聚集素對肝脂肪變性細(xì)胞的作用及機(jī)制

蘇 靜，胡以平

(海軍軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室，上海 200082)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種代謝相關(guān)的慢性肝病[1]，主要包括簡單脂肪變性、非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化、肝細(xì)胞癌4個(gè)階段[2-3]，被認(rèn)為是慢性肝病的主要原因。目前，NAFLD的發(fā)病機(jī)制最被廣泛接受的理論是“二次打擊”假說[4-5]，第1次“打擊”是通過肝細(xì)胞中三酰甘油的積累而發(fā)生肝脂肪變性，然后在此基礎(chǔ)上發(fā)生第2次“打擊”即氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，造成肝細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)。第2次“打擊”增加了肝細(xì)胞對凋亡和壞死的易感性，促進(jìn)肝纖維化和肝硬化的發(fā)生和發(fā)展。聚集素(clusterin,CLU)也被稱為載脂蛋白J(apolipoprotein J，Apo J)，是一種異二聚體糖蛋白，廣泛分布于各種組織和體液中，參與組織重塑、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、補(bǔ)體抑制和凋亡調(diào)節(jié)等多種生理過程[6-8]。正常生理?xiàng)l件下，CLU表達(dá)水平較低，在病理?xiàng)l件下如氧化應(yīng)激和炎癥時(shí)[9-11]其表達(dá)上調(diào)。有研究表明，CLU與多種代謝性疾病有關(guān)[12-13]。Apo J-低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白2(low density lipoprotein receptor related protein 2，LRP2)軸是一種新的內(nèi)分泌通路，對維持正常的葡萄糖穩(wěn)態(tài)和胰島素敏感性至關(guān)重要[14]。同時(shí)，ApoJ-LRP2軸也對高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗起到保護(hù)作用[15]。CLU可以抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[16]，促進(jìn)膽固醇從泡沫細(xì)胞中流出，并具有抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[17-18]。有研究發(fā)現(xiàn)，CLU可以抑制西式飲食誘導(dǎo)的肥胖和NAFLD或者作為免疫預(yù)處理調(diào)節(jié)劑影響脂肪性肝炎[19-20]。目前本課題組在開展的關(guān)于CLU在小鼠肝纖維化中作用的研究也發(fā)現(xiàn)其對肝組織的保護(hù)作用(數(shù)據(jù)還未發(fā)表)。但關(guān)于CLU在脂代謝中的作用及機(jī)制的研究較少?；诖?，本研究采用游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)[21]來處理小鼠肝癌細(xì)胞系Hep1-6建立體外肝脂肪變性細(xì)胞模型。同時(shí)建立穩(wěn)定過表達(dá)CLU以及穩(wěn)定敲減CLU的Hep1-6細(xì)胞株,通過檢測脂生成和氧化代謝等相關(guān)基因的表達(dá)差異來研究CLU在肝脂肪變性細(xì)胞中的作用，探討CLU與脂代謝之間的關(guān)系，并初步分析其潛在的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑與儀器小鼠肝癌細(xì)胞系Hep1-6、293T工具細(xì)胞、DH5α細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室長期保存細(xì)胞；達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modification of Eagle′s medium，DMEM)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、青/鏈霉素(雙抗)購自美國Invitrogen公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，油紅O、油酸、棕櫚酸鈉購自美國Sigma公司，放射免疫沉淀法緩沖液(radioimmunoprecipitation assay buffer，RIPA)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，重組小鼠CLU蛋白購自美國R&D Systems公司，質(zhì)粒小抽試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司，引物由上海杰李生物技術(shù)有限公司合成，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒購自日本TaKaRa公司，含小鼠CLU基因全長Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRESpuromycin的過表達(dá)慢病毒載體質(zhì)粒以及含綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)元件的對照載體質(zhì)粒均購自上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司，含有CLU短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)干擾小鼠CLU基因的慢病毒載體及對照載體購自賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司，包裝慢病毒的2個(gè)包裝質(zhì)粒 psPAX2 和 pMD2G 為實(shí)驗(yàn)室自有；低溫低速臺(tái)式離心機(jī)購自德國Eppendorf公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國羅氏公司，Amersham Imager600多功能成像儀購自美國General Electric Company公司,全波長酶標(biāo)儀購自美國Molecular devices 公司，CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher公司。

1.2 Hep1-6和293T細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)37 ℃水浴快速復(fù)蘇后，低溫離心機(jī)1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，采用DMEM完全培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、青霉素100 U·mL-1和鏈霉素1 mg·L-1)于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，更換新培養(yǎng)基。

1.3 穩(wěn)定過表達(dá)CLU和敲減CLU的慢病毒感染細(xì)胞株構(gòu)建質(zhì)粒擴(kuò)增：將過表達(dá)CLU慢病毒載體質(zhì)粒、敲減CLU shRNA慢病毒載體質(zhì)粒、對照質(zhì)粒采用DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化，涂板培養(yǎng)12～16 h后挑取單細(xì)胞菌落置于LB培養(yǎng)液中,隨后將LB培養(yǎng)瓶置于37 ℃、250 r·min-1的振蕩培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，使用質(zhì)粒小抽試劑盒抽取富集得到目的質(zhì)粒。慢病毒包裝:復(fù)蘇293T工具細(xì)胞，接種至10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，直至細(xì)胞密度達(dá)到 70%～80%；取1 mL DMEM置于1.5 mL無菌離心管Eppendorf(EP)管中，再依次將目的質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒(psPAX2)、外殼質(zhì)粒(pMD2G)按照 421 的比例加入EP管中，總量14 μg，吹打混勻。再加入42 μg聚乙烯亞胺輕柔混勻，室溫靜置15 min。將293T細(xì)胞換液，加入9 mL DMEM完全培養(yǎng)基后放回培養(yǎng)箱中。稍后將EP管中的混合液逐滴加入293T細(xì)胞培養(yǎng)皿中，輕輕混勻，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，8 h后更換新鮮培養(yǎng)液，48 h后收集病毒上清，0.45 μm 濾膜過濾，分裝保存。細(xì)胞感染：提前復(fù)蘇肝癌細(xì)胞Hep1-6，傳代1～2次后待其密度約為40%時(shí)，將細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、CLU組、Sh組和GFP組。更換新鮮培養(yǎng)液，對照組細(xì)胞不給予任何處理，CLU組細(xì)胞加入過表達(dá)CLU慢病毒上清，Sh組細(xì)胞加入敲減CLU慢病毒上清，GFP組細(xì)胞加入對照病毒上清，然后各組細(xì)胞再分別加入聚凝胺(5 mg·L-1)，輕柔混勻。感染8～12 h后更換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng) 24～48 h后，熒光顯微鏡下觀察CLU組、Sh組和GFP組細(xì)胞的感染效率，嘌呤霉素(2～20 mg·L-1)篩選出3組中表達(dá)GFP的陽性細(xì)胞，并擴(kuò)大培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 蛋白免疫印跡法檢測對照組、CLU組、Sh組和GFP組細(xì)胞中CLU蛋白的表達(dá)將對照組、CLU組、Sh組和GFP組細(xì)胞培養(yǎng)皿取出，置于冰上操作，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)清洗2遍后加入適量PBS，用細(xì)胞刮板刮取細(xì)胞，細(xì)胞收集后，依據(jù)細(xì)胞量加入適量RIPA細(xì)胞裂解液及蛋白酶抑制劑，混勻后，冰上裂解20 min，4 ℃、12 900 r·min-1離心5 min，收集上清。取 1 μL 上清液定量蛋白濃度，余下的上清液根據(jù)體積加入 5×蛋白上樣緩沖液，混勻后沸水煮5 min。制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，依次上樣、轉(zhuǎn)膜后，加入稀釋度11 000 CLU抗體以及β-肌動(dòng)蛋白抗體，4 ℃過夜孵育,然后加入稀釋的二抗室溫孵育1 h,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑顯色，應(yīng)用Amersham Imager600凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.5 脂肪變性細(xì)胞模型的建立將油酸和棕櫚酸鈉按照21的比例加入含有體積分?jǐn)?shù)1% BSA的DMEM無血清培養(yǎng)基中，得到 1 mmol 的FFA工作液。待對照組、CLU組、Sh組和GFP組細(xì)胞培養(yǎng)至密度約80%時(shí)，加入提前配置好的FFA工作液1 mmol 誘導(dǎo)24 h，得到脂肪變性細(xì)胞模型。細(xì)胞模型建好后，Sh組細(xì)胞隨機(jī)分為Sh-CLU低劑量組和Sh-CLU高劑量組，Sh-CLU低劑量組每毫升培養(yǎng)基中加入400 ng CLU，Sh-CLU高劑量組每毫升培養(yǎng)基中加入800 ng CLU，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.6 酶標(biāo)儀檢測BSA組、對照組、CLU組、Sh組和GFP組細(xì)胞中脂滴沉積量將對照組、CLU組、Sh組和GFP組細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔4×105個(gè)細(xì)胞，每組細(xì)胞接種2孔，待細(xì)胞貼壁后加入FFA誘導(dǎo)24 h;同時(shí)設(shè)BSA組作為對照，將對照組細(xì)胞以每孔4×105個(gè)細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板，接種2孔，細(xì)胞貼壁后，加入含有體積分?jǐn)?shù)1%BSA的DMEM無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。將5組細(xì)胞用PBS沖洗2次后，用4 mg·L-1多聚甲醛溶液室溫固定5～10 min,PBS沖洗3次，每次5 min。體積分?jǐn)?shù)60%異丙醇覆蓋細(xì)胞2～3 min后，棄去異丙醇，加入油紅染液室溫作用30 min后，棄去油紅染液，蒸餾水沖洗2次，蘇木精染色2 min，流水輕柔沖洗5 min，取適量雙蒸水覆蓋細(xì)胞，顯微鏡下觀察紅色脂質(zhì)著色情況。參照文獻(xiàn)[22]中的方法測細(xì)胞中脂滴沉積量。具體方法為：細(xì)胞經(jīng)油紅染色后蒸餾水清洗，棄去蒸餾水，殘余水分吸干后加入 500 μL 異丙醇反復(fù)吹打溶解油紅染料，取100 μL溶解油紅的異丙醇液體加入96孔板中，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，用酶標(biāo)儀測定各組油紅溶解液在540 nm波長處的光密度(optical density，OD)值，OD值越大代表脂滴沉積越多。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測對照組、CLU組、Sh組和GFP組細(xì)胞中CLU mRNA相對表達(dá)量以及對照組、CLU組、Sh組、Sh-CLU低劑量組和Sh-CLU高劑量組細(xì)胞中脂肪酸合成、脂肪酸氧化、脂滴形成、脂轉(zhuǎn)運(yùn)、脂解、氧化應(yīng)激和糖代謝相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量采用總核糖核酸抽提試劑(total RNA extraction reagent，TRIzol)法提取細(xì)胞RNA，測定RNA濃度進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA,反轉(zhuǎn)錄條件為42 ℃ 30 min,37 ℃ 1 h。cDNA擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸5 min。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶為內(nèi)參基因，上游引物序列為5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′,下游引物序列為5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′，產(chǎn)物大小123 bp。CLU上游引物序列為5′-AAGGGGGTGTACTTGAGCAG-3′，下游引物序列為5′-TCCCTTGAGTGGACAGTTCTTG-3′，產(chǎn)物大小60 bp。脂肪酸合成相關(guān)基因[23]引物：脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FASN)上游引物序列為5′-TGTGAAGCCGTTGGGAGTGA-3′,下游引物序列為5′-GCAATCTGGATGGCAGTGAGG-3′， 產(chǎn)物大小108 bp；乙酰輔酶A羧化酶α(acetyl-coenzyme A carboxylase alpha,ACACA)上游引物序列為5′-ATGGGCGGAATGGTCTCTTTC-3′,下游引物序列為5′-TGGGGACCTTGTCTTCATCAT-3′， 產(chǎn)物大小148 bp；硬脂酰輔酶A去飽和酶1(stearoyl-CoA desaturase 1,SCD1)上游引物序列為5′-TTCTTGCGATACACTCTGGTGC-3′,下游引物序列為5′-CGGGATTGAATGTTCTTGTCGT-3′，產(chǎn)物大小98 bp；固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c(sterol regulatory element binding protein1c,SREBP1C)上游引物序列為5′-GGTCAAAACCAGCCTCCCA-3′,下游引物序列為5′-CAGTCCCCGTCCACAAAGAA-3′，產(chǎn)物大小156 bp；成纖維細(xì)胞生長因子21(fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21)上游引物序列為5′-CTGCTGGGGGTCTACCAAG-3′,下游引物序列為5′-CTGCGCCTACCACTGTTCC-3′，產(chǎn)物大小154 bp。脂肪酸氧化相關(guān)基因[24]引物：肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1(carnitine palmitoyltransferases 1,CPT1)上游引物序列為5′-TGTATCGTCGCACGGTAGACC-3′,下游引物序列為5′-CGGGAAGTATTGAAGAGTCGCT-3′，產(chǎn)物大小106 bp；?；o酶A氧化酶1(acyl-coenzyme A oxidase 1,ACOX1)上游引物序列為5′-AGCTGCTCACAGTGACTCGC-3′,下游引物序列為5′-CTTCTTGGCCCACTCAAACA-3′，產(chǎn)物大小134 bp；過氧化物酶體增殖受體γ輔激活因子α(peroxisome proliferators-activated receptor γ coactivator lalpha,PGC1α)上游引物序列為5′-TATGGAGTGACATAGAGTGTGCT-3′,下游引物序列為5′-CCACTTCAATCCACCCAGAAAG-3′，產(chǎn)物大小134 bp；過氧化物增殖激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor alpha,PPARα)上游引物序列為5′-CAAGAAGACCGAGTCCGACG-3′,下游引物序列為5′-CTCCCTGAACAGTGGCAACG-3′，產(chǎn)物大小106 bp。脂滴形成相關(guān)基因[25]引物：脂肪誘導(dǎo)蛋白(fat inducing protein,Fitm)1上游引物序列為5′-TAGCCACGGCAACTTCTTCA-3′,下游引物序列為5′-AACACCACCAGCAGCACAAA-3′，產(chǎn)物大小93 bp；Fitm2上游引物序列為5′-TTACCAACTACCACCTGACGGG-3′,下游引物序列為5′-ACTGCTGCTTGCTGCGATG-3′，產(chǎn)物大小186 bp；G0/G1期開關(guān)基因2 (G0/G1switch gene 2,G0S2)上游引物序列為5′-TGCCACCGAATCCAGAACT-3′,下游引物序列為5′-CTCCTTGATTGCTCGCACA-3′，產(chǎn)物大小113 bp；脂滴包被蛋白2(perilipin 2，Plin2)上游引物序列為5′-ATACAGTTTTGGGGATGGTGC-3′,下游引物序列為5′-CGTTCATAGTTGCTCGGCTT-3′，產(chǎn)物大小169 bp。脂轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因[25]引物：血小板反應(yīng)蛋白受體(thrombospondin receptor,CD36)上游引物序列為5′-TACCTGGGAGTTGGCGAGA-3′,下游引物序列為5′-CCGACTGGCATGAGAATGC-3′，產(chǎn)物大小146 bp；脂肪酸結(jié)合蛋白1(fatty acid binding protein 1,Fabp1)上游引物序列為5′-AGCCAGGAGAACTTTGAGCC-3′,下游引物序列為5′-CACTTTGGGTCCATAGGTGATG-3′，產(chǎn)物大小144 bp。脂解相關(guān)基因[25]引物：含PATATIN樣磷脂酶域蛋白2(PATATIN like phospholipase domain containing protein 2 ，PNPLA2)上游引物序列為 5′-CCATGATGGTGCCCTATACTCT-3′,下游引物序列為5′-GCTACCCGTCTGCTCTTTCAT-3′，產(chǎn)物大小119 bp；肝脂酶(hepatic lipase，LIPC)上游引物序列為5′-ATGGGAAATCCCCTCCAAATCT-3′,下游引物序列為5′-GTGCTGAGGTCTGAGACGA-3′，產(chǎn)物大小207 bp；激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive lipase，LIPE)上游引物序列為5′-CCAGCCTGAGGGCTTACTG-3′,下游引物序列為5′-CTCCATTGACTGTGACATCTCG-3′，產(chǎn)物大小106 bp。氧化應(yīng)激相關(guān)基因[24]引物：醌氧化還原酶1(quinone oxidoreductase 1，NQO1)上游引物序列為5′-ATCCTGCGTTTCTGTGGCTT-3′,下游引物序列為5′-GCAAAATAGAGTGGGGTCTCCT-3′，產(chǎn)物大小 146 bp；谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶M1(glutathione S-transferase M1,GSTM1)上游引物序列為5′-GGACTTTCCCAATCTGCCTT-3′,下游引物序列為5′-TCCATCCAGGTGGTGCTTT-3′，產(chǎn)物大小100 bp；谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶α2(glutathione S transferase alpha 2,GSTA2)上游引物序列為5′-AGCCCGTGCTTCACTACTTCA-3′,下游引物序列為5′-TCTTCAAACTCCACCCCTGC-3′，產(chǎn)物大小85 bp；谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶Α4(glutathione S transferase A4，GSTA4)上游引物序列為5′-TGATTGCCGTGGCTCCATTTA-3′,下游引物序列為5′-CAACGAGAAAAGCCTCTCCGT-3′，產(chǎn)物大小135 bp；谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基(glutamate cysteine ligasecatalytic，GCLC)上游引物序列為5′-GGGGTGACGAGGTGGAGTA-3′,下游引物序列為5′-GTTGGGGTTTGTCCTCTCCC-3′，產(chǎn)物大小125 bp。糖代謝相關(guān)基因[24]引物：丙酮酸脫氫酶激酶同工酶1(pyruvate dehydrogenase kinase,isozyme 1，PDK1)上游引物序列為5′-GGACTTCGGGTCAGTGAATGC-3′,下游引物序列為5′-TCCTGAGAAGATTGTCGGGGA-3′，產(chǎn)物大小122 bp；丙酮酸激酶同工酶L/R(pyruvate kinase L/R，PKLR)上游引物序列為5′-CCCTCCCATAGTCCCACATCT-3′,下游引物序列為5′-TGAGCGGATTGAGACAGGGATA-3′，產(chǎn)物大小 129 bp；Kruppel樣因子15(Kruppel like factor 15，KLF15)上游引物序列為5′-TCTCGTCACCGAAATGCTCA-3′,下游引物序列為5′-AACAGAAGGCTTGCGAGTCAG-3′，產(chǎn)物大小150 bp；葡萄糖-6-磷酸酶催化亞基(glucose-6-phosphatase catalytic，G6PC)上游引物序列為5′-TGTTTGTTGGTGCTTTTGTAGG-3′,下游引物序列為5′-TTTCTGCCCCAGGAATCAA-3′，產(chǎn)物大小123 bp。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)溶解曲線鑒定為單一產(chǎn)物，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定過表達(dá)和敲減CLU的細(xì)胞株構(gòu)建及驗(yàn)證結(jié)果見圖1和圖2。CLU組細(xì)胞中CLU蛋白表達(dá)量最多，明顯多于對照組和GFP組，Sh組幾乎無CLU蛋白表達(dá)，GFP組和對照組的CLU蛋白表達(dá)量基本一致。對照組、CLU組、Sh組和GFP組細(xì)胞中CLU mRNA相對表達(dá)量分別為1.03±0.06、3.64±0.12、0.25±0.13、1.08±0.32。CLU組細(xì)胞中CLU mRNA相對表達(dá)量顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Sh組細(xì)胞中CLU mRNA相對表達(dá)量顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；GFP組與對照組細(xì)胞中CLU mRNA相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。顯微鏡白光視野下觀察發(fā)現(xiàn)，CLU組細(xì)胞形態(tài)與對照組細(xì)胞相似，呈現(xiàn)上皮樣，細(xì)胞為多邊形；Sh組大部分細(xì)胞呈扁平狀，細(xì)胞變大伸展鋪開，細(xì)胞邊緣呈鋸齒狀。

1：對照組；2:CLU組；3：Sh組；4：GFP組。

右側(cè)圖分別為左側(cè)方塊圈起的放大視野。

2.2 對照組、BSA組、CLU組、Sh組和GFP組細(xì)胞中脂滴沉積量比較結(jié)果見圖3和表1。BSA組細(xì)胞中無明顯的脂滴沉積，對照組、CLU組、Sh組和GFP組細(xì)胞中存在大量脂滴沉積。對照組、CLU組、Sh組和GFP組細(xì)胞中脂滴沉積量顯著高于BSA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CLU組細(xì)胞中脂滴沉積量顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Sh組細(xì)胞中脂滴沉積量顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；GFP組與對照組細(xì)胞中脂滴沉積量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A：對照組；B:BSA組；C：CLU組;D:Sh組;E:GFP組。

表1 對照組、BSA組、CLU組、Sh組和GFP組細(xì)胞中脂滴沉積量比較

2.3 對照組、CLU組、Sh組、Sh-CLU低劑量組和Sh-CLU高劑量組細(xì)胞中脂肪酸合成和脂肪酸氧化相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量比較結(jié)果見表2和表3。CLU組細(xì)胞中FASN、ACACA、SCD1 mRNA的相對表達(dá)量顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CLU組與對照組細(xì)胞中SREBP1C、FGF21 mRNA的相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Sh組細(xì)胞中FASN、ACACA、SCD1、SREBP1C mRNA的相對表達(dá)量顯著高于對照組和CLU組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Sh組細(xì)胞中FGF21 mRNA的相對表達(dá)量與對照組、CLU組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Sh-CLU低劑量組與對照組細(xì)胞中FASN、ACACA mRNA的相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Sh-CLU低劑量組細(xì)胞中SCD1、SREBP1C、FGF21 mRNA的相對表達(dá)量顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Sh-CLU低劑量組細(xì)胞中FASN、ACACA mRNA的相對表達(dá)量顯著低于CLU組，F(xiàn)GF21 mRNA 的相對表達(dá)量顯著高于CLU組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Sh-CLU低劑量組與CLU組細(xì)胞中SCD1、SREBP1C mRNA的相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Sh-CLU低劑量組細(xì)胞中ACACA、SCD1 mRNA的相對表達(dá)量顯著低于Sh組，F(xiàn)GF21 mRNA的相對表達(dá)量顯著高于Sh組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Sh-CLU低劑量組與Sh組細(xì)胞中FASN、SREBP1C mRNA的相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Sh-CLU高劑量組細(xì)胞中FASN、ACACA、SCD1、SREBP1C、FGF21 mRNA的相對表達(dá)量均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Sh-CLU高劑量組細(xì)胞中FASN、ACACA、SCD1、FGF21 mRNA的相對表達(dá)量均顯著高于CLU組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Sh-CLU高劑量組與CLU組細(xì)胞中SREBP1C mRNA的相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

CLU組細(xì)胞中CPT1、ACOX1、PGC1α mRNA的相對表達(dá)量顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CLU組與對照組細(xì)胞中PPARα mRNA 的相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Sh組細(xì)胞中CPT1、ACOX1 mRNA的相對表達(dá)量顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Sh組與對照組細(xì)胞中PGC1α、PPARα mRNA的相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Sh組細(xì)胞中CPT1、PGC1α、PPARα mRNA的相對表達(dá)量顯著低于CLU組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Sh組與CLU組細(xì)胞中ACOX1 mRNA的相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Sh-CLU低劑量組和Sh-CLU高劑量組細(xì)胞中CPT1、ACOX1、PPARα mRNA的相對表達(dá)量均顯著高于對照組、CLU組和Sh組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Sh-CLU低劑量組細(xì)胞中PGC1α mRNA相對表達(dá)量顯著高于對照組和Sh組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Sh-CLU低劑量組與CLU組細(xì)胞中PGC1α mRNA相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Sh-CLU高劑量組細(xì)胞中PGC1α mRNA相對表達(dá)量顯著高于對照組、Sh組和CLU組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 對照組、CLU組、Sh組、Sh-CLU低劑量組、Sh-CLU高劑量組細(xì)胞中脂肪酸合成相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量比較

表3 對照組、CLU組、Sh組、Sh-CLU低劑量組、Sh-CLU高劑量組細(xì)胞中脂肪酸氧化相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量比較

2.4 對照組、CLU組、Sh組、Sh-CLU低劑量組和Sh-CLU高劑量組細(xì)胞中脂滴形成、脂轉(zhuǎn)運(yùn)及脂解相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量比較結(jié)果見表4和表5。CLU組細(xì)胞中Fitm1、Fitm2 mRNA的相對表達(dá)量顯著低于對照組，Plin2 mRNA的相對表達(dá)量顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Sh組細(xì)胞中Fitm1、Fitm2、Plin2 mRNA的相對表達(dá)量顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Sh組細(xì)胞中Fitm1、Fitm2 mRNA的相對表達(dá)量顯著高于CLU組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Sh組與CLU組細(xì)胞中Plin2 mRNA的相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Sh-CLU低劑量組細(xì)胞中Fitm1 mRNA的相對表達(dá)量顯著低于對照組，Plin2 mRNA的相對表達(dá)量顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Sh-CLU低劑量組與對照組細(xì)胞中Fitm2 mRNA的相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Sh-CLU低劑量組細(xì)胞中Plin2 mRNA的相對表達(dá)量顯著高于CLU組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Sh-CLU低劑量組與CLU組細(xì)胞中Fitm1、Fitm2 mRNA的相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Sh-CLU 低劑量組細(xì)胞中Fitm1、Fitm2 mRNA的相對表達(dá)量顯著低于Sh組，Plin2 mRNA的相對表達(dá)量顯著高于Sh組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Sh-CLU高劑量組細(xì)胞中Fitm1 mRNA的相對表達(dá)量顯著低于對照組、CLU組和Sh組，Plin2 mRNA的相對表達(dá)量顯著高于對照組、CLU組和Sh組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Sh-CLU高劑量組與對照組、CLU組細(xì)胞中Fitm2 mRNA的相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Sh-CLU高劑量組細(xì)胞中Fitm2 mRNA的相對表達(dá)量顯著低于Sh組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組細(xì)胞中G0S2mRNA的相對表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

CLU組細(xì)胞中CD36、Fabp1、PNPLA2、LIPC、LIPE mRNA的相對表達(dá)量均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Sh組細(xì)胞中CD36、Fabp1、NPLA2、LIPC mRNA的相對表達(dá)量顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Sh組與對照組細(xì)胞中LIPE mRNA的相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Sh組細(xì)胞中CD36、LIPE mRNA的相對表達(dá)量顯著低于CLU組，PNPLA2 mRNA的相對表達(dá)量顯著高于CLU組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Sh組與CLU組細(xì)胞中Fabp1、LIPC mRNA的相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Sh-CLU低劑量組和Sh-CLU高劑量組細(xì)胞中CD36、Fabp1、PNPLA2、LIPC、LIPE mRNA的相對表達(dá)量均顯著高于對照組、CLU組和Sh組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 對照組、CLU組、Sh組、Sh-CLU低劑量組和Sh-CLU高劑量組細(xì)胞中脂滴形成相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量比較

表5 對照組、CLU組、Sh組、Sh-CLU低劑量組和Sh-CLU高劑量組細(xì)胞中脂轉(zhuǎn)運(yùn)和脂解相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量比較

2.5 對照組、CLU組、Sh-CLU組、Sh-CLU低劑量組和Sh-CLU高劑量組細(xì)胞中氧化應(yīng)激及糖代謝相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量比較結(jié)果見表6和表7。CLU組細(xì)胞中NQO1、GSTA2、GCLC mRNA的相對表達(dá)量顯著高于對照組，GSTM1 mRNA的相對表達(dá)量顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CLU組與對照組細(xì)胞中GSTA4 mRNA 相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Sh組NQO1、GSTM1、GCLC mRNA的相對表達(dá)量顯著高于對照組，GSTA4 mRNA的相對表達(dá)量顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Sh組與對照組細(xì)胞中GSTA2 mRNA的相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Sh組細(xì)胞中GSTM1 mRNA的相對表達(dá)量顯著高于CLU組，GSTA2、GSTA4、GCLC mRNA相對表達(dá)量顯著低于CLU組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Sh組與CLU組細(xì)胞中NQO1 mRNA的相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Sh-CLU低劑量組和Sh-CLU高劑量組細(xì)胞中NQO1、GSTM1、GSTA2、GCLC mRNA 的相對表達(dá)量顯著高于對照組、CLU組和Sh組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Sh-CLU低劑量組細(xì)胞中GSTA4 mRNA的相對表達(dá)量與對照組、CLU組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Sh-CLU 低劑量組細(xì)胞中GSTA4 mRNA相對表達(dá)量顯著高于Sh組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Sh-CLU 高劑量組細(xì)胞中GSTA4 mRNA的相對表達(dá)量顯著高于對照組、CLU組和Sh組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

CLU組細(xì)胞中PDK1、PKLR、KLF15、G6PC mRNA的相對表達(dá)量顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Sh組細(xì)胞中KLF15、G6PC mRNA的相對表達(dá)量顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Sh組與對照組細(xì)胞中PDK1、PKLR mRNA的相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Sh組細(xì)胞中PDK1、G6PC mRNA相對表達(dá)量顯著低于CLU組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Sh組與CLU組細(xì)胞中PKLR、KLF15 mRNA相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Sh-CLU 低劑量組和Sh-CLU高劑量組細(xì)胞中PDK1、G6PC mRNA相對表達(dá)量顯著高于對照組、CLU組和Sh組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Sh-CLU高劑量組細(xì)胞中PKLR mRNA的相對表達(dá)量顯著低于對照組、CLU組和Sh組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Sh-CLU低劑量組細(xì)胞中PKLR、KLF15 mRNA的相對表達(dá)量顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Sh-CLU低劑量組細(xì)胞中PKLR、KLF15 mRNA的相對表達(dá)量與CLU組、Sh組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Sh-CLU高劑量組細(xì)胞中KLF15 mRNA的相對表達(dá)量顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Sh-CLU高劑量組與CLU組、Sh組細(xì)胞中KLF15 mRNA的相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表6 對照組、CLU組、Sh組、Sh-CLU低劑量組和Sh-CLU高劑量組細(xì)胞中氧化應(yīng)激相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量比較

表7 對照組、CLU組、Sh組、Sh-CLU低劑量組和Sh-CLU高劑量組細(xì)胞中糖代謝相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量比較

3 討論

肝臟是脂質(zhì)代謝和葡萄糖代謝的中心器官，關(guān)于NAFLD的大量研究強(qiáng)調(diào)了病變肝臟內(nèi)代謝功能改變的重要性。肥胖和代謝綜合征可導(dǎo)致NAFLD的發(fā)生以及機(jī)體一系列病理生理變化，如增加了肝臟對急性肝損傷的易感性，這可能逐步導(dǎo)致肝硬化和肝細(xì)胞癌的發(fā)生。在NAFLD進(jìn)展過程中，肝細(xì)胞脂肪變性是第1個(gè)發(fā)展階段。CLU一直被認(rèn)為與脂轉(zhuǎn)運(yùn)和氧化應(yīng)激相關(guān)，且有研究顯示，CLU過表達(dá)可以改善肥胖癥或NAFLD[19]。本研究采用過量FFA誘導(dǎo)CLU過表達(dá)和敲減的Hep1-6細(xì)胞株，并建立脂肪變性細(xì)胞模型，觀察并檢測肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積量，脂肪酸合成與氧化、脂解、葡萄糖代謝和氧化應(yīng)激相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的變化。本研究發(fā)現(xiàn)，Sh組細(xì)胞株的形態(tài)較對照組細(xì)胞更為扁平，細(xì)胞形態(tài)更差，說明CLU可能對維持細(xì)胞正常形態(tài)有一定作用。通過FFA誘導(dǎo)脂肪變性細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)，Sh組細(xì)胞中脂滴沉積量顯著高于對照組，CLU組細(xì)胞中脂滴沉積量顯著少于對照組，說明CLU過表達(dá)可促進(jìn)脂滴的沉積，而沉默CLU表達(dá)則可在一定程度上減少脂滴沉積。正常的肝臟脂質(zhì)代謝平衡離不開脂肪酸的合成和氧化作用，本研究通過檢測細(xì)胞中脂生成相關(guān)基因FASN、ACACA、SCD1和SREBP1C的mRNA表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與CLU組相比，Sh組細(xì)胞中ACACA、SCD1和SREBP1C mRNA表達(dá)水平顯著增加；與對照組相比，CLU組細(xì)胞中FASN、ACACA和SCD1 mRNA的表達(dá)也在一定程度上增加。與Sh組相比，Sh-CLU低劑量組細(xì)胞中脂肪酸合成相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平顯著減少，而Sh-CLU高劑量組細(xì)胞中表達(dá)水平顯著升高。說明CLU可能起到平衡脂肪酸合成的作用。FGF21可提高胰島素的敏感性，從而降低三酰甘油的表達(dá)[26]。本研究結(jié)果顯示，與CLU組相比，Sh組細(xì)胞中FGF21 mRNA 的表達(dá)水平顯著降低；與對照組相比，CLU組、Sh-CLU低劑量組和Sh-CLU高劑量組細(xì)胞中FGF21 mRNA的表達(dá)水平顯著升高。該結(jié)果說明，CLU過表達(dá)會(huì)顯著增加脂肪酸的氧化。與CLU組相比，Sh組細(xì)胞中Fitm1、Fitm2 mRNA的表達(dá)水平顯著升高；與Sh組相比，Sh-CLU低劑量組和Sh-CLU高劑量組細(xì)胞中Fitm mRNA表達(dá)水平顯著降低；說明過表達(dá)CLU會(huì)降低脂滴儲(chǔ)存的穩(wěn)定性。與對照組和Sh組相比，CLU組、Sh-CLU低劑量組和Sh-CLU高劑量組細(xì)胞中脂轉(zhuǎn)運(yùn)和脂解相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平均顯著升高，說明CLU可能是通過抑制脂滴儲(chǔ)存的穩(wěn)定性和增加脂解來維持脂質(zhì)平衡的。與CLU組相比，Sh-CLU低劑量組和Sh-CLU高劑量組細(xì)胞中脂解相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平顯著升高，提示脂解程度的高低可能與CLU水平密切相關(guān)。NAFLD的一個(gè)重要特征是氧化應(yīng)激的變化[27]，CLU是一種敏感的氧化損傷生物傳感器，即使是細(xì)胞氧化負(fù)荷的微小變化[28-29]，CLU也能感應(yīng)到并作出反應(yīng)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Sh組相比,CLU組細(xì)胞中氧化應(yīng)激相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平顯著升高，表明CLU過表達(dá)可以有效提高抗氧化因子表達(dá)。與CLU組相比，Sh-CLU低劑量組和Sh-CLU高劑量組氧化應(yīng)激相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平顯著升高，再次證實(shí)了CLU在脂代謝中可能作為抗氧化應(yīng)激的保護(hù)性生物效應(yīng)器起作用，這一作用可能在外源CLU的加入下增強(qiáng)。葡萄糖代謝可提供合成三酰甘油所需的甘油及脂肪酸,其中甘油由糖酵解生成的磷酸二羥丙酮轉(zhuǎn)化而成,脂肪酸由糖氧化分解生成的乙酰輔酶A合成，PDK1能磷酸化丙酮酸脫氫酶使其失去活性,抑制丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A[30],并且有研究表明，脂解速度決定了糖異生速度[31-32]。本研究還發(fā)現(xiàn)，與對照組和Sh組相比，CLU組、Sh-CLU 低劑量組和Sh-CLU高劑量組細(xì)胞中PDK1和G6PC mRNA表達(dá)水平顯著升高,表明CLU可能會(huì)抑制糖酵解中乙酰輔酶A產(chǎn)生，并可促進(jìn)糖異生。

綜上所述，CLU在脂代謝的調(diào)控中可能主要通過脂肪酸氧化和脂解發(fā)揮作用，同時(shí)通過提高胰島素的敏感性和促進(jìn)糖異生等輔助調(diào)節(jié)脂質(zhì)平衡。除此之外，CLU還可能通過減少氧化損傷對細(xì)胞的刺激，從而對細(xì)胞起保護(hù)作用，這或許對整體細(xì)胞功能來說具有重要意義。因?yàn)楸敬沃辉诩?xì)胞層面進(jìn)行研究，未涉及到太多機(jī)制，所以這一結(jié)果應(yīng)結(jié)合體內(nèi)研究綜合分析，擴(kuò)大當(dāng)前研究的意義，從而進(jìn)一步闡明CLU在NAFLD發(fā)展中的作用，及其在糖代謝、血脂代謝和氧化應(yīng)激中的具體作用機(jī)制。