貴州地區(qū)2017—2020年結(jié)核分枝桿菌卷曲霉素耐藥與相關(guān)基因突變關(guān)系

李秋陽(yáng)，曾強(qiáng)林，陳小菊，陳 玲

(1. 成都大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，四川 成都 610081； 2. 遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科結(jié)核病區(qū)，貴州 遵義 563000)

結(jié)核病(tuberculosis,TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tb)感染引起的慢性傳染病[1]。由于各種因素，目前已產(chǎn)生耐藥性TB。2020年世界衛(wèi)生組織(WHO)TB年報(bào)[1-2]報(bào)道，耐藥TB具有死亡率高、治療方案不足和診斷易被延誤的特點(diǎn)，患者數(shù)量有增多趨勢(shì)。耐藥TB的出現(xiàn)對(duì)全球TB控制提出了挑戰(zhàn)[3]。

耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB)指TB患者感染的M.tb體外被證實(shí)至少對(duì)異煙肼、利福平(rifampicin, RIF)耐藥。卷曲霉素(capreomycin,CM)可應(yīng)用于MDR-TB患者強(qiáng)化期治療中[4]，但因M.tb對(duì)CM和其他已產(chǎn)生耐藥的抗結(jié)核藥物存在交叉耐藥可能[5]，故使用CM抗結(jié)核前對(duì)TB患者進(jìn)行耐藥篩查尤為必要。

研究[6]結(jié)果表明，CM治療MDR-TB效果顯著。目前認(rèn)為CM通過(guò)改變M.tb核糖體蛋白的功能抑制M.tb蛋白質(zhì)的合成[7-8]。M.tb分離株對(duì)包括CM在內(nèi)的抗結(jié)核藥物的耐藥性基本上是由特定基因靶點(diǎn)的自發(fā)點(diǎn)突變?cè)斐傻腫9-12]。多項(xiàng)研究表明，rpsL[13]、tlyA[8,14]、rrs[2、5]、eis[12]、Rv0194[12]及Rv1258C基因[15]為最主要的CM耐藥相關(guān)基因，但它們的突變是否與CM耐藥相關(guān)仍存在爭(zhēng)議[16]。目前大多數(shù)研究?jī)H針對(duì)單個(gè)CM耐藥相關(guān)基因，缺乏對(duì)以上6個(gè)基因的同時(shí)分析，且多使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reacion, PCR)擴(kuò)增相應(yīng)基因，過(guò)程中難免會(huì)造成基因突變帶來(lái)誤差，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。全基因組測(cè)序可避免上述問(wèn)題，也有利于建立完整全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)，便于開(kāi)展后續(xù)試驗(yàn)。此外，RIF作為一線抗結(jié)核藥物代表，臨床使用頻繁，分析CM耐藥與RIF耐藥是否存在關(guān)聯(lián)，有利于評(píng)估CM是否適用于利福平耐藥結(jié)核病(rifampicin-resistant tuberculosis, RR-TB)患者抗結(jié)核治療。

本研究擬對(duì)M.tb菌株做藥物敏感試驗(yàn)(drug susceptibility test, DST)，并提取菌株DNA行全基因組測(cè)序(whole-genome sequencing，WGS)，檢測(cè)上述6個(gè)CM耐藥相關(guān)基因的突變情況，探究CM耐藥基因型與表型的關(guān)系，以及CM耐藥與RIF耐藥的關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源M.tb標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv，由貴州省疾病預(yù)防控制中心提供。

1.1.2 痰標(biāo)本來(lái)源 收集2017—2020年遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院痰抗酸染色陽(yáng)性的肺結(jié)核病患者痰標(biāo)本。

1.1.3 主要試劑與儀器 十六烷基三甲基溴化銨(cetyl trimethyl ammonium bromide, CTAB，中國(guó)天津市大茂化學(xué)試劑廠)、蛋白酶K(天根生化科技有限公司)、溶菌酶(Sanland-chem International Inc公司)、1 000 bp DNA ladder(康為世紀(jì)公司)、PCR Mix(結(jié)核分枝桿菌菌型分析試劑盒，北京康為世紀(jì)公司)、普通梯度PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)、電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)、凝膠成相系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1M.tb臨床分離菌株的提取 取1～2 mL氫氧化鈉預(yù)處理后的臨床痰標(biāo)本接種在2管酸性培養(yǎng)管斜面上，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，按時(shí)間表觀察生長(zhǎng)情況，提取陽(yáng)性培養(yǎng)管中菌株并鑒定菌型。

1.2.2 固體比例法檢測(cè)M.tb臨床分離菌株藥物敏感性 對(duì)M.tb臨床分離株進(jìn)行抗結(jié)核一線和二線藥的DST。(1)制備改良羅氏(L-J)培養(yǎng)基：KH2PO42.4 g、MgSO4·7H2O 0.24 g、檸檬酸鎂0.6 g、谷氨酸鈉7.2 g、丙三醇12 mL、蒸餾水600 mL。(2)制備含藥培養(yǎng)基：L-J培養(yǎng)基中分別加入表1所示濾菌后的藥劑至其對(duì)應(yīng)含藥終濃度。(3)菌液制備：在1支5 mL超聲分散管和2支離心管中各加入2、1、1 mL的0.5%吐溫-80生理鹽水；挑取培養(yǎng)物放入超聲分散管，超聲分散20 s，后加入0.5%吐溫-80生理鹽水至濃度為1 mg/mL；吸取10 μL菌液(濃度1 mg/mL)加入離心管內(nèi)，得到濃度為10-2mg/mL菌液，再取10 μL菌液(濃度為10-2mg/mL)加入到另1支離心管內(nèi)，得到濃度為10-4mg/mL菌液。(4)接種及培養(yǎng)。每株菌株各取10-2、10-4mg/mL菌液10 μL接種在4個(gè)L-J培養(yǎng)基上，對(duì)照組、含藥物試驗(yàn)組各2個(gè)，放入37℃培養(yǎng)箱1個(gè)月觀察菌落生長(zhǎng)情況。(5)根據(jù)菌落生長(zhǎng)及耐藥百分比判斷藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果。

表1 含藥培養(yǎng)基藥物濃度

1.2.3M.tbDNA的提取與菌株鑒定 (1)取培養(yǎng)管內(nèi)M.tb菌落置于加有400 μL 1×TE溶液的EP管中，80℃水浴箱水浴30 min后加入20 μL溶菌酶溶液(50 mg/mL)，37℃水浴箱中放置>2 h。CTAB法提取DNA作為PCR和WGS的DNA模板，-20℃冰箱保存。(2)針對(duì)人型結(jié)核分枝桿菌特異性序列設(shè)計(jì)引物mtb1(5’→3’：ATAGGGAATGCTCGGCAAC)和mtb2(5’→3’：CAACATCGACGCAGTACCC)，根據(jù)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特異性序列IS6110設(shè)計(jì)引物IS6110-P1(5’→3’：TCAGGTCGAGTACGCCTTCT)和IS6110-P2(5’→3’：CGTCGCAGAGATCCGCGGTC)，使用M.tbPCR Mix擴(kuò)增，產(chǎn)物分別為361、850 bp兩條片段，可鑒定為人型M.tb。

上述試驗(yàn)步驟均在遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室的微生物實(shí)驗(yàn)室及二級(jí)生物安全柜中進(jìn)行，試驗(yàn)前后均消毒。

1.2.4 判斷標(biāo)準(zhǔn) 多耐藥、耐多藥(multidrug-resistance, MDR)、泛耐藥(extensively drug resis-tance, XDR)判斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[1]。

1.2.5 WGS (1)DNA模板外送北京邦萊生物科技有限公司進(jìn)行WGS，使用illumina二代測(cè)序平臺(tái)，CTAB法提取的M.tb基因組DNA作為模板進(jìn)行DNA片段文庫(kù)構(gòu)建，雙側(cè)測(cè)序(Paired-end Sequencing)，按照每樣本200倍M.tb基因組的測(cè)序深度上機(jī)(約獲得1 G數(shù)據(jù)/樣本)，過(guò)濾掉接頭(adapter)和索引(index)序列后得到約150 bp讀長(zhǎng)(reads)的序列。(2)數(shù)據(jù)質(zhì)控：Trimmomatic軟件過(guò)濾掉WGS原始Fastq文件中低質(zhì)量reads；剩余所有reads與M.tb標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv(GenBank AL123456)基因組比對(duì)，通過(guò)MTBseq流程(https://github.com/ngs-fzb/MTBseq_source)分析M.tb基因組數(shù)據(jù)覆蓋中位數(shù)(coverage median)，coverage median≤30的數(shù)據(jù)排除分析。(3)提取單核苷酸多態(tài)性(SNP)序列：應(yīng)用ubuntu(illumina)系統(tǒng)，Picard-tools、BWA、GenomeAnalysis、samtools等軟件處理上一步驟獲得的數(shù)據(jù)，提取試驗(yàn)菌株全基因組中的SNP序列。(4)檢測(cè)突變點(diǎn)：SNP序列同標(biāo)準(zhǔn)菌株比對(duì)，檢測(cè)CM耐藥相關(guān)基因tlyA、rrs、rpsL、eis、Rv0194及Rv1258C序列內(nèi)的突變位點(diǎn)。(5)突變類(lèi)型：NCBI網(wǎng)站比對(duì)突變位點(diǎn)所在的讀碼框，明確突變類(lèi)型。(6)確認(rèn)新突變：BLAST比對(duì)檢測(cè)到的基因突變與數(shù)據(jù)庫(kù)已有數(shù)據(jù)，明確該突變是否已被發(fā)現(xiàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，采用卡方檢驗(yàn)分析CM耐藥與RIF表型耐藥是否存在關(guān)聯(lián)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 菌株培養(yǎng)分離及DST結(jié)果 共培養(yǎng)123株M.tb臨床分離菌株，其中，對(duì)抗結(jié)核一線和二線藥全敏感68株，耐藥55株。耐藥菌株中，單耐利福平(rifampicin-reisistant，RR)2株，多耐藥4株，MDR 49株，含6株XDR。123株菌株中，6株CM DST失敗，CM敏感113株，CM耐藥4株，且均為MDR(含1株XDR)，RIF耐藥52株(2株RR、1株多耐藥、49株MDR，MDR中含6株XDR)。CM耐藥菌株DST結(jié)果見(jiàn)圖1。

注：從左向右分別是10-2 mg/mL對(duì)照組、10-2 mg/mL含CM藥物組，10-4 mg/mL對(duì)照組、10-4 mg/mL含CM藥物組。

2.2 菌株CM耐藥相關(guān)基因突變情況與對(duì)應(yīng)耐藥表型 WGS數(shù)據(jù)顯示，所有菌株均檢出tlyA基因A33G同義突變及Rv0194基因T221C非同義突變；Rv0194基因C3293T非同義突變?cè)?7株菌株中檢出，CM耐藥菌株中均檢出；rpsL基因A128G非同義突變的菌株(16.3%，20/123)中CM耐藥3株，CM敏感14株，其余CM的DST失?。籸rs基因A1401G突變菌株(1.6%，2/123)均對(duì)CM耐藥；rrs基因A908C、rpsL基因A263C、Rv1258C基因C1065T及Rv0194基因C1810T突變的菌株CM的DST失敗；其余28種突變類(lèi)型的菌株均對(duì)CM敏感。見(jiàn)表2。

表2 123株M.tb菌株突變位點(diǎn)、CM藥敏信息及文獻(xiàn)報(bào)道情況

續(xù)表2 (Table 2， Continued)

2.3 CM耐藥菌株基因突變情況統(tǒng)計(jì) 2株CM耐藥菌株rrs基因A1401G突變，3株CM耐藥菌株rpsL基因A128G非同義突變，4株CM耐藥菌株均檢出Rv0194基因C3293T、T221C非同義突變及tlyA基因A33G同義突變。見(jiàn)表3。

表3 CM耐藥菌株基因型和表型比對(duì)

2.4 CM與RIF表型耐藥相關(guān)性分析 CM耐藥菌株均為RIF耐藥，CM與RIF表型耐藥比較(采用Fisher確切概率法)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(列聯(lián)系數(shù)r=0.228，P=0.022)。見(jiàn)表4。

表4 CM與RIF耐藥表型相關(guān)性分析(株)

3 討論

貴州地區(qū)為我國(guó)TB高發(fā)地區(qū)，遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院為大型三甲綜合醫(yī)院，患者數(shù)量大，標(biāo)本數(shù)量多。本研究對(duì)分離自該院的123株M.tb進(jìn)行抗結(jié)核藥物的DST，其中6株CM DST失敗，CM敏感113株，CM耐藥4株；RIF敏感71株，RIF耐藥52株。WGS共檢測(cè)到rrs基因6個(gè)突變，rpsL、Rv0194、eis、tlyA和Rv1258C基因的8個(gè)同義突變和23個(gè)非同義突變。13株菌(10.6%)檢出rrs基因6個(gè)不同的突變位點(diǎn)，其中A1401G基因突變率為1.6%(2/123)，與既往研究[19]數(shù)據(jù)相符。其余5個(gè)CM耐藥相關(guān)基因非同義突變情況如下：20株(16.3%)菌株rpsL基因A128G突變，6株(4.9%)A263G突變，tlyA基因C86T突變、eis基因G11A和T501G突變、rpsL基因A263C突變菌株各1株(0.81%)。rpsL基因整體突變情況與既往研究[13,18]一致。檢出Rv1258C基因C55T、C322T、C633T和G1240A突變各1株(0.81%)，分布于4株不同的菌株中；所有菌株均檢出Rv0194基因T221C突變，77株(62.6%)發(fā)生C3293T突變，4株(3.3%)發(fā)生A1384G突變，其余C292G、A571G、C633G、C661A、C752A、C1810T、C1985T、T2575C、A3133G和T3395A突變各1株(0.81%)。除上述報(bào)道過(guò)的基因突變，本研究首次發(fā)現(xiàn)eis基因非同義突變，Rv1258C基因C55T、C322T和C633T突變，Rv01946基因C292G、A3133G、T2575C、C661A、C1810T、T3395A、A571G、C752A、C1985T和C633G突變，以及rrs基因A1356G、C1236T、G5T突變。

CM耐藥菌株中rrs基因A1401G、rpsL基因A128G、Rv0194基因C3293T和T221C突變。rrs基因A1401G突變僅在CM耐藥菌株中檢出，提示該突變類(lèi)型可能與CM耐藥存在聯(lián)系，與多項(xiàng)研究[2，5，19]結(jié)果一致，且該突變位點(diǎn)可能也與卡那霉素、阿米卡星耐藥相關(guān)，可作為潛在預(yù)測(cè)CM、卡那霉素、阿米卡星耐藥的靶點(diǎn)[2，5]。所有CM耐藥菌株和部分CM敏感菌株檢出Rv0194基因C3293T，提示該突變可能與CM耐藥相關(guān)，但還需明確該突變?cè)贑M敏感菌株發(fā)生后未導(dǎo)致耐藥產(chǎn)生的機(jī)制。rpsL基因A128G突變雖然只在CM敏感菌株中檢出，但Zhao等[13]研究支持該突變位點(diǎn)與CM耐藥可能存在關(guān)聯(lián)，并可能為二線氨基糖苷類(lèi)耐藥相關(guān)的交叉耐藥靶點(diǎn)；Rv0194基因T221C突變?cè)谒芯曛芯鶛z出，暫不考慮與CM耐藥有關(guān)；tlyA基因A33G為同義突變，考慮與CM耐藥無(wú)關(guān)；其他基因突變均在CM敏感菌株中檢出，考慮為基因多態(tài)性，暫考慮與CM耐藥無(wú)關(guān)聯(lián)。綜上所述，本研究推斷CM耐藥可能與rrs基因A1401G、rpsL基因A128G和Rv0194基因C3293T突變存在一定關(guān)聯(lián)，以上基因突變可作為CM耐藥監(jiān)測(cè)靶點(diǎn)，但不能排除作為其他抗結(jié)核藥物交叉耐藥靶點(diǎn)的可能[20]，臨床工作者在制定抗結(jié)核治療方案時(shí)可作參考。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)了若干未報(bào)道過(guò)的基因位點(diǎn)突變，但尚未發(fā)現(xiàn)這些突變與CM耐藥相關(guān)，推測(cè)可能為基因多態(tài)性，需進(jìn)一步驗(yàn)證。

RIF為一線抗結(jié)核藥物，然而目前臨床已出現(xiàn)大量RR-TB患者，CM與RIF耐藥相關(guān)性分析有助于CM耐藥篩查及RR-TB患者用藥指導(dǎo)。本研究中M.tb臨床分離菌株CM及RIF的DST結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析表明，CM表型耐藥與RIF表型耐藥存在相關(guān)性，但關(guān)聯(lián)程度一般，且本研究中CM耐藥菌株僅4株，樣本量偏少，不足以證實(shí)RR-TB患者對(duì)CM耐藥，缺乏臨床用藥指導(dǎo)意義，后續(xù)還需加大樣本量探究CM與RIF耐藥相關(guān)性。CM耐藥機(jī)制方面，本研究?jī)H針對(duì)6個(gè)報(bào)道過(guò)的耐藥相關(guān)基因進(jìn)行研究，未深入了解這些基因作為其他一、二線抗結(jié)核藥物交叉耐藥靶點(diǎn)的可能，可在后續(xù)研究中進(jìn)一步探討。此外，還可從功能變異的替代形式，如大缺失和其他功能喪失突變導(dǎo)致CM耐藥方面展開(kāi)研究[21]。

本研究對(duì)123株M.tb臨床分離菌株進(jìn)行CM表型與基因型，以及CM和RIF DST的對(duì)比分析，證實(shí)菌株存在對(duì)CM和其他抗結(jié)核藥物交叉耐藥可能，臨床工作者在制定抗結(jié)核治療方案時(shí)可作參考。后續(xù)研究需進(jìn)一步明確CM耐藥機(jī)制，以及CM與其他抗結(jié)核藥物是否存在交叉耐藥。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。