亞胺培南聯(lián)合磷霉素對(duì)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的試驗(yàn)研究

王亞萍，郭 普，汪華學(xué)

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 1. 重癥醫(yī)學(xué)科； 2. 檢驗(yàn)科，安徽 蚌埠 233004)

鮑曼不動(dòng)桿菌是一種革蘭陰性的機(jī)會(huì)性致病菌，可導(dǎo)致免疫功能低下和危重患者發(fā)生醫(yī)院感染[1-2]。近年來，多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(multidrug resis-tanceAcinetobacterbaumannii，MDR-AB)感染的報(bào)道不斷增多，而臨床上可供選擇的治療藥物有限，抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用被認(rèn)為是潛在有效的治療方法[3-5]。作為β-內(nèi)酰胺類抗生素之一的碳青霉烯類藥物通過與青霉素結(jié)合蛋白共價(jià)結(jié)合來抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成[6]。磷霉素(FOS)是一種由鏈霉菌屬產(chǎn)生的磷酸烯醇丙酮酸類似物，可以干擾細(xì)菌細(xì)胞壁形成并具有穿透細(xì)菌生物膜的能力[7]，與其他抗菌藥物聯(lián)合使用對(duì)包括鮑曼不動(dòng)桿菌在內(nèi)的非發(fā)酵菌有很強(qiáng)的抗菌活性[8-11]。本研究通過體內(nèi)外試驗(yàn)，研究亞胺培南(IMP)聯(lián)用FOS對(duì)7株體外分離MDR-AB的抗菌活性，同時(shí)比較IMP與FOS、阿米卡星(AMK)、替加環(huán)素(TGC)、多粘菌素B(PB)的體外協(xié)同作用，進(jìn)一步探討IMP聯(lián)合FOS對(duì)MDR-AB生物膜形成及活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生的影響，為臨床防治MDR-AB感染提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑及儀器 亞胺培南(CAS號(hào)：74431-23-5)、磷霉素鈉(CAS號(hào)：26016-99-9)購自美國CSNpharm公司。MH瓊脂及MH肉湯購自英國Oxoid公司。貝博○RBBcellProbe○R活細(xì)菌/死細(xì)菌染色試劑盒購自上海貝博生物科技有限公司。活性氧檢測(cè)試劑盒及D-PBS均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。磷酸鹽緩沖液，K-B藥敏由蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物室提供。VITEK比濁儀購自法國生物梅里埃公司；酶標(biāo)儀購自瑞士Tecan貿(mào)易股份公司；流式細(xì)胞儀購自美國克曼庫爾特公司；超高分辨率激光掃描共聚焦顯微鏡購自德國蔡司公司。

1.1.2 試驗(yàn)菌株與動(dòng)物 臨床分離的7株MDR-AB均由蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。藥敏質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853。大蠟螟購自中國天津尚偉軒魚需有限公司，長度15～25 mm，重量200～300 mg。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株鑒定 菌株通過VITEK 2 Compact細(xì)菌鑒定儀以及飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)鑒定，耐藥性通過K-B紙片法進(jìn)行檢測(cè)，藥敏結(jié)果判定參照2020版美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)[12]標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 最低抑菌濃度(MIC)及部分抑菌濃度指數(shù)(FICI)測(cè)定 根據(jù)CLSI 2020版推薦的微量肉湯稀釋法測(cè)定7株MDR-AB對(duì)IMP、FOS、PB、AMK、TGC的單藥MIC，根據(jù)單藥MIC結(jié)果繼續(xù)使用微量棋盤法測(cè)定7株MDR-AB對(duì)IMP分別與FOS、TGC、PB的聯(lián)合MIC并計(jì)算FICI。FICI=MICA藥聯(lián)用/MICA藥單用+MICB藥聯(lián)用/MICB藥單用。判斷標(biāo)準(zhǔn)：FICI≤0.5，協(xié)同作用；FICI>2.0，拮抗作用；0.5

1.2.3 時(shí)間殺菌曲線 選取菌株AB6624與AB0153，用無菌M-H肉湯將孵育的對(duì)數(shù)生長期細(xì)菌制備菌懸液調(diào)節(jié)至1.5×108CFU/mL。然后根據(jù)兩株菌單藥MIC結(jié)果，選擇4×MIC的IMP與3×MIC的FOS單藥或者聯(lián)合用藥與菌液共孵育，同時(shí)把不加入藥物的菌液同步培養(yǎng)作為空白對(duì)照組。分別在0、4、8、12、24 h從各組中取10 μL菌液，并用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)階梯性稀釋10倍，混勻后各取10 μL接種于MHA瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并構(gòu)建殺菌曲線。判斷標(biāo)準(zhǔn)：協(xié)同效應(yīng)定義為聯(lián)合比單藥最強(qiáng)效應(yīng)的抗菌藥物超過細(xì)菌初始量2log10CFU/mL的減少；殺菌效應(yīng)定義為細(xì)菌菌落數(shù)較初始接種菌落數(shù)降低≥3log10CFU/mL[13]。

1.2.4 菌落生物膜測(cè)定

1.2.4.1 結(jié)晶紫染色法半定量生物膜 以M-H肉湯中孵育的對(duì)數(shù)生長期細(xì)菌制備菌懸液，調(diào)節(jié)菌懸液濃度至1.5×108CFU/mL，將菌液接種于96孔聚苯乙烯平板，每株菌接種3孔，每孔100 μL。設(shè)空白對(duì)照組、對(duì)照組、IMP(0.5×MIC)組、FOS(0.5×MIC)組、IMP+FOS(0.5×MIC的IMP+0.5×MIC的FOS)組，分別加入等體積抗菌藥物，將96孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育48 h，吸出菌液，使用PBS沖洗3遍去除游離菌，室溫晾干。每孔加入200 μL 95%甲醇固定15 min，自然風(fēng)干后再加入200 μL 0.01%的結(jié)晶紫染色液染色15 min；吸出結(jié)晶紫染色液，使用PBS反復(fù)沖洗，自然風(fēng)干后加入95%乙醇200 μL放入37℃恒溫培養(yǎng)箱充分溶解生物膜上的結(jié)晶紫，于590 nm處用全波段酶標(biāo)儀測(cè)定光密度(OD)值。

1.2.4.2 共聚焦顯微鏡觀察菌落生物膜內(nèi)細(xì)菌活力 生物膜制備同1.2.4.1，將菌液接種于共聚焦皿中培養(yǎng)48 h，然后吸出菌液，使用0.85%氯化鈉溶液沖洗三遍去除游離菌，按說明書使用貝博○RBBcellProbe○R活細(xì)菌/死細(xì)菌染色試劑盒中PI和BBcellProbe○RN01兩種熒光染液對(duì)菌落生物膜進(jìn)行染色，染色結(jié)束后使用0.85%氯化鈉溶液清洗，重復(fù)清洗2遍最后用吸水紙吸干水分，避光轉(zhuǎn)移并使用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察。

1.2.5 細(xì)菌ROS水平檢測(cè) 以M-H肉湯中孵育的對(duì)數(shù)生長期細(xì)菌制備菌懸液，調(diào)節(jié)菌懸液濃度至1.5×108CFU/mL，接種2 mL菌液于5 mL玻璃管中。設(shè)置空白對(duì)照組、IMP(0.5×MIC)組、FOS(0.5×MIC)組、IMP+FOS(0.5×MIC的IMP+0.5×MIC的FOS)組及活性氧陽性對(duì)照組，按照分組分別加入10 μL抗菌藥物及活性氧陽性對(duì)照，將玻璃管置于37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育30 min，離心后用0.85%氯化鈉溶液洗2次，然后根據(jù)說明書配置濃度為10 μM ROS檢測(cè)熒光探針(DCFH-DA)工作液，使用200 μL重懸細(xì)菌后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱避光孵育30 min，離心后加入0.85%氯化鈉溶液洗兩次，再用200 μL PBS重懸，立即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每組收集105個(gè)細(xì)菌的數(shù)據(jù)。

1.2.6 構(gòu)建大蠟螟模型

1.2.6.1 大蠟螟毒力檢測(cè)試驗(yàn) 以M-H肉湯中孵育的對(duì)數(shù)生長期細(xì)菌制備菌懸液,倍比稀釋成菌液濃度分別為107、106、105的3個(gè)試驗(yàn)組，第4組為注射PBS對(duì)照組，第5組設(shè)置為空白對(duì)照組，使用25 μL微量注射器注射。將幼蟲置于37℃培養(yǎng)箱孵育96 h，每24 h觀察幼蟲存活量。同一濃度重復(fù)3次，計(jì)算每株菌的LD80。

1.2.6.2 大蠟螟體內(nèi)抗菌藥物敏感試驗(yàn) 根據(jù)毒力試驗(yàn)得到的LD80配制菌液濃度感染大蠟螟幼蟲。每株菌設(shè)置5組，每組15只幼蟲，其中1～3組為試驗(yàn)組，注射相應(yīng)濃度菌液；第4組為PBS對(duì)照組，注射PBS緩沖液；第5組為空白對(duì)照組。注射完畢后將幼蟲置于37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，然后對(duì)試驗(yàn)組幼蟲模擬人體劑量一次性給予10 μL抗菌藥物，分為IMP單藥組、FOS單藥組和IMP+FOS聯(lián)合組，其中IMP和FOS的人體劑量分別為50、160 mg/kg。注射完抗菌藥物后，將幼蟲置于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育96 h，每12 h觀察并記錄每組幼蟲死亡數(shù)量，比較存活率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，對(duì)于生存率曲線比較，使用Log-rank(Mantel-Cox)檢驗(yàn)分析結(jié)果。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 以IMP為基礎(chǔ)的聯(lián)合用藥對(duì)7株臨床分離MDR-AB的MIC及FICI IMP聯(lián)合FOS對(duì)其中5株MDR-AB的FICI值為0.281 2～0.5，為協(xié)同作用；對(duì)其中兩株菌FICI為0.5～1.0，為相加作用。IMP+FOS組聯(lián)用較其他組協(xié)同率高。見表1。

表1 IMP與4種抗菌藥物單用及聯(lián)合用藥對(duì)MDR-AB的作用結(jié)果(n=7)

2.2 IMP聯(lián)合FOS對(duì)MDR-AB的殺菌曲線 IMP聯(lián)合FOS對(duì)菌株AB6624的殺菌曲線顯示，4×MIC的IMP與3×MIC的FOS聯(lián)合處理組在8 h的細(xì)菌菌落數(shù)較IMP和FOS單藥應(yīng)用降低>2log10CFU/mL，說明兩藥聯(lián)合有協(xié)同效應(yīng)，見圖1。菌株AB0153的殺菌曲線顯示，4×MIC的IMP與3×MIC的FOS處理組在4 h的細(xì)菌菌落數(shù)較兩藥單藥應(yīng)用時(shí)降低>2log10CFU/mL，說明兩藥聯(lián)合具有協(xié)同效應(yīng)。4×MIC的IMP與3×MIC的FOS聯(lián)合處理組在24 h的細(xì)菌菌落數(shù)較初始接種量降低>3log10CFU/mL，說明兩藥聯(lián)用具有殺菌效應(yīng)，見圖2。

圖1 IMP聯(lián)合FOS對(duì)菌株AB6624的殺菌曲線

圖2 IMP聯(lián)合FOS對(duì)菌株AB0153的殺菌曲線

2.3 IMP聯(lián)合FOS對(duì)AB6624、AB0153生物膜的影響 選取菌株AB6624、AB0153，通過結(jié)晶紫染色法測(cè)定IMP聯(lián)合FOS對(duì)菌株生物膜體外抑制活性。培養(yǎng)48 h后，AB6624與AB0153的兩藥聯(lián)合處理組OD(590)值均低于對(duì)照組(均P<0.01)，表明IMP聯(lián)合FOS對(duì)MDR-AB生物膜形成具有抑制作用。見表2。

表2 結(jié)晶紫染色法測(cè)定IMP與FOS單藥及聯(lián)合用藥對(duì)菌株AB6624、AB0153生物膜形成的影響(n=3)

2.4 IMP聯(lián)合FOS對(duì)MDR-AB生物膜內(nèi)細(xì)菌活力的影響 激光共聚焦顯微鏡進(jìn)一步觀察IMP聯(lián)合FOS對(duì)MDR-AB生物膜形成以及膜內(nèi)細(xì)菌存活的影響。根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果，選取菌株AB0153進(jìn)行試驗(yàn)，與對(duì)照組相比，IMP聯(lián)合FOS處理組生物膜>結(jié)構(gòu)稀疏，細(xì)菌數(shù)量低于對(duì)照組及單藥處理組，說明兩藥聯(lián)合對(duì)細(xì)菌生物膜形成具有抑制作用。根據(jù)不同顏色熒光強(qiáng)度推算，兩藥處理組生物膜中包埋的死菌比例高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明兩藥聯(lián)合對(duì)MDR-AB生物膜中細(xì)菌具有抑制作用。見圖3、4。

注：綠色為活菌，紅色為死菌。

注：*表示P<0.05。

2.5 IMP聯(lián)合FOS對(duì)MDR-AB內(nèi)ROS水平影響 為了探究IMP聯(lián)合FOS的殺菌機(jī)制，采用流式細(xì)胞儀分析兩藥聯(lián)合對(duì)菌株AB0153胞內(nèi)ROS水平影響，相比于對(duì)照組及單藥處理組，IMP聯(lián)合FOS處理組ROS水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示兩藥聯(lián)合可能通過提高細(xì)菌內(nèi)ROS水平發(fā)揮殺菌作用。見圖5、6。

圖5 IMP與FOS單藥及聯(lián)合用藥細(xì)菌內(nèi)ROS水平變化流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)峰圖(n=3)

注：*表示P<0.05；**表示P<0.01。

2.6 IMP單藥及聯(lián)合用藥大蠟冥生存率 菌株AB0153的LD80為1.0×106CFU/mL；IMP聯(lián)合FOS對(duì)MDR-AB感染的幼蟲具有保護(hù)作用，兩藥聯(lián)合可以提高大蠟螟幼蟲的生存率(中位生存時(shí)間96 h)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.022)。見圖7。

圖7 IMP與FOS單藥及聯(lián)合用藥后蠟螟幼蟲生存率曲線

3 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌是醫(yī)院內(nèi)免疫功能低下及病?；颊甙l(fā)生侵襲性感染的常見病原菌，近年來抗菌藥物的濫用導(dǎo)致MDR-AB的流行。碳青霉烯類抗生素是臨床治療耐多藥革蘭陰性桿菌感染的一線藥物，其耐藥性的增加使MDR-AB相關(guān)感染難以根除[4]。根據(jù)2021年CHINET中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果，耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)IMP的耐藥率高達(dá)99.5%。FOS既往被用于治療大腸埃希菌引起的非復(fù)雜性尿路感染，近期研究[8, 14]表明，F(xiàn)OS聯(lián)合其他抗菌藥物對(duì)銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌等非發(fā)酵菌具有很強(qiáng)的抗菌活性，具體作用機(jī)制尚不明確。

本研究表明，IMP聯(lián)合FOS對(duì)MDR-AB主要表現(xiàn)為協(xié)同作用，兩藥聯(lián)合具有明顯的殺菌效應(yīng)，相比于聯(lián)合其他抗菌藥物協(xié)同率高。生物膜形成是細(xì)菌的一種耐藥機(jī)制，細(xì)菌可以在生物膜中生長并躲避機(jī)體免疫應(yīng)答，阻礙抗菌藥物發(fā)揮作用，而FOS與其他抗菌藥物聯(lián)合使用可以穿透細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu)并抑制生物膜形成[7, 15]。本試驗(yàn)選取的MDR-AB菌株具有強(qiáng)生物膜形成能力，IMP聯(lián)合FOS可以顯著抑制其生物膜形成并破壞生物膜結(jié)構(gòu)，生物膜內(nèi)活菌數(shù)量降低，提示兩藥聯(lián)合可能通過抑制生物膜形成發(fā)揮協(xié)同作用。ROS是生物有氧能量代謝中生成的副產(chǎn)物，當(dāng)細(xì)菌在抗菌藥物作用下發(fā)生ROS過量積累時(shí)可以通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生大量羥自由基，羥自由基可以直接損傷DNA、破壞蛋白質(zhì)及脂質(zhì)，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，近年來被認(rèn)為是與殺菌抗生素活性相關(guān)的機(jī)制之一[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，相比于空白對(duì)照組和單藥處理組，IMP聯(lián)合FOS可以提高細(xì)菌內(nèi)ROS水平，說明兩藥聯(lián)合可能通過促進(jìn)ROS的產(chǎn)生發(fā)揮協(xié)同作用。體內(nèi)大蠟螟感染模型試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證兩藥的協(xié)同效應(yīng)，IMP聯(lián)合FOS治療后的感染組大蠟螟存活率高于單藥治療組以及對(duì)照組，說明兩藥聯(lián)合對(duì)感染鮑曼不動(dòng)桿菌的大蠟螟幼蟲具有保護(hù)作用。

綜上所述，本試驗(yàn)通過收集臨床的MDR-AB，構(gòu)建體內(nèi)外試驗(yàn)觀察IMP聯(lián)合FOS的抗菌活性，發(fā)現(xiàn)兩藥聯(lián)合具有協(xié)同作用，并且可以通過抑制細(xì)菌生物膜形成及促進(jìn)ROS產(chǎn)生參與殺菌過程。兩藥聯(lián)合較單藥應(yīng)用對(duì)感染MDR-AB的大蠟螟具有更好的療效，為IMP聯(lián)合FOS臨床治療MDR-AB感染提供了證據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。