歐李原花青素體外抗氧化性及對(duì)小鼠肝損傷保護(hù)的研究

徐瀟吟，田爭(zhēng)福，張惠玲*

1(寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川，750021)2(寧夏大學(xué) 食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川，750021)

歐李(又稱“鈣果”)是我國(guó)獨(dú)有特殊的沙生藥用植物，薔薇科櫻屬矮生小灌木[1]。歐李中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、礦質(zhì)元素、維生素以及原花青素等酚類化合物[2-3]。原花青素一般呈紅棕色粉末且易溶于水，是一種生物類黃酮[4]，具有抗氧化、抗癌、降血糖等作用[5-6]。肝臟作為動(dòng)物體內(nèi)最大的器官，為全身各組織器官供應(yīng)血液，長(zhǎng)期肝損傷是不可逆的，會(huì)進(jìn)一步發(fā)展成肝硬化或者肝癌[7-8]，現(xiàn)代生活中的汽車尾氣、化工廠排出的廢水廢氣，不健康飲食和過(guò)度飲酒都是導(dǎo)致化學(xué)性肝損傷發(fā)病率不斷增高的誘因，如何有效預(yù)防和改善化學(xué)性肝損傷越來(lái)越受到人們重視[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，其他植物如葡萄籽和蓮房中的原花青素分別對(duì)小鼠和大鼠肝損傷有一定保護(hù)作用[10-11]，但尚未見(jiàn)有研究證明歐李中的原花青素對(duì)肝有保護(hù)作用。CCl4是一種無(wú)色液體，吸入或者口服會(huì)肝中毒、引起肝功能衰竭[12]。CCl4進(jìn)入生物體內(nèi)代謝產(chǎn)生自由基和氧活性物質(zhì)，和肝細(xì)胞膜脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，破壞肝細(xì)胞膜的完整性和結(jié)構(gòu)[13]。本實(shí)驗(yàn)擬研究歐李中原花青素清除自由基的能力，再探討對(duì)CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷的保護(hù)作用，為歐李作為副產(chǎn)品在食品及醫(yī)藥行業(yè)的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4周齡ICR雄性小鼠60只，購(gòu)自寧夏醫(yī)科大學(xué)，許可證號(hào)：SCXK(寧)2020-0001。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過(guò)寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)(倫理審查號(hào):IACUC-NYLAC-2020-186)審查批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格遵守動(dòng)物福利倫理與3R原則。動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，相對(duì)濕度(50±10)%，溫度(22±2) ℃，每12 h明暗輪換。

1.2 材料與試劑

歐李購(gòu)于寧夏中衛(wèi)地區(qū)的農(nóng)大四號(hào)。歐李原花青素，實(shí)驗(yàn)室自制(歐李原花青素含量24.28 mg/g，由AB-8型大孔樹(shù)脂純化后純度最高可達(dá)58.53%)，通過(guò)高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)得歐李原花青素含有十余種原花青素種類，主要單體為表兒茶素，其次是原花青素B2。制備流程如下：

原料預(yù)處理(去核，凍干，粉碎)→有機(jī)溶劑浸提→減壓濃縮浸提液→離心除蛋白→低溫處理后抽濾除果膠→乙酸乙酯萃取→石油醚沉淀→冷凍干燥沉淀物→粗品→純化

原花青素標(biāo)準(zhǔn)品，源葉生物科技；抗壞血酸，北京博奧拓達(dá)科技有限公司；過(guò)硫酸鉀，天津市大茂化學(xué)試劑廠；四氯化碳，上海麥克林生化科技有限公司；2,2-二氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)銨鹽、聯(lián)苯雙脂，上海源葉生物科技有限公司；DPPH標(biāo)準(zhǔn)品，梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)測(cè)定試劑盒、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)測(cè)定試劑盒、氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測(cè)定試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)測(cè)定試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)測(cè)定試劑盒、琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase，SDH)測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器與設(shè)備

TG16-W離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；HH-3A數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司；BioTek酶標(biāo)儀，西安騰領(lǐng)生物科技有限公司；麥克奧迪MOTIC生物顯微鏡，南京貝登醫(yī)療股份有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 歐李原花青素體外抗氧化活性研究[14-16]

1.4.1.1 ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力

7.4×10-3mol/mL ABTS與2.6×10-6mol/mL過(guò)硫酸鉀體積比1∶1混合，避光放置到溶液變?yōu)榫G色，用無(wú)水乙醇稀釋至734 nm處的吸光值為0.7±0.02，分別加入1.0 mL質(zhì)量濃度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μg/mL的原花青素樣品液、抗壞血酸溶液，原花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再加入2.0 mL ABTS陽(yáng)離子自由基工作液，混合搖勻室溫下反應(yīng)幾分鐘后在波長(zhǎng)734 nm下測(cè)吸光度A1。

1.4.1.2 DPPH自由基清除能力

抗壞血酸、歐李原花青素、原花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶于甲醇溶液，分別配制成質(zhì)量濃度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 g/mL的樣品液，加入3.8 mL DPPH-甲醇溶液，快速混勻反應(yīng)30 min后在波長(zhǎng)515 nm下測(cè)定吸光值A(chǔ)1。

上述實(shí)驗(yàn)空白用蒸餾水代替樣品，測(cè)出吸光度為A0，分別計(jì)算ABTS陽(yáng)離子自由基、DPPH自由基的清除率，計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：A0為空白上清液的吸光度；A1為樣品上清液的吸光度。

1.4.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與模型建立

60只4周齡ICR雄性小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常組、模型組、陽(yáng)性組、歐李原花青素低、中、高劑量組，每組10只，除正常組外，其余各組每隔3 d腹腔注射1次CCl4和橄欖油的混合物1 mL/kg(體積比為1∶3)，正常組腹腔注射等量橄欖油。陽(yáng)性組給予聯(lián)苯雙脂50 mg/kg、歐李原花青素低、中、高分別給藥25、50、100 mg/kg[17]。每日1次，連續(xù)灌胃5周。末次給藥后，小鼠禁食不禁水18 h，麻醉后心臟取血后處死。迅速取出小鼠肝、脾、腎臟組織并稱重，取部分肝臟和腎臟做蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色。另一部分迅速采用液氮速凍，移至-80 ℃?zhèn)溆肹18]。

1.4.3 小鼠體重及臟器指標(biāo)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)期間每隔3 d記錄1次小鼠體重，小鼠處死后，立即取出小鼠肝、脾、腎臟進(jìn)行稱重，按公式(2)計(jì)算小鼠臟器指數(shù)：

(2)

式中：m1為小鼠臟器質(zhì)量，g；m2為小鼠體重，g。

1.4.4 小鼠肝臟指標(biāo)測(cè)定

精確稱取0.5 g肝臟組織，用無(wú)菌生理鹽水制成10%肝組織勻漿，5 000 r/min離心15 min,取上清液稀釋并測(cè)定小鼠肝組織MDA含量、GSH-Px和SOD活力大小，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.4.5 小鼠血清指標(biāo)測(cè)定

末次給藥后，麻醉心臟取血，靜置20 min，3 000 r/min離心10 min制備血清。測(cè)定小鼠血清中AST和ALT水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定。

1.4.6 小鼠肝臟病理觀察

取肝臟和腎臟未有機(jī)械損傷部分于4%(體積分?jǐn)?shù))多聚甲醛中固定24 h后，脫水包埋，定位切片，做HE染色，最后鏡檢。

1.4.7 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 8.5軟件工具進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 歐李原花青素體外抗氧化活性分析

如圖1和圖2所示，原花青素標(biāo)準(zhǔn)品、歐李原花青素提取樣品和抗壞血酸對(duì)于ABTS陽(yáng)離子自由基和DPPH自由基的清除率與3種樣品使用濃度呈正相關(guān)，且ABTS陽(yáng)離子自由基清除率最終可以達(dá)到100%。相同濃度條件下，3種樣品對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基和DPPH自由基的清除率由高到低的順序均為：原花青素標(biāo)準(zhǔn)品>歐李原花青素提取樣品>抗壞血酸。

圖1 歐李原花青素對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除作用Fig.1 The scavenging effect of Cerasus humilis proanthocyanidins on ABTS cationic radicals

圖2 歐李原花青素對(duì)DPPH自由基清除作用Fig.2 The scavenging effect of Cerasus humilis proanthocyanidins on DPPH free radicals

2.2 歐李原花青素對(duì)小鼠體重及臟器指數(shù)的影響

如圖3所示，自然生長(zhǎng)的情況下，小鼠的平均體重呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，模型組比正常組整體體重減輕。由圖4可知，對(duì)比正常組、模型組小鼠肝臟質(zhì)量上升，肝臟指數(shù)顯著增加(P<0.05)，說(shuō)明CCl4能導(dǎo)致肝臟一定程度上病變腫大。與模型組相比，高劑量組小鼠肝臟指數(shù)為模型組的90.55%，說(shuō)明歐李原花青素能顯著抑制CCl4造成的肝組織腫大趨勢(shì)。脾臟為機(jī)體的淋巴器官，含淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，在免疫系統(tǒng)中起重要作用。因此，脾臟指數(shù)可作為免疫反應(yīng)功能變化的參考指標(biāo)[19]。歐李原花青素中、高劑量組的腎臟和脾臟指數(shù)都有所降低，說(shuō)明激發(fā)了小鼠機(jī)體的免疫反應(yīng)，抑制脂肪在肝組織中的沉積和脾腎組織腫大效果更明顯。

圖3 小鼠體重指標(biāo)Fig.3 Body weight index of mice in each group

a-肝指數(shù)；b-脾指數(shù)；c-腎指數(shù)圖4 小鼠臟器指數(shù)Fig.4 Organ index of mice in each group 注：與正常組比較，*代表P<0.05, **代表P<0.01;與模型組比較，#代表P<0.05，##代表P<0.01(下同)

2.3 歐李原花青素對(duì)小鼠肝臟酶活力的影響

如圖5所示，與正常組相比，模型組MDA值顯著升高(P<0.05)，SOD、GSH-Px值顯著下降(P<0.05)；與模型組相比，歐李原花青素中、高劑量組SOD、GSH-Px活性極顯著增加(P<0.01)，MDA含量極顯著下降(P<0.01)。MDA值是脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，其活性大小可以反映脂質(zhì)過(guò)氧化程度，活性越高表明對(duì)人體肝損傷越大[20]。結(jié)果表明，歐李原花青素各劑量組能夠提高機(jī)體抗氧化酶的活性，加速體內(nèi)清除自由基的能力，降低脂質(zhì)過(guò)氧化發(fā)生，原花青素在小鼠體內(nèi)通過(guò)提升機(jī)體的抗氧化能力來(lái)減少CCl4對(duì)肝細(xì)胞的損傷，對(duì)CCl4引起的化學(xué)性肝損傷有較好的保護(hù)作用。

2.4 歐李原花青素對(duì)小鼠血清的影響

由圖6可知，與正常組相比，模型組血清中ALT顯著上升(P<0.01)、AST顯著上升(P<0.05)，表明CCl4誘導(dǎo)肝組織損傷模型建立，這是一種常用的模型，與人類肝臟病變相似[21]。肝細(xì)胞受到損傷時(shí)，其細(xì)胞膜通透性增加，胞質(zhì)會(huì)釋放出ALT和AST，血清中兩者活力會(huì)顯著升高，是評(píng)價(jià)肝損傷程度的重要指標(biāo)[22]。與模型組相比，歐李原花青素中、高劑量組小鼠血清中ALT、AST活性極顯著降低(P<0.01)，其中高劑量組ALT與AST活性分別比模型組降低了82.46%和69.41%，強(qiáng)于陽(yáng)性藥物聯(lián)苯雙酯(29.15%、8.80%)。結(jié)果表明，歐李原花青素高劑量可以降低肝細(xì)胞膜的通透性，保護(hù)肝組織由于CCl4引起的損傷。

a-MDA值；b-SOD值；c-GSH-Px值圖5 小鼠肝臟指標(biāo)Fig.5 Liver index of mice in each group

a-ALT值；b-AST值圖6 歐李原花青素對(duì)小鼠血清水平的影響Fig.6 Effect of Cerasus humilis proanthocyanidins on serum in mice

2.5 肝組織病理觀察結(jié)果

CCl4誘導(dǎo)的肝損傷是一種化學(xué)性模型，肝細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)彌漫性脂肪變性[23]。如圖7所示,正常組肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞形狀規(guī)則，排列整齊且形態(tài)清晰，模型組對(duì)比正常組有多處細(xì)胞死亡，細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊且雜亂無(wú)章，箭頭處可以看到細(xì)胞間有明顯脂肪變性。歐李原花青素組隨著劑量增高，肝細(xì)胞中的脂肪變性有顯著緩解，但是低、中劑量組還是有明顯的脂肪變性，說(shuō)明歐李原花青素可能具有護(hù)肝作用，且與劑量呈正相關(guān)。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)腹腔注射CCl4建立肝損傷模型，CCl4在人體肝臟內(nèi)進(jìn)行一系列代謝，生成三氯甲基、氯自由基、羥自由基等，這些自由基會(huì)造成細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化性損傷，使得肝細(xì)胞中ALT、AST得到充分釋放導(dǎo)致血清中ALT、AST含量明顯升高，脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA升高[24-25]。給予歐李原花青素干預(yù)后，與模型組相比較，MDA值顯著下降，血清中ALT、AST含量也顯著降低。結(jié)合肝病理觀察結(jié)果，說(shuō)明歐李原花青素可以緩解小鼠肝細(xì)胞受到的病理?yè)p傷。綜上所述，歐李原花青素對(duì)CCl4造成的肝損傷有保護(hù)作用，其作用機(jī)理可能與降低脂質(zhì)過(guò)氧化水平、提高肝細(xì)胞抗氧化酶活性、清除自由基有關(guān)。

a-正常組；b-模型組；c-陽(yáng)性組;d歐李原花青素低劑量組；e-歐李原花青素中劑量組；f-歐李原花青素高劑量組圖7 CCl4誘導(dǎo)肝損傷小鼠肝組織病理學(xué)觀察結(jié)果Fig.7 Histopathological examination of CCl4-induced liver injury in mice