新風膠囊調(diào)控巨噬細胞M1/M2型極化對DBA/1小鼠膠原誘導型關(guān)節(jié)炎的影響

陶艷紅 ，劉健，徐昌萍，陳君潔，周娜，王澤，曹云祥，黃傳兵

類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的自身免疫性疾病，其特征是由浸潤性的滑膜炎癥導致的關(guān)節(jié)損傷，進而產(chǎn)生軟骨和骨質(zhì)侵蝕，最終引起關(guān)節(jié)畸形，對病人的日?；顒佑兄鴩乐夭涣加绊懀?］。雖然RA的確切發(fā)病機制尚不清楚，前期多項研究發(fā)現(xiàn)巨噬細胞是引起RA 的關(guān)鍵性因素之一。巨噬細胞是機體的免疫細胞，被發(fā)現(xiàn)可趨化至關(guān)節(jié)滑膜處，參與機體炎癥反應(yīng)［2-5］?，F(xiàn)代研究表明，巨噬細胞能夠發(fā)揮免疫應(yīng)答作用，進而維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，當這種動態(tài)平衡被打破時，在特定環(huán)境下，巨噬細胞可極化為M1和M2型，M1型分泌大量的炎性因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-6、IL-1等，同時TNF-α 還可活化免疫細胞中的核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號通路，放大炎癥效應(yīng)，從而引起并加劇組織細胞損傷，M2型釋放抑炎因子，可降低人體的炎癥反應(yīng)，在組織修復中發(fā)揮作用［6-7］。通過建立RA動物模型，研究人員發(fā)現(xiàn)促進滑膜組織的巨噬細胞凋亡或抑制M1型極化，可達到緩解RA的目的［8-9］。由此可見，調(diào)控巨噬細胞M1/M2型極化可有效干預滑膜組織中炎癥的發(fā)展。

目前，西醫(yī)在臨床治療上采用非甾體抗炎藥、抗風濕藥物、糖皮質(zhì)激素和生物制劑等雖然能夠有效地改善RA的長期治療預后，但同時也伴隨著對人體肝、腎臟各項機能的損害、胃腸道反應(yīng)和白細胞數(shù)量的減少等多種情況導致的不良反應(yīng)［10］。因此，尋找一條新的輔助治療思路極為迫切，近年來，隨著中醫(yī)中藥的發(fā)展與崛起，傳統(tǒng)中醫(yī)藥具有成本低、毒副作用小、整體調(diào)理等優(yōu)勢，其在RA中的推廣與使用引起了人們越來越廣泛的關(guān)注。新風膠囊（Xinfengcapsule，XFC）是安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院生產(chǎn)的中藥復方制劑，由黃芪、薏苡仁、雷公藤、蜈蚣四種中藥材組成，具有益氣健脾、通絡(luò)止痛之功。課題組前期研究證實，XFC被發(fā)現(xiàn)可以減輕實驗動物RA癥狀，并具有抗炎功能，但其緩解RA潛在的調(diào)控機制尚需深入研究［11-12］。本研究自2020年6月至2021年5月以膠原誘導型關(guān)節(jié)炎（collageninduced arthritis，CIA）小鼠為模型，巨噬細胞極化為主線，通過動物體內(nèi)外實驗來探討XFC調(diào)控巨噬細胞極化對改善RA的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級雄性DBA/1小鼠購自北京華阜康，許可證號SCXK（京）2019-0008。飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學動物實驗中心，實驗光照時間為7點至19點，研究人員將飼養(yǎng)環(huán)境設(shè)置為室溫20～26 ℃、相對濕度40%～70%，在該條件下對小鼠實施適應(yīng)性喂養(yǎng)。最后取18只7～8周齡，體質(zhì)量18～22 g的雄性小鼠開展實驗。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 實驗藥品與試劑 牛源性Ⅱ型膠原購于美國Chondrex；HE染色試劑盒、蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）試劑盒購于碧云天，二甲苯購于上海化學試劑有限公司；全蛋白提取試劑盒購于上海源葉生物科技有限公司；二辛可寧酸（BCA）蛋白檢測試劑盒購自江蘇凱基生物公司；增強化學發(fā)光法（ECL）發(fā)光液購自Millipore；聚偏二氟乙烯膜（PVDF）購自Bio-Rad。

1.2.2 主要儀器 冰凍切片機購自日本 Olympus公司；電泳儀購自福祿克國際；凝膠成像儀購自SIM公司；4 ℃冰箱購于北京福意電器有限公司；轉(zhuǎn)膜儀購自Bio-Rad。

1.3 方法

1.3.1 CIA模型的建立、分組和給藥 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量隨機分為三組，分別為NC組、M組和XFC組，每組6只。選用 M 組和XFC組開始造模。將2 g/L 牛源性Ⅱ型膠原（bovine collagen Ⅱ，BⅡ）在等量Freund’s complete adjuvant中進行乳化，在小鼠尾根部皮下注射100 μL乳化BⅡ。第21天將BⅡ在等量Freund不完全佐劑中進行乳化并以同樣的方式加強免疫。第二次免疫當天，XFC組每天灌胃一定濃度的實驗藥物治療。鑒于課題組前期研究基礎(chǔ)，NC組及M組予生理鹽水灌胃，1 mL/100 g，每天1次。XFC組：新風膠囊混懸液1.5 mL/100 g灌胃，每天1次［13］。持續(xù)給藥至二個時間節(jié)點（42 d）處死小鼠取材，第42天處死小鼠進行關(guān)節(jié)滑膜組織檢測。

1.3.2 記錄關(guān)節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI）評分首次免疫后，研究人員每3 d記錄各組小鼠發(fā)生關(guān)節(jié)炎的爪數(shù)，并對每只關(guān)節(jié)炎爪的關(guān)節(jié)嚴重程度進行評分。計算平均值并連續(xù)記錄至第42天。AI評分最高為16分，按照AI評分標準將四肢紅腫程度評為1～4分。0分：無紅腫；1分：輕微發(fā)紅；2分：中度發(fā)紅；3分：全足明顯紅腫；4分：全足紅腫，伴關(guān)節(jié)變形和運動障礙。AI評分≥ 1分即為造模成功［14］

1.3.3 HE染色法觀察滑膜組織病理學變化 取小鼠右后肢，4%多聚甲醛固定，乙醇分步脫水，二甲苯透明后石蠟浸漬，包埋，制成蠟塊后切成4 μm薄片；將蠟塊組織依次浸入二甲苯（Ⅰ）及二甲苯（Ⅱ）各10 min，隨后將乙醇分步脫水，用蒸餾水洗滌2 min；蘇木素染色5 min，清水沖洗1 min，鹽酸乙醇分化 20 s，酸水、氨水反藍 20 s，伊紅染色 5 min，再次使用乙醇分步脫水，經(jīng)二甲苯使切片透明，將透明的切片滴上樹膠，然后用蓋玻片密封，制成中性樹膠封片，顯微鏡下觀察小鼠關(guān)節(jié)的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

1.3.4 Western blotting檢測蛋白表達水平 用預冷的PBS 緩沖液洗滌關(guān)節(jié)滑膜組織，加入50 μL裂解液，并與 100 mol/L PMSF 以100∶1混合制備，處理25 min至完全裂解，然后將蛋白吸于EP 管，在4 ℃，12 000 r/min下離心 5 min，吸取上清置于-80 ℃環(huán)境中，分裝保存。用BCA試劑盒測量OD值，計算蛋白量，配制SDS-PAGE 凝膠，加入樣品，使樣品在100 V電泳條件下分離，恒定電流轉(zhuǎn)移至預先準備的PVDF膜上1 h。使用5%的脫脂奶粉封閉2 h，加入稀釋后的CD68抗體、INOS抗體、GAPDH抗體，搖床4 ℃孵育過夜。將一抗回收，用Western液洗滌5～10 min，共3次，二抗同樣孵育1 h，用Western液洗滌，ECL試劑檢測蛋白。

1.4 統(tǒng)計學方法使用 SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較使用 LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CIA造模成功及關(guān)節(jié)炎嚴重程度評分M組、XFC組小鼠造模后足爪均充血紅腫，關(guān)節(jié)開始出現(xiàn)畸形，小鼠活動受限，NC組四肢無紅腫、畸形，AI評分為0。第二次免疫開始，每3 d記錄發(fā)生關(guān)節(jié)炎的爪數(shù)、右后爪關(guān)節(jié)炎嚴重程度評分和四肢關(guān)節(jié)炎評分均值。實驗結(jié)果表明：

①首次免疫后21 d～42 d，NC組小鼠四肢發(fā)生關(guān)節(jié)炎的次數(shù)為0，M組和XFC組發(fā)病的關(guān)節(jié)數(shù)量均高于NC組，隨著時間延長，兩組的關(guān)節(jié)炎爪數(shù)也相應(yīng)升高，M組于致炎30 d發(fā)病至最高峰，后保持不變；與M組比較，XFC組上升速度明顯減緩，發(fā)病爪數(shù)明顯減少（表1）。

表1 新風膠囊（XFC）對免疫后不同時間膠原誘導型關(guān)節(jié)炎（CIA）小鼠發(fā)生關(guān)節(jié)炎爪數(shù)的影響/± s

表1 新風膠囊（XFC）對免疫后不同時間膠原誘導型關(guān)節(jié)炎（CIA）小鼠發(fā)生關(guān)節(jié)炎爪數(shù)的影響/± s

注：①與NC組比較，P＜0.05。②與 M組比較，P＜0.05。

組別NC M XFC 1.5 mL/100 g F值P值鼠數(shù)6 6 6 21 d 0 0 0 24 d 0 0.83 ± 0.75①0.50 ± 0.55①②3.65 0.051 27 d 0 2.17 ± 0.41①1.00 ± 0.63①②37.35＜0.001 30 d 0 3.83 ± 0.41①1.50 ± 0.55①②143.93＜0.001 33 d 0 3.83 ± 0.41①1.67 ± 0.52①②153.46＜0.001 36 d 0 3.83 ± 0.41①1.83 ± 0.41①②198.50＜0.001 39 d 0 3.83 ± 0.41①2.00 ± 0.63①②116.77＜0.001 42 d 0 3.83 ± 0.41①2.17 ± 0.41①②199.50＜0.001

②首次免疫后21～42 d，NC組右后爪關(guān)節(jié)炎嚴重程度評分為0，M組評分隨時間延長明顯上升后緩慢下降，XFC組評分緩慢上升后緩慢下降，且上升幅度始終低于M組（表2）。

表2 新風膠囊（XFC）對免疫后不同時間膠原誘導型關(guān)節(jié)炎（CIA）小鼠右后爪關(guān)節(jié)炎嚴重程度評分的影響/（分，± s）

表2 新風膠囊（XFC）對免疫后不同時間膠原誘導型關(guān)節(jié)炎（CIA）小鼠右后爪關(guān)節(jié)炎嚴重程度評分的影響/（分，± s）

注：①與NC組比較，P＜0.05。②與 M組比較，P＜0.05。

組別NC M XFC 1.5 mL/100 g F值P值鼠數(shù)6 6 6 21 d 0 0 0 24 d 0 0.50 ± 0.84①0.33 ± 0.52①②1.21 0.327 27 d 0 1.17 ± 0.75①0.50 ± 0.84①②4.87 0.023 30 d 0 2.83 ± 0.75①1.00 ± 1.10①②21.04＜0.001 33 d 0 2.67 ± 0.52①1.33 ± 1.03①②24.000＜0.001 36 d 0 2.67 ± 0.52①1.33 ± 0.82①②34.29＜0.001 39 d 0 2.67 ± 0.52①1.17 ± 0.75①②38.60＜0.001 42 d 0 2.50 ± 0.55①1.17 ± 0.75①②32.50＜0.001

③首次免疫后21～42 d，NC組四肢評分均值為0，隨著造模時間延長，M組四肢評分均值緩慢上升，XFC組先緩慢上升，于致炎第39天至最高峰，后出現(xiàn)逐漸下降趨勢，且XFC組評分均值始終低于M組（表3）。

表3 新風膠囊（XFC）對免疫后不同時間膠原誘導型關(guān)節(jié)炎（CIA）小鼠四肢關(guān)節(jié)炎評分均值的影響/（分，± s）

表3 新風膠囊（XFC）對免疫后不同時間膠原誘導型關(guān)節(jié)炎（CIA）小鼠四肢關(guān)節(jié)炎評分均值的影響/（分，± s）

注：①與NC組比較，P＜0.05。②與 M組比較，P＜0.05。

組別NC M XFC 1.5 mL/100 g F值P值鼠數(shù)6 6 6 21 d 0 0 0 24 d 0 0.25 ± 0.27①0.13 ± 0.14①②3.00 0.080 27 d 0 0.92 ± 0.47①0.33 ± 0.20①②15.00＜0.001 30 d 0 2.17 ± 0.38①0.75 ± 0.27①②100.58＜0.001 33 d 0 2.17 ± 0.34①0.75 ± 0.25①②130.75＜0.001 36 d 0 2.25 ± 0.27①0.79 ± 0.19①②212.36＜0.001 39 d 0 2.21 ± 0.25①0.83 ± 0.26①②176.15＜0.001 42 d 0 2.29 ± 0.33①0.79 ± 0.19①②167.21＜0.001

2.2 CIA 小鼠踝關(guān)節(jié)組織HE染色結(jié)果NC組關(guān)節(jié)組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，滑膜腔內(nèi)未見明顯炎性細胞浸潤，M組滑膜腔內(nèi)可見炎性細胞浸潤及血管翳形成，軟骨表面被侵蝕，增生滑膜侵入皮下。與M組相比，XFC組滑膜腔內(nèi)血管翳減少，關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)基本正常（圖1）。

2.3 XFC降低CIA小鼠滑膜組織CD68、iNOS的蛋白表達水平蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果表明：與NC組比較，M組與XFC組小鼠滑膜組織中CD68、iNOS蛋白表達均增加；與M組相比，XFC組小鼠滑膜組織中CD68和iNOS蛋白表達降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 XFC對CIA小鼠滑膜組織CD68、iNOS的蛋白表達的影響

3 討論

RA屬于中醫(yī)“痹證”范疇，因其病程長而難以治愈，后人稱之為“尪痹”，是風濕免疫科的常見病癥之一［15］。臨床上RA多表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫痛，嚴重者可導致關(guān)節(jié)變形。RA的病理基礎(chǔ)為滑膜炎癥。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，XFC具有降低CIA小鼠模型AI評分、血管翳形成和滑膜炎癥細胞浸潤數(shù)量，降低關(guān)節(jié)滑膜組織中CD68、iNOS的蛋白表達水平的作用。表明XFC具有改善CIA小鼠體內(nèi)炎癥誘導的關(guān)節(jié)滑膜損傷的功能。

作為公認研究人類RA的經(jīng)典動物模型，CIA 小鼠易感且成本較低，能夠模擬RA的治療作用，目前是人類較為理想的動物模型［16］。由于該動物模型造模成熟和發(fā)病穩(wěn)定，而被廣泛應(yīng)用于RA治療的多個研究和探索的領(lǐng)域，因此，選用CIA模型突出了XFC治療作用的靶點。中藥復方XFC遵循中醫(yī)整體調(diào)節(jié)的原則，方中黃芪益氣健脾；薏苡仁可達健脾利濕、舒筋除痹之功；雷公藤消腫止痛；蜈蚣祛風通絡(luò)止痛，根據(jù)現(xiàn)代藥理學研究成果，方中選用的中草藥具有抗風濕、調(diào)節(jié)免疫、抗炎等藥理作用［17］。課題組初步發(fā)現(xiàn)，使用XFC治療AA大鼠后，血清中IL-10顯著升高，IL-17 水平顯著降低，前期已發(fā)現(xiàn)IL-17 是參與自身免疫性疾病發(fā)生、發(fā)展的重要炎癥介質(zhì)，由此推測XFC具有抗炎作用［18-19］。實驗結(jié)果顯示與M組相比，治療后小鼠AI評分、滑膜中血管翳形成數(shù)量和炎性細胞浸潤明顯減少，提示XFC能夠顯著改善CIA小鼠的關(guān)節(jié)腫脹情況，抑制血管翳的生成，抑制炎癥發(fā)展，這與之前的研究結(jié)果保持一致。

現(xiàn)代研究認為，巨噬細胞參與機體固有免疫系統(tǒng)，具有吞噬、殺滅病原微生物、炎癥防御等功能，在人體非特異性免疫中發(fā)揮了重要作用。在人體被外界因素刺激時，巨噬細胞會表現(xiàn)為活化狀態(tài)，從而清除異物，來保護人體不被傷害。然而，當巨噬細胞清除異物時，也隨之會釋放TNF-α、IL-1等炎性因子，導致人體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，進而對機體某些組織造成損傷。通常巨噬細胞不會大量增多，當其受到某種信號，如巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF） 、表皮生長因子（EGF）的誘導時，會在機體內(nèi)大量增殖。GM-CS是一種在造血細胞產(chǎn)生及活性表達的過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的細胞因子。GMCSF 在正常生理條件下的表達水平較低。當人體發(fā)生感染或炎癥時，GM-CSF可短時間內(nèi)急劇增加。在自身免疫炎癥小鼠模型中，GM-CSF 阻斷劑減少了中性粒細胞和單核細胞的聚集，從而降低疾病的嚴重性［20］。此外，GM-CSF還能將巨噬細胞極化為M1型巨噬細胞，產(chǎn)生并分泌TNF-α、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）等致炎因子［21］。CD68是巨噬細胞的通用標志物，可以同時識別M1和M2兩種表型［22］。iNOS的表達和活性可用于M1型和M2型巨噬細胞的鑒別，在巨噬細胞中，M1型則以高度表達 MCP-1和iNOS 等促炎細胞因子為標志［23-24］IA動物模型中，XFC組CD68、iNOS的蛋白表達水平顯著低于模型組，由此推測XFC可能通過下調(diào)滑膜組織中中M1型巨噬細胞的表達抑制促炎細胞的釋放，以減輕關(guān)節(jié)炎癥。

綜上所述，新風膠囊可緩解因滑膜炎癥導致的關(guān)節(jié)紅腫疼痛，并可能通過下調(diào)滑膜組織中M1型巨噬細胞表達，抑制炎性因子的產(chǎn)生和分泌，從而對CIA小鼠模型產(chǎn)生保護作用。