，-80℃保存?zhèn)溆?。每次取樣隨機(jī)選擇10 株，重復(fù)3 次。

1.2 方法

1.2.1 辣椒DNAJE基因家族鑒定和特征分析 從國(guó)家基因庫(kù)核酸序列歸檔系統(tǒng)（CNSA）（https://db.cngb.org/cnsa/）和茄科基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.sgn.cornell.edu/） 分別下載辣椒Zunla 1 和番茄（Solanum lycopersicumL.）全基因組數(shù)據(jù)，構(gòu)建本地蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)；從Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pfam.xfam.org/）獲得鋅指（zinc finger）結(jié)構(gòu)域DnaJ_CxxCxGxG HMM 模型文件PF00684，通過(guò)本地Hmmsearch 命令初步篩選獲得DNAJE基因家族成員；參考已發(fā)表文獻(xiàn)［8,10］從擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.arabidopsis.org/）獲得33 個(gè)擬南芥DNAJE基因家族成員蛋白序列，與辣椒和番茄蛋白序列進(jìn)行本地Blastp 比對(duì)，收集E-value<1e-5 輸出基因，剔除重復(fù)序列后，與HMM 檢索結(jié)果合并；將合并的候選序列上傳至Pfam、NCBI CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）及SMART（http://smart.emblheidelberg.de/），基于DNAJE 結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步比對(duì)篩選。利用ExPASy（https://web.expasy.org/compute_pi/）計(jì)算辣椒DNAJE 蛋白分子量和等電點(diǎn)，利用WoLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）在線分析工具進(jìn)行DNAJE 蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；利用在線軟件SOPMA（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)分析DNAJE 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.2 辣椒DNAJE基因家族染色體定位和比較進(jìn)化關(guān)系分析 基于獲取的辣椒基因組注釋信息文件，利用TBtools［27］可視化工具構(gòu)建辣椒染色體定位圖；利用MEGA 5.0 軟件的鄰近法（neighbour-joining,NJ）構(gòu)建辣椒、番茄和擬南芥DNAJE 進(jìn)化樹(shù)，設(shè)置Bootstrap 值為1 000，置換模型為P-distance，其他為默認(rèn)參數(shù)；利用在線軟件iTOL（http://itol.embl.de/）對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行美化。

1.2.3 辣椒DNAJE基因家族保守基序、基因結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子作用元件分析 利用MEME（https://memesuite.org/meme/tools/meme） 在線軟件預(yù)測(cè)分析DNAJE 蛋白保守motif，motif 最大發(fā)現(xiàn)數(shù)設(shè)定為5個(gè)，其他參數(shù)默認(rèn)。利用TBtools 軟件分析DNAJE基因結(jié)構(gòu)，利用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線軟件分析基因啟動(dòng)子順式作用元件，利用MEGA 5.0 構(gòu)建辣椒DNAJE基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，方法參數(shù)同上，利用TBtools 軟件對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.2.4 辣椒和擬南芥DNAJE基因家族共線性及RNA-seq 分析 利用TBtools 軟件中Fasta stats 和Table Row 功能構(gòu)建辣椒和擬南芥染色體骨架、DNAJE基因位置，再利用其One step MCscanX（Super Fast）和Advanced circos 插件對(duì)辣椒和擬南芥進(jìn)行共線性分析；從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE45037） 下載葉、花、莖、根及不同時(shí)期果實(shí)的RNA-seq 數(shù)據(jù)，提取DNAJE基因家族成員TPM 值并繪制基因表達(dá)熱圖。

1.2.5 辣椒高溫脅迫響應(yīng)相關(guān)基因RT-qPCR 分析 利用FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit（Vazyme）提取樣品總RNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析RNA 質(zhì)量，NanoDrop 2000 超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度，利用Hiscript Ⅲ 1st strand cDNA Synthesis Kit（Vazyme）試劑反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；利用Primer 5.0 設(shè)計(jì)特異性引物，并在NCBI Primer-BLAST（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast/）進(jìn)行特異性驗(yàn)證，以UBI3為內(nèi)參基因（表1）。參照ChamQ universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme）試劑操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RT-qPCR 分析。采用2-△△Ct算法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，使用EXCEL、Origin 2021、SPSS 18.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及作圖。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物Table 1 Primers used for quantitative real-time PCR

1.2.6 高溫脅迫下辣椒幼苗的生理生化響應(yīng) 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、過(guò)氧化物酶（peroxidase,POD）和過(guò)氧化氫酶（catalase,CAT）活性及丙二醛（malondialdehyde,MDA）、過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide,H2O2）含量測(cè)定參照試劑盒說(shuō)明書(shū)（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行操作，采用Thermo MULTISKAN GO 型酶標(biāo)儀分別測(cè)定不同波長(zhǎng)下吸光度，計(jì)算酶活性或含量，利用EXCEL、Origin 2021 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及作圖。

2 結(jié)果

2.1 辣椒DNAJE基因家族鑒定與分析

本研究在Zunla 1 和番茄基因組中分別鑒定獲得28 個(gè)和26 個(gè)DNAJE基因家族成員，依據(jù)其在染色體上的位置將辣椒DNAJE基因命名為CaDNAJE1-CaDNAJE28。對(duì)所有CaDNAJE 蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果（附表1）顯示，CaDNAJE基因序列開(kāi)放閱讀框（ORF）長(zhǎng)度范圍為297-1 410 bp，變化范圍較大。CaDNAJE 蛋白氨基酸序列長(zhǎng)度在99（CaDNAJE23）-470（CaDNAJE18）個(gè)之間，分子量變化范圍為10.05（CaDNAJE23）-52.26（CaDNAJE18）kD，理論等電點(diǎn)（pI）為4.75（CaDNAJE7）-9.64（CaDNAJE20）。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，CaDNAJE 蛋白主要定位在葉綠體、細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明（附表2），28 個(gè)CaDNAJE 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)完整，以無(wú)規(guī)卷曲（random coil）和α-螺旋（α-helix）為主。

2.2 辣椒DNAJE基因家族染色體定位和進(jìn)化關(guān)系分析

28 個(gè)CaDNAJE基因不均勻分布在辣椒除7 號(hào)和8 號(hào)染色體之外的10 條染色體上，另外有3 個(gè)基因未錨定在染色體上（圖1）。其中，1 號(hào)和9 號(hào)染色體上分布最多，均有5 個(gè)；3 號(hào)和11 號(hào)染色體上各包含3 個(gè)；2 號(hào)、6 號(hào)和10 號(hào)染色體上各有2 個(gè)；而4 號(hào)、5 號(hào)和12 號(hào)染色體上只有1 個(gè)成員。

圖1 辣椒DNAJE 基因家族成員染色體定位Fig.1 Chromosomal location of DNAJE gene family members in pepper（Capsicum annuum）

為探討辣椒、番茄和擬南芥DNAJE基因家族成員之間的進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建了28 個(gè)辣椒、26 個(gè)番茄和33 個(gè)擬南芥DNAJE 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2）。進(jìn)化結(jié)果分為2 個(gè)亞族，Group Ⅰ和 Group Ⅱ。Group Ⅰ 有16 個(gè)辣椒成員、15 個(gè)番茄成員和20 個(gè)擬南芥成員，屬于DNAJ CxxCxGxG 型DNAJE 鋅指蛋白。Group Ⅱ 中有12 個(gè)辣椒成員、11 個(gè)番茄成員和13 個(gè)擬南芥成員，屬于GRL CxxCx7CxxC 型DNAJE 鋅指蛋白。

圖2 辣椒、擬南芥和番茄DNAJE 基因家族成員進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of DNAJE gene family members in pepper,Arabidopsis and tomato（Solanum lycopersicum）

2.3 辣椒DNAJE基因家族成員保守基序、順式作用元件及基因結(jié)構(gòu)分析

基于MEME 在線分析軟件，在CaDNAJE 蛋白中分析了5 個(gè)保守motif（圖3-B），基序長(zhǎng)度介于15-45 個(gè)氨基酸之間（表2）。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示（ 圖3-A），Group Ⅰ 中CaDNAJE13 和CaDNAJE25 分別缺失motif 2 和motif 5 基序，其他10 個(gè)成員均包含motif 1-motif 5 保守基序；Group Ⅱ所有16 個(gè)成員均缺失motif 2、motif 3 和motif 5，只包含motif 1 和motif 4 保守基序。

表2 辣椒DNAJE 蛋白氨基酸保守基序Table 2 Conserved motif of the DNAJE proteins in pepper

基因結(jié)構(gòu)分析表明（圖3-C），同一亞族內(nèi)成員具有相似的基因結(jié)構(gòu)，但不同亞家族間基因結(jié)構(gòu)和內(nèi)含子數(shù)目存在明顯差異。Group Ⅰ 中除CaDNAJE2和CaDNAJE26外，均只包含1 個(gè)外顯子，大部分成員無(wú)內(nèi)含子；Group Ⅱ 中成員具有0-11 個(gè)內(nèi)含子，其中具有4 個(gè)以上內(nèi)含子的占比為56%，CaDNAJE19和CaDNAJE16內(nèi)含子數(shù)目最多，CaDNAJE23和CaDNAJE20只包含1 個(gè)內(nèi)含子，CaDNAJE27無(wú)內(nèi)含子。

利用在線工具對(duì)該家族基因啟動(dòng)子順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖3-D 所示。多個(gè)CaDNAJE基因啟動(dòng)子區(qū)富集了光響應(yīng)（GATA-motif、G-box）、MeJA 響應(yīng)（TGACG-motif）、脫落酸響應(yīng)（ABRE）、水楊酸響應(yīng)（TCA-element）、MYB 結(jié)合位點(diǎn)參與干旱誘導(dǎo)（MBS）、低溫響應(yīng)（LTR）、防御與脅迫響應(yīng)（TC-rich repeat）、晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)（circadian）等順式作用元件。其中，TGACG-motif 和ABRE 較多，而MSA-like 和TGA-element 分別僅在CaDNAJE15和CaDNAJE20中被檢測(cè)到。

圖3 辣椒DNAJE 基因家族保守基序、基因結(jié)構(gòu)和順式作用元件分析Fig.3 Analysis of conserved motifs,gene structure and cis-acting elements of DNAJE gene family in pepper

2.4 辣椒與擬南芥DNAJE基因家族成員共線性分析

共線性分析結(jié)果（圖4）顯示，辣椒和擬南芥之間有10 對(duì)DNAJE共線性基因，辣椒中9 個(gè)對(duì)應(yīng)擬南芥中10 個(gè)DNAJE基因。分別為CaDNAJE1/AT4G10630、CaDNAJE4/AT5G06470、CaDNAJE4/AT3G11773、CaDNAJE7/AT3G28850、CaDNAJE8/AT5G61670、CaDNAJE10/AT4G13670、CaDNAJE11/AT1G75690、CaDNAJE13/AT5G58530、CaDNAJE18/AT5G03870、CaDNAJE21/AT2G41330 直系同源基因?qū)?。其中，CaDNAJE4基因在擬南芥中有2 個(gè)共線性基因，表明該基因發(fā)生了擴(kuò)張。此外，在辣椒中僅有CaDNAJE12/CaDNAJE21之間存在共線性關(guān)系，表明該基因家族種內(nèi)共線性基因較少。

圖4 辣椒和擬南芥DNAJE 基因家族共線性分析Fig.4 Collinearity analysis of DNAJE gene family between pepper and Arabidopsis

2.5 辣椒DNAJE基因家族表達(dá)模式分析

利用GEO Datasets 中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)辣椒DNAJE基因家族組織特異性表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5。辣椒DNAJE基因在不同組織及果實(shí)中有明顯表達(dá)差異，28 個(gè)基因可以分為4 類。CaDNAJE1、CaDNAJE4、CaDNAJE6等A 類基因在辣椒各組織中表達(dá)量都很低甚至不表達(dá)，多數(shù)為Group Ⅱ 基因；B 類4 個(gè)基因中僅CaDNAJE26在葉和花芽中表達(dá)量相對(duì)較高；C 類CaDNAJE 5、CaDNAJE 27、CaDNAJE 23等基因在花和幼果中高表達(dá)；D 類基因多數(shù)為Group Ⅰ 基因，除CaDNAJE2、CaDNAJE10、CaDNAJE20在0-1 cm 幼果或葉和花芽中幾乎不表達(dá)外，其他基因在各組織中均高表達(dá)。

圖5 DNAJE 基因在辣椒不同組織及果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)分析Fig.5 Expression profile analysis of pepper DNAJE genes in different tissues and fruit development

2.6 辣椒高溫脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)分析

通過(guò)分析NCBI SRA 數(shù)據(jù)庫(kù)中辣椒高溫脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（SRP187794），對(duì)表達(dá)顯著差異的12 個(gè)CaDNAJE基因和3 個(gè)Hsf/HSP 耐熱相關(guān)基因進(jìn)行高溫脅迫RT-qPCR 分析（圖6）。其中，CaHSP22、CaHSP16.4和CaHsfB5基因受高溫脅迫表達(dá)水平極顯著升高，隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，CaHSP22、CaHSP16.4表達(dá)呈下降趨勢(shì)；辣椒DNAJE基因中除CaDNAJE24負(fù)向調(diào)控辣椒響應(yīng)高溫脅迫，表達(dá)水平下調(diào)外，其他11 個(gè)基因均呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)表達(dá)，但在不同脅迫時(shí)期的表達(dá)模式有所差異。CaDNAJE2、CaDNAJE3、CaDNAJE13和CaDNAJE21這4 個(gè)基因在1 d 時(shí)表達(dá)水平最高，之后呈下降趨勢(shì)；CaDNAJE11基因在1、7 和10 d 時(shí)表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照，且在7 d 時(shí)表達(dá)水平最高；CaDNAJE15基因在脅迫1、3、5 d 時(shí)表達(dá)水平基本持平，之后降低；CaDNAJE17、CaDNAJE19、CaDNAJE23和CaDNAJE27這4 個(gè)基因表達(dá)基本呈現(xiàn)先升后降再升趨勢(shì)，均在5 d 時(shí)達(dá)到最高。CaDNAJE基因在高溫脅迫下的高表達(dá)，表明其作為應(yīng)激蛋白可能在辣椒響應(yīng)高溫脅迫中起調(diào)節(jié)作用，以維持辣椒正常的生長(zhǎng)發(fā)育。

圖6 辣椒高溫脅迫相關(guān)基因表達(dá)分析Fig.6 Expression analysis of genes related to high temperature stress in pepper

2.7 高溫脅迫下辣椒幼苗的生理生化響應(yīng)

當(dāng)植物遭遇高溫等逆境脅迫時(shí)，會(huì)造成體內(nèi)H2O2積累，威脅植物細(xì)胞膜系統(tǒng)，導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物MDA 含量升高。同時(shí)，植物自身SOD、POD、CAT 等抗氧化保護(hù)酶系統(tǒng)啟動(dòng)，參與植物對(duì)外界逆境脅迫的響應(yīng)。由圖7可知，隨著高溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，H2O2含量急劇升高，5 d 達(dá)到最高的5.36 μmol/g，之后開(kāi)始下降；MDA 含量呈上升趨勢(shì)，10 d 時(shí)比處理前增幅437.01%；SOD 酶活性呈先升后降趨勢(shì)，在3 d 時(shí)活性達(dá)到頂峰的188.0 U/g，相比對(duì)照，3-10 d 酶活性升高幅度為24.7%-66.1%；POD 酶活性整體呈上升趨勢(shì)，在10 d 時(shí)達(dá)到最高的3 819.88 U/g，相比對(duì)照，3 d 時(shí)活性提升幅度最大，為75.5%；CAT 酶活性前期變化不大，但在10 d 時(shí)酶活性明顯升高，達(dá)到276.91 nmol/（min·g），為對(duì)照（40.25 nmol/（min·g））的6.9 倍。

圖7 辣椒幼苗對(duì)高溫脅迫的生理生化響應(yīng)Fig.7 Physiological and biochemical responses of pepper seedlings to high temperature stress

3 討論

近年來(lái)，隨著辣椒全基因組數(shù)據(jù)的公布［26-28］和生物信息學(xué)方法的不斷完善，研究人員已對(duì)辣椒DnaJ［29］、B-BOX［30］、MYB［31］、AP2/ERF［32］等多個(gè)基因家族進(jìn)行了鑒定分析，但辣椒DNAJE基因家族系統(tǒng)鑒定和分析還未見(jiàn)報(bào)道。本研究基于Zunla 1全基因組數(shù)據(jù)，對(duì)辣椒DNAJE基因家族進(jìn)行鑒定，從基因結(jié)構(gòu)特征、系統(tǒng)進(jìn)化、順式作用元件、共線性關(guān)系、組織特異性表達(dá)及高溫脅迫響應(yīng)等多方面進(jìn)行了分析和研究。

3.1 植物DNAJE基因功能分析

HSP70 是植物主要伴侶蛋白家族之一，在蛋白質(zhì)量控制中起非常重要的作用。DnaJ 蛋白（HSP40）是HSP70 的共同伴侶，他能識(shí)別未折疊的底物并將其傳遞給HSP70，刺激ATP 酶活性，誘導(dǎo)伴侶構(gòu)象改變，進(jìn)而穩(wěn)定其與底物的相互作用［33］。DNAJE 蛋白擁有類似于DnaJ 蛋白中參與結(jié)合底物的鋅指結(jié)構(gòu)域［34］，而缺乏典型的J-結(jié)構(gòu)域，能夠不依賴HSP70和J-結(jié)構(gòu)域，直接與底物結(jié)合發(fā)揮作用。已有研究證實(shí)，ORANGE 蛋白作為DNAJE 蛋白家族一員，通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控植物烯合成酶PSY 以及通過(guò)抑制細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄因子TCP14 活性調(diào)控色素合成和葉綠體發(fā)育［35-37］。本研究在辣椒中鑒定出28 個(gè)DNAJE基因，進(jìn)化分析顯示，辣椒、番茄和擬南芥DNAJE 蛋白被劃分至2 個(gè)亞族，每個(gè)亞族中辣椒、番茄和擬南芥成員分布情況相似，說(shuō)明其具有較近的同源關(guān)系。啟動(dòng)子順式作用元件對(duì)基因轉(zhuǎn)錄及調(diào)控具有非常重要的作用［38］。分析發(fā)現(xiàn)，DNAJE基因啟動(dòng)子區(qū)域包含大量光響應(yīng)、激素響應(yīng)和脅迫應(yīng)答元件。結(jié)果表明，DNAJE基因可能不僅參與光系統(tǒng)調(diào)控，也參與了激素響應(yīng)和脅迫應(yīng)答。諸多研究已經(jīng)證實(shí)了這點(diǎn)，Amiya 等［13］報(bào)道了一個(gè)萊茵衣藻DNAJE 類囊體相關(guān)蛋白ZnJ6，其能與氧化還原酶、光合蛋白等相互作用，防止因外界環(huán)境脅迫使蛋白發(fā)生錯(cuò)誤折疊和聚集，從而維持氧化還原和光合平衡，提升抗逆性。Hartings 等［39］在擬南芥中分離了HCF222基因，具有二硫化物還原酶活性，參與細(xì)胞色素b6f 組裝，進(jìn)而影響PSII 和PSI 光合復(fù)合物的合成；Ham 等［40］通過(guò)對(duì)煙草（Nicotiana tabacum）DNAJE基因Tsip1的研究發(fā)現(xiàn)，其能夠與Tsi1轉(zhuǎn)錄因子互作，激活下游水楊酸反應(yīng)基因，進(jìn)而參與煙草抗逆脅迫應(yīng)答反應(yīng)。通過(guò)共線性分析發(fā)現(xiàn)，辣椒和擬南芥具有10 對(duì)直系同源基因，且CaDANJE1/AT4G10630、CaDNAJE8/AT5G61670、CaDNAJE10/AT4G13670、CaDNAJE11/AT1G75690、CaDNAJE13/AT5G58530 這5 對(duì)不僅進(jìn)化關(guān)系最近，且序列相似度很高。其中，AT5G61670、AT4G13670 和AT1G75690 已分別被鑒定為擬南芥OR［41-42］、pTAC5［43］和LQY1［44］基因，在質(zhì)體發(fā)育、逆境應(yīng)答及光系統(tǒng)建成等方面發(fā)揮重要作用，因此推測(cè)辣椒近源基因也具有類似功能。

3.2 辣椒幼苗響應(yīng)高溫脅迫相關(guān)基因表達(dá)分析

已有研究表明，熱激轉(zhuǎn)錄因子Hsf 和熱激蛋白HSP 是參與植物應(yīng)激反應(yīng)的主要通路［45］，CaHsfB5［46］、CaHSP22［47］和CaHSP16.4［48］等基因在辣椒響應(yīng)高溫脅迫中顯著上調(diào)表達(dá)，進(jìn)而提升辣椒耐熱性，這與本研究結(jié)果一致。DNAJE 蛋白與典型DanJ 蛋白具有相似的功能，其表達(dá)也能夠顯著提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受力，從而降低細(xì)胞損傷［49］。Lee 等［50］在苜蓿（Medicago sativaL.）中鑒定了一個(gè)DNAJE基因MsDJLP，該基因的表達(dá)受低溫（4℃）和高溫（42℃）誘導(dǎo)，通過(guò)在煙草中異位過(guò)表達(dá)MsDJLP基因增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)低溫和高溫的耐受力。So 等［51］通過(guò)對(duì)大豆（Glycine maxL.）DNAJE基因GmDjp1的研究發(fā)現(xiàn)，其受多種非生物脅迫誘導(dǎo)，在大腸桿菌中異源表達(dá)GmDjp1基因，能夠提高大腸桿菌的耐受性，表明GmDjp1可能在細(xì)胞熱休克應(yīng)激過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究對(duì)NCBI SRA 數(shù)據(jù)庫(kù)中辣椒高溫脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從2 個(gè)亞族中挑選出12 個(gè)在高溫脅迫下表達(dá)量具有顯著差異的CaDNAJE基因進(jìn)行RT-qPCR 分析，結(jié)果表明，CaDNAJE24在高溫脅迫中表達(dá)量降低，呈負(fù)調(diào)控，其他基因表達(dá)水平均顯著提高，但其在不同脅迫時(shí)間的表達(dá)量存在差異，這反映出DnaJ-Like基因以不同調(diào)控方式參與了植物響應(yīng)高溫脅迫進(jìn)程。

4 結(jié)論

在辣椒全基因組中共鑒定出28 個(gè)DNAJE家族基因，進(jìn)化分析結(jié)果分為2 個(gè)亞族，同一亞族具有相似的蛋白保守基序、基因結(jié)構(gòu)以及組織特異性表達(dá)模式。高溫脅迫導(dǎo)致辣椒生理生化改變，并誘導(dǎo)DNAJE基因高表達(dá)，表明該家族基因參與了辣椒響應(yīng)非生物脅迫的生物過(guò)程。

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