老年原發(fā)性肝癌病人血清微小RNA-200a、微小RNA-221表達(dá)與介入術(shù)后感染的相關(guān)性分析

楊明，魏琦，易琨，張征，左偉

原發(fā)性肝癌為我國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤，起病隱匿，進(jìn)展迅速，多數(shù)病人就診時(shí)已為中晚期，錯(cuò)失最佳手術(shù)時(shí)機(jī)，經(jīng)肝動(dòng)脈栓塞化療（transarterial chemoembolization，TACE）介入術(shù)為現(xiàn)階段無(wú)法進(jìn)行手術(shù)治療肝癌病人首選治療方法［1-4］。據(jù)調(diào)查顯示，與TACE介入術(shù)相關(guān)短暫細(xì)菌感染發(fā)生率高達(dá)4%，肝膿腫發(fā)生率約1.4%，而TACE介入術(shù)后肝膿腫形成未及時(shí)采取適當(dāng)治療，病死率為13.4%～50.0%［5］。因此，探討原發(fā)性肝癌病人介入術(shù)后感染相關(guān)危險(xiǎn)因素，尋找介入術(shù)后感染診斷標(biāo)志物尤為重要。近年來(lái)，微小RNA（microRNA，miRNA）作為一類具有多重生物學(xué)效應(yīng)的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA逐漸出現(xiàn)在研究者視野［6-7］。研究發(fā)現(xiàn)，miR-200a、miR-221在肝癌病人血液中處于異常表達(dá)狀態(tài)，通過(guò)上調(diào)或下調(diào)其表達(dá)可抑制肝癌發(fā)生發(fā)展，推測(cè)二者極大可能參與了肝癌發(fā)生［8-9］，但關(guān)于其與老年原發(fā)性肝癌病人介入術(shù)后感染的相關(guān)性研究較為鮮見(jiàn)。本研究選取45例老年原發(fā)性肝癌介入術(shù)后感染病人作為研究對(duì)象，并設(shè)置病例對(duì)照，以探索老年原發(fā)性肝癌病人血清miR-200a、miR-221表達(dá)與介入術(shù)后感染的相關(guān)性，旨在為臨床診療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017年5月至2020年4月武漢市漢口醫(yī)院45例老年原發(fā)性肝癌介入術(shù)后感染病人作為觀察組，另自同期住院的老年原發(fā)性肝癌介入術(shù)后未出現(xiàn)感染病人中通過(guò)SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件采取隨機(jī)數(shù)字表法抽取45例作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所有肝癌病人診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2011年）》［10］，感染定義：介入術(shù)后，病人在血液、痰液、腹腔積液或肝臟穿刺液中檢測(cè)到細(xì)菌感染，或出現(xiàn)發(fā)熱、白細(xì)胞升高等炎癥反應(yīng)的臨床表現(xiàn)；（2）肝功能Child-Pugh A、B級(jí)，無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；（3）未預(yù)防性使用抗生素；（4）未合并嚴(yán)重心、腎、肺功能不全等介入禁忌證；排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）轉(zhuǎn)移性肝癌者；（2）既往胃腸道、膽道手術(shù)史者。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 收集病人三類可能與介入術(shù)后感染相關(guān)的潛在危險(xiǎn)因素，包括一般資料（年齡、性別）、術(shù)前檢查結(jié)果［乙型肝炎表面抗原（HB-sAg）、腹水、血紅蛋白、白蛋白、血小板、凝血酶原時(shí)間、膽紅素、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、術(shù)中資料（腫瘤血供、異位栓塞、部分脾臟栓塞）］。

1.2.2 血清miR-200a、miR-221表達(dá) 空腹?fàn)顟B(tài)下，抽取外周靜脈血5 mL，3 000 r/min高速離心處理10 min，離心半徑為15 cm，采用血液RNA提取試劑盒分離獲取RNA，采用miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒將RNA中的miRNA反轉(zhuǎn)錄為對(duì)應(yīng)cDNA，采用miRNA熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)試劑盒配置反應(yīng)體系，按照說(shuō)明書(shū)設(shè)定反應(yīng)程序?qū)iR-200a、miR-221和U6進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，自動(dòng)生成擴(kuò)增曲線后，以 U6 為內(nèi)參基因，以 2-ΔΔCt計(jì)算 miR-200a、miR-221相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采取Bartlett方差齊性檢驗(yàn)與夏皮羅-威爾克正態(tài)性檢驗(yàn)，均確認(rèn)具備方差齊性且近似服從正態(tài)布，以±s描述，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例（%）表示、χ2檢驗(yàn)；采用logistic多因素回歸模型分析老年原發(fā)性肝癌病人介入術(shù)后感染影響因素；采用Spearman相關(guān)性分析血清miR-200a、miR-221表達(dá)與影響因素的關(guān)系；繪制受試者操作特征曲線（receiver operating characteristiccurve，ROC）得到曲線下面積（areas under the curve，AUC），檢驗(yàn)血清miR-200a、miR-221表達(dá)對(duì)老年原發(fā)性肝癌病人介入術(shù)后感染的預(yù)測(cè)價(jià)值；繪制卡普蘭-邁耶曲線（Kaplan-Meier，KM），對(duì)比不同血清miR-200a、miR-221表達(dá)病人生存情況。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床資料比較觀察組腹水、白蛋白＜30 g/L、異位栓塞、部分脾臟栓塞比例高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 老年原發(fā)性肝癌介入術(shù)后感染及未感染組臨床資料對(duì)比

2.2 兩組血清miR-200a、miR-221表達(dá)兩組術(shù)前血清miR-200a、miR-221表達(dá)相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），術(shù)后，觀察組血清miR-200a表達(dá)低于對(duì)照組，miR-221表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 老年原發(fā)性肝癌介入術(shù)后感染及未感染組血清miR-200a、miR-221表達(dá)對(duì)比/± s

表2 老年原發(fā)性肝癌介入術(shù)后感染及未感染組血清miR-200a、miR-221表達(dá)對(duì)比/± s

組別對(duì)照組觀察組t值P值例數(shù)45 45 miR-200a術(shù)前4.54±1.09 4.62±1.13 0.34 0.733術(shù)后4.69±1.14 2.84±0.74 9.13＜0.001 miR-221術(shù)前9.24±2.31 9.65±2.08 0.89 0.379術(shù)后9.05±2.43 12.37±3.02 5.75＜0.001

2.3 老年原發(fā)性肝癌病人介入術(shù)后感染影響因素分析以老年原發(fā)性肝癌病人術(shù)后是否發(fā)生感染為因變量（賦值：否=0，是=1），將表1，2中篩查出的P＜0.05的因素作為自變量，進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析，結(jié)果顯示腹水、白蛋白＜30 g/L、異位栓塞、部分脾臟栓塞、術(shù)后血清miR-200a、miR-221表達(dá)均為老年原發(fā)性肝癌病人介入術(shù)后感染影響因素（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 老年原發(fā)性肝癌病人介入術(shù)后感染影響因素分析

2.4 血清miR-200a、miR-221表達(dá)與影響因素的關(guān)系老年原發(fā)性肝癌介入術(shù)后感染病人術(shù)后血清miR-200a表達(dá)與腹水、異位栓塞、部分脾臟栓塞呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與白蛋白呈正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）；術(shù)后血清miR-221表達(dá)與腹水、異位栓塞、部分脾臟栓塞呈正相關(guān)關(guān)系，與白蛋白呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 血清miR-200a、miR-221表達(dá)與影響因素的關(guān)系

2.5 血清miR-200a、miR-221表達(dá)對(duì)老年原發(fā)性肝癌病人介入術(shù)后感染的預(yù)測(cè)價(jià)值繪制ROC曲線，評(píng)價(jià)血清miR-200a、miR-221表達(dá)對(duì)老年原發(fā)性肝癌病人介入術(shù)后感染的預(yù)測(cè)價(jià)值，發(fā)現(xiàn)，二者聯(lián)合預(yù)測(cè)AUC最大，預(yù)測(cè)效能良好。見(jiàn)表5。

表5 血清miR-200a、miR-221表達(dá)對(duì)老年原發(fā)性肝癌病人介入術(shù)后感染的預(yù)測(cè)價(jià)值

2.6 生存曲線以ROC曲線中截?cái)嘀禐榻?，將原發(fā)性肝癌病人分為血清miR-200a、miR-221高表達(dá)與低表達(dá)組，miR-200a高表達(dá)組3個(gè)月病死率低于低表達(dá)組，miR-221高表達(dá)組3個(gè)月病死率高于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.27，4.13，P＜0.05）。

3 討論

目前，TACE介入術(shù)已被公認(rèn)為中晚期原發(fā)性肝癌首選治療方法，隨著該方法在各級(jí)醫(yī)院普及應(yīng)用，其感染相關(guān)并發(fā)癥逐漸出現(xiàn)，受到臨床高度重視［11-13］。老年原發(fā)性TACE介入術(shù)后感染發(fā)生多由綜合因素引起，這種感染可能與栓塞后引起的宿主自身變化有關(guān)，如菌群移位、胃腸屏障改變、自身免疫力下降等［14］。本研究logistic回歸分析顯示，腹水、白蛋白、異位栓塞及同時(shí)行部分脾臟栓塞均為介入術(shù)后感染影響因素。腹水作為細(xì)菌生長(zhǎng)良好的培養(yǎng)基，介入術(shù)后肝臟腫瘤壞死刺激腹膜炎性滲出，易引起腹腔感染。血清白蛋白作為反映機(jī)體一般營(yíng)養(yǎng)狀況及肝臟儲(chǔ)備功能的重要指標(biāo)，其水平下降，可致使抗體合成的各種酶減少，酶活性下降，機(jī)體免疫功能減退，感染風(fēng)險(xiǎn)增加。異位栓塞為肝癌介入術(shù)后主要嚴(yán)重并發(fā)癥之一，主要是因栓塞腫瘤肝外動(dòng)脈血供導(dǎo)致，尤其是多次TACE后，肝外供血?jiǎng)用}成為肝癌主要血供，可引起組織壞死，誘發(fā)感染。介入術(shù)中同時(shí)行部分脾臟栓塞后，脾臟組織壞死、炎性水腫、大量滲出液刺激腹膜、膈肌，極易導(dǎo)致膈下膿腫及脾臟膿腫形成。因此，對(duì)于出現(xiàn)上述情況的病人，臨床需加以重視。

近年來(lái)，大量研究表明，細(xì)胞內(nèi)非編碼的miRNA調(diào)節(jié)基因表達(dá)，影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)過(guò)程［15-16］。miRNA可結(jié)合靶基因3，端非編碼區(qū)相應(yīng)靶點(diǎn)，改變靶基因mRNA生物穩(wěn)定性，誘導(dǎo)mRNA降解或抑制靶基因mRNA翻譯過(guò)程，參與腫瘤、炎癥及免疫反應(yīng)等多種生理病理過(guò)程［17-18］。原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，伴有miRNA表達(dá)異常，包括上調(diào)或下調(diào)，調(diào)節(jié)不同生物學(xué)效應(yīng)［19-20］。miR-200 家族分為 miR-200a與 miR-200b兩個(gè)亞家族，其中miR-200a亞家族包括miR-200a與miR-141，定位于染色體1p36，為腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變主要調(diào)節(jié)因子［21］。miR-200a表達(dá)缺失或下調(diào)后，下游靶基因Rho激酶（ROCK）2表達(dá)上調(diào)，Rho/ROCK信號(hào)傳導(dǎo)通路的活化可促進(jìn)肌蛋白收縮，黏著斑轉(zhuǎn)換及應(yīng)力纖維形成，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［22］。以往研究證實(shí)，原發(fā)性肝癌病人miR-200a表達(dá)明顯下調(diào)［23］，充分說(shuō)明miR-200a參與原發(fā)性肝癌發(fā)生、發(fā)展。本研究中，觀察組術(shù)后miR-200a較術(shù)前明顯下降，且低于對(duì)照組術(shù)后，提示原發(fā)性肝癌病人介入術(shù)后miR-200a繼續(xù)下調(diào)與感染有關(guān)。炎癥反應(yīng)為介入術(shù)后感染的重要發(fā)病機(jī)制，有研究指出，miR-200a參與機(jī)體炎癥反應(yīng)，可降低血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)［24］。另有研究指出，miR-200a可通過(guò)抑制黏附分子表達(dá)，增加黏附抑制分子表達(dá)，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)［25］。因此，本研究推測(cè)，老年原發(fā)性肝癌病人介入術(shù)后發(fā)生感染，炎癥反應(yīng)劇烈，miR-200a表達(dá)明顯下調(diào)。

在癌癥相關(guān)miRNA研究中發(fā)現(xiàn)，miR-221在肝癌、胃癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯上調(diào)，呈現(xiàn)出一種“通用”癌基因特性［26］。miR-221位于X染色體p11.3約1 kb區(qū)域內(nèi)，是通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與靶mRNA結(jié)合，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄后引起靶mRNA降解或抑制其翻譯成蛋白質(zhì)，其作用機(jī)制可能是通過(guò)對(duì)Bmf、p27、DDIT4多種基因的調(diào)控來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及分化，抑制細(xì)胞凋亡，從而參與調(diào)控腫瘤形成［27］。原發(fā)性肝癌病人miR-221表達(dá)明顯上調(diào)，且研究表明其上調(diào)與病人臨床病理特征及總體生存率有關(guān)［28］，充分說(shuō)明miR-221與原發(fā)性肝癌病人發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)。本研究中觀察組術(shù)后miR-221較術(shù)前明顯升高，且高于對(duì)照組術(shù)后，提示原發(fā)性肝癌病人介入術(shù)后miR-200a繼續(xù)升高與感染有關(guān)。TLR-4/NF-κB作為機(jī)體內(nèi)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵途徑，有研究證實(shí)，miR-221可靶向影響該通路激活，進(jìn)而通過(guò)其變化來(lái)激活炎癥反應(yīng)，靶向影響炎癥細(xì)胞因子釋放［29］，故推測(cè)原發(fā)性肝癌介入術(shù)后感染與miR-221靶向激活炎癥反應(yīng)有關(guān)。此外，本研究中，術(shù)后血清miR-200a、miR-221表達(dá)與老年原發(fā)性肝癌病人介入術(shù)后感染影響因素腹水、白蛋白、異位栓塞及同時(shí)行部分脾臟栓塞有關(guān)，提示血清miR-200a、miR-221表達(dá)參與介入術(shù)后感染發(fā)生、發(fā)展。基于此，本研究繪制ROC曲線，評(píng)價(jià)血清miR-200a、miR-221表達(dá)對(duì)老年原發(fā)性肝癌病人介入術(shù)后感染的預(yù)測(cè)價(jià)值，發(fā)現(xiàn)術(shù)后血清miR-200a、miR-221表達(dá)聯(lián)合預(yù)測(cè)介入術(shù)后感染，預(yù)測(cè)效能良好，且以ROC曲線中截?cái)嘀禐榻?，將原發(fā)性肝癌病人分為血清miR-200a、miR-221高表達(dá)與低表達(dá)組，miR-200a高表達(dá)組3個(gè)月病死率低于低表達(dá)組，miR-221高表達(dá)組3個(gè)月病死率高于低表達(dá)組，推測(cè)術(shù)后血清miR-200a、miR-221表達(dá)可預(yù)測(cè)病人預(yù)后，但本研究樣本量較小，還需臨床多中心、多渠道取樣，作進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，老年原發(fā)性肝癌介入術(shù)后感染病人血清miR-200a表達(dá)明顯下調(diào)，miR-221顯著上調(diào)，臨床檢測(cè)其水平，可早期診斷感染，合理制定治療方案，有助于改善預(yù)后。