基因診斷技術(shù)在脊柱結(jié)核診斷中的應(yīng)用現(xiàn)狀

胡潮興，梁秋冬

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南 衛(wèi)輝 453100；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院脊柱與創(chuàng)傷外科二病區(qū)，河南 衛(wèi)輝453100)

結(jié)核病的發(fā)病率與國家和地區(qū)的經(jīng)濟水平有關(guān)，低收入國家或地區(qū)結(jié)核病的發(fā)病率是高收入國家的10倍以上，病死率更是高出20倍以上。東南亞地區(qū)與西太平洋地區(qū)發(fā)展中國家的新發(fā)結(jié)核病病例數(shù)量占據(jù)了全球50%以上，結(jié)核病成為發(fā)展中國家面臨的主要健康問題之一[1-2]。結(jié)核病患者常繼發(fā)骨關(guān)節(jié)結(jié)核，而骨與關(guān)節(jié)結(jié)核中大約50%為脊柱結(jié)核，但從感染結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)到出現(xiàn)臨床表現(xiàn)所需時間較長，一般需要 11.2 個月[3]。脊柱結(jié)核的起病及初期癥狀不典型，極易與化膿性脊柱炎、骨質(zhì)疏松性椎體壓縮骨折、各種脊柱原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移瘤、嗜酸性肉芽腫等疾病相混淆，造成診斷失誤[4]，增加患者痛苦、延誤治療。傳統(tǒng)的診斷技術(shù)在診斷脊柱結(jié)核時存在一定的局限，基因診斷技術(shù)作為一種快速發(fā)展的新型診斷技術(shù)，在診斷脊柱結(jié)核中扮演著越來越重要的角色。本文將介紹臨床中常見的幾種基因診斷技術(shù)，以幫助臨床工作者了解并靈活使用基因診斷技術(shù)，對于傳統(tǒng)診斷技術(shù)難以診斷的脊柱結(jié)核進行早期、準確的判斷，并使患者盡可能早期接受正規(guī)治療，從而盡快改善患者的癥狀。

1 脊柱結(jié)核的流行現(xiàn)狀

根據(jù)世界衛(wèi)生組織(world health organization，WHO)報告，截至2017年，全世界范圍內(nèi)大約有17億人口存在MTB潛伏感染，其中已有157萬人因MTB感染死亡[1]。脊柱結(jié)核是一種最常見的肺外結(jié)核，其發(fā)病率居骨關(guān)節(jié)結(jié)核第1位。隨著科技的不斷進步、診斷工具的發(fā)展和外科手術(shù)術(shù)式的改良，脊柱結(jié)核的診斷以及治療水平得以逐步提高，但受耐藥菌群、人類免疫缺陷病毒流行趨勢增加等各方面因素的影響，尤其是在經(jīng)濟不發(fā)達、衛(wèi)生條件較差的地區(qū)，脊柱結(jié)核患病率呈上升趨勢。MTB感染病灶多位于脊柱的椎體部分，且易侵及椎管，造成椎管內(nèi)膿腫形成，對脊髓或神經(jīng)產(chǎn)生壓迫，使患者出現(xiàn)各種神經(jīng)癥狀，甚至殘留難以恢復(fù)的脊髓神經(jīng)嚴重后遺癥，對患者和社會造成嚴重的影響[5]。脊柱結(jié)核的診斷與肺結(jié)核不同，如結(jié)核桿菌純蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)皮膚試驗、血清抗結(jié)核抗體檢測、涂片抗酸染色檢查等傳統(tǒng)的檢查方法在肺結(jié)核病方面表現(xiàn)出良好診斷價值，但對脊柱結(jié)核的檢出率明顯偏低，導(dǎo)致脊柱結(jié)核誤診在臨床上很常見[6]。

2 脊柱結(jié)核的發(fā)病機制及漏診、誤診因素

脊柱結(jié)核主要由MTB從原發(fā)灶(如肺結(jié)核、腸結(jié)核、淋巴結(jié)核等)經(jīng)血液循環(huán)播散侵入椎體引發(fā)。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，脊柱結(jié)核最常累及的部位為腰椎[7]。與肺結(jié)核不同，脊柱結(jié)核患者因少有咳嗽、咳痰、低熱、盜汗等典型結(jié)核毒性癥狀，早期常常較易漏診或誤診。早期脊柱結(jié)核以局部癥狀為主，多為脊柱節(jié)段性僵硬和活動時疼痛等；由于幼兒缺乏主動表達的能力，常表現(xiàn)為 “夜啼” 現(xiàn)象。每個個體因其免疫能力強弱及感染菌種毒力不同，脊柱結(jié)核的發(fā)病情況差異也較大。對于營養(yǎng)條件良好、身體素質(zhì)佳的患者，即使未經(jīng)規(guī)范診治，癥狀也能逐漸自行好轉(zhuǎn)，甚至有的患者無明顯的不適癥狀，或者僅有輕度不適而不知道患上脊柱結(jié)核[8]。但大多數(shù)患者在缺乏規(guī)范的抗結(jié)核藥物治療情況下，隨著MTB對椎體造成的侵蝕逐漸加重，可出現(xiàn)脊柱穩(wěn)定性降低、脊柱后凸畸形、椎旁冷膿腫或竇道形成等一系列癥狀，較嚴重者可因為脊髓壓迫或炎癥刺激而出現(xiàn)嚴重的神經(jīng)損害癥狀(如截癱、脊柱畸形、四肢無力等)，有些家庭往往因此喪失主要經(jīng)濟來源從而因病致貧。因為脊柱結(jié)核發(fā)病與肺結(jié)核相比更加隱匿，導(dǎo)致患者更加容易忽視不明顯的不適癥狀，而基層醫(yī)院診療水平的參差不齊又常導(dǎo)致誤診，從而延誤最佳治療時機。有的患者甚至疾病持續(xù)幾個月到幾年才來就診，甚至有的患者因為出現(xiàn)脊柱后凸畸形與神經(jīng)障礙癥狀才就診[9]。由此可見，脊柱結(jié)核因為其早期癥狀不典型，常常被患者忽視，從而導(dǎo)致缺乏早期干預(yù)，就診時已錯過最佳的治療時機，可導(dǎo)致患者喪失勞動力。脊柱結(jié)核如果得到及時規(guī)范的抗結(jié)核治療，預(yù)后往往較好，因此，脊柱結(jié)核的早期準確診斷對患者的預(yù)后有很大影響。

3 脊柱結(jié)核的診斷標(biāo)準

結(jié)核病診斷的金標(biāo)準為MTB培養(yǎng)。但在肺外結(jié)核診治領(lǐng)域，國內(nèi)仍缺乏權(quán)威性的指南或診療規(guī)范。在臨床中，經(jīng)常采用的診斷標(biāo)準除傳統(tǒng)的羅氏細菌培養(yǎng)還有脊柱結(jié)核綜合診斷標(biāo)準、病理學(xué)診斷標(biāo)準及改良羅氏培養(yǎng)或其他病原學(xué)檢測等。

4 脊柱結(jié)核主要診斷技術(shù)

脊柱結(jié)核的診斷技術(shù)主要分為以下幾類：(1)細菌學(xué)檢查，包括傳統(tǒng)的羅氏細菌培養(yǎng)以及其他新型的細菌培養(yǎng)方法；(2)實驗室檢查，主要是檢測外周血中炎癥標(biāo)志物水平；(3)免疫學(xué)檢查，主要檢測機體對MTB的特異性抗體，包括PPD試驗、結(jié)核感染T 細胞斑點試驗、血清MTB抗體等檢查；(4)影像學(xué)檢查，主要包括X線、CT、核磁共振成像以及正電子發(fā)射計算機斷層顯像等；(5)傳統(tǒng)病理學(xué)檢查；(6)基因診斷等。每種診斷技術(shù)的靈敏度和特異度各不相同，在對不同個體進行診斷時，也會因為個體差異，導(dǎo)致各項診斷結(jié)果不典型甚至相悖；且由于醫(yī)療機構(gòu)條件或患者經(jīng)濟水平所限，以上的各種診斷技術(shù)并不能完全應(yīng)用到所有患者。因此，需要綜合臨床表現(xiàn)與各診斷結(jié)果，做出更加合理的診斷。

5 基因診斷技術(shù)在脊柱結(jié)核診斷中的應(yīng)用

基因診斷是利用重組DNA技術(shù)，直接從基因水平檢測微生物病原體的檢測手段。1972年，GOFF和 BERG完成了世界上首次DNA分子的重組，標(biāo)志著基因檢測技術(shù)從此誕生[10]。隨著聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)及基因芯片等技術(shù)的不斷出現(xiàn)和發(fā)展，基因診斷技術(shù)得到不斷完善。此外，隨著MTB基因測序的完成，基因診斷技術(shù)也將在臨床結(jié)核病的診斷中得到更加廣泛的應(yīng)用，并被臨床工作者更加接受與認可[11]。目前，臨床中已經(jīng)獲得廣泛應(yīng)用的技術(shù)有 PCR直接測序鑒定法、PCR-DNA 探針鑒定法、結(jié)核桿菌利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增技術(shù) (rifampicin resistantMycobacteriumtuberculosissemi-nested multiple real-time fluorescence quantitative system，Xpert MTB/RIF)、PCR-基因芯片鑒定法等[12]。

5.1 Xpert MTB/RIFXpert MTB/RIF是一種新型的結(jié)核病診斷技術(shù)，由美國 Cepheid 公司研發(fā)，對肺結(jié)核診斷效能較好，是診斷肺結(jié)核的重要工具。近年來，隨著Xpert MTB/RIF技術(shù)的不斷改良，其對肺外結(jié)核的診斷效能也在不斷提高。有研究表明，Xpert MTB/RIF檢測和Bactec MGIT960 培養(yǎng)法診斷脊柱結(jié)核的敏感度分別為 76.38%、54.60%，特異度分別為95.00%、90.00%，說明Xpert MTB/RIF對臨床脊柱結(jié)核的診斷有極大的參考價值[12]。Xpert MTB/RIF除了可以檢測MTB，還可以評估MTB對利福平的耐藥性；RpoB 基因序列是MTB的特異性序列，反映了MTB對于利福平的耐藥性，該方法以半巢式實時定量 PCR為基礎(chǔ)檢測標(biāo)本中的RpoB 基因特定序列，其檢測時間為 120 min左右，可以通過該基因序列的表達判斷對利福平的耐藥性。Xpert MTB/RIF操作簡單，檢測耗費時間短[13]，被WHO 推薦為檢測結(jié)核病以及其對利福平耐藥性的診斷技術(shù)[14]。研究表明，對椎體穿刺活檢、B 超定位下穿刺、開放手術(shù)所收集的病灶組織進行Xpert MTB/RIF檢測，其靈敏度分別為 44.68%、76.47%、83.78%，因此，合理使用Xpert MTB/RIF技術(shù)對陽性率高的來源標(biāo)本進行檢測，可以最大限度地發(fā)揮Xpert MTB/RIF的優(yōu)勢，獲得良好的靈敏度與特異度，對脊柱結(jié)核的診斷起到重要的輔助作用，且可指導(dǎo)臨床用藥[15]。

5.2 PCR-單鏈探針反向雜交試驗(line probe assay,LiPA)LiPA基本原理與Xpert MTB/RIF大致相同，操作步驟相似[16]。LiPA中的線性探針法臨床接受度較高。目前，LiPA 是診斷脊柱結(jié)核的一種重要診斷工具，與臨床中影像學(xué)、病理學(xué)及免疫學(xué)等診斷技術(shù)一致性較好。WHO在2008年正式建議使用LiPA對肺外結(jié)核進行檢測。LiPA 在菌種鑒定及耐藥基因檢測方面也具有重要作用。隨著 LiPA 技術(shù)的應(yīng)用，使得結(jié)核病診斷效率明顯提高。但是，目前LiPA存在價格高昂、操作繁瑣、探針數(shù)量有限等諸多問題，這限制了其在臨床中的普及；LiPA對取材的要求較高，而在肺外結(jié)核特別是脊柱與關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷中，由于標(biāo)本量不足及標(biāo)本預(yù)處理不當(dāng)，會造成結(jié)果的偏差，使LiPA檢出率在臨床的實際使用中陽性率較預(yù)期結(jié)果偏低。

5.3 多重PCR技術(shù)(multiplex polymerase chain reaction，MPCR)MPCR采用IS6110、蛋白 b 和 MPB64基因進行擴增，在結(jié)核性腦膜炎的診斷中表現(xiàn)出良好的靈敏度(86.38%)和特異度(100.00%)[17]。與痰液不同，結(jié)核性腦膜炎的標(biāo)本含菌量少，與脊柱結(jié)核的標(biāo)本有一定程度上的相似性，這使得 MPCR 成為診斷脊柱結(jié)核的潛在工具；與涂片和單純 PCR技術(shù)相比，MPCR有更好的敏感度和特異度且結(jié)果獲取更快速，但其對脊柱結(jié)核的診斷價值需要進一步研究。

5.4 外周血血清特異性循環(huán)微RNA(microRNA，miRNA)結(jié)核患者外周血血清特異性循環(huán)miRNA是近期的研究熱點之一。miRNA作為高度保守的非編碼單鏈RNA分子，廣泛存在于真核細胞中，在細胞的代謝過程發(fā)揮生物調(diào)節(jié)作用[18]。研究表明，結(jié)核病患者血清中存在miRNA異常表達，差異化表達的miRNA可作為生物學(xué)指標(biāo)應(yīng)用于結(jié)核病的輔助診斷[19]。黃志剛等[20]對17種miRNA的差異化表達進行了研究，結(jié)果表明，hsa-miR-30c-5p與脊柱結(jié)核密切相關(guān)。hsa-miR-30c的潛在靶基因分別為FLT1、CXCL12、RUNX2，分別負責(zé)干細胞特性維持、間充質(zhì)干細胞表型和成骨分化[21-23]。hsa-miR-30c-5p在脊柱結(jié)核的診斷中表現(xiàn)出較高的敏感度、特異度、準確度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值，分別可達到100.00%、96.00%、98.00%、96.15%和100.00%。外周血血清miRNA相比于細胞內(nèi)miRNA，具有更好的生物學(xué)特性，是一種較為理想的生物標(biāo)志物，可應(yīng)用于肺結(jié)核和其他多種疾病的臨床診斷[24-26]。目前，外周血血清miRNA檢測因其取材標(biāo)本為外周血血清，比起術(shù)中取標(biāo)本及超聲/CT引導(dǎo)下穿刺活檢的創(chuàng)傷更小，預(yù)測其可以獲得更好的依從性。

5.5 RNA實時熒光恒溫擴增技術(shù)(simultaneous amplification and testing，SAT)SAT是一種恒溫下可將專有核酸在30 min內(nèi)擴增10億倍的熒光檢測體系，擴增倍率高。SAT檢測的標(biāo)靶為RNA，RNA僅在活菌中存在，在MTB死亡后其會迅速降解，因此，降低了假陽性率，且對于活動期結(jié)核的診斷意義更大[27]。但是，對于靜止期或陳舊性結(jié)核的診斷靈敏度較低。在脊柱結(jié)核手術(shù)的術(shù)前準備中，大部分患者如無特殊情況，均會進行術(shù)前2～4周的規(guī)范抗結(jié)核藥物治療[28]；而經(jīng)治療后大部分脊柱結(jié)核病灶內(nèi)細菌由活動期轉(zhuǎn)為靜止期，從而造成SAT檢查敏感度有所下降[29]。采用多種診斷方法聯(lián)合診斷可提高靈敏度，起到佐證作用，降低漏診率，對于不典型的脊柱結(jié)核和靜止期的脊柱結(jié)核的診斷更有必要。

總之，從病原學(xué)角度，基因診斷可以應(yīng)用于各種已知基因序列的微生物的檢測，隨著MTB基因組測序的完成，基因診斷技術(shù)在臨床中已被越來越多的工作人員熟知與認可，其在病原體檢測、藥物選擇和療效評估等方面具有重要作用，預(yù)測其將來會在脊柱結(jié)核的診治中發(fā)揮重要作用。

6 總結(jié)與展望

由于脊柱結(jié)核患者早期癥狀不典型，易造成漏診、誤診。目前，脊柱結(jié)核常用的診斷方法仍以臨床癥狀及影像學(xué)檢查為主，這些診斷的確立與醫(yī)師和影像技師的技術(shù)和經(jīng)驗有關(guān)。MTB培養(yǎng)是診斷結(jié)核病的 “金標(biāo)準”，但其耗時長、陽性率較低，且只在結(jié)核病專科醫(yī)院與大型綜合醫(yī)院才可進行。病理學(xué)診斷的價值高，但是無手術(shù)指征患者進行病灶穿刺活檢，對于標(biāo)本量及取材部位均有較高要求，假陰性率較高?；蛟\斷技術(shù)作為一種快速發(fā)展的新型診斷技術(shù)，其在脊柱結(jié)核的診斷中發(fā)揮越來越重要的作用。如果在病理檢測的同時進行基因檢測，則會明顯提升診斷靈敏度。隨著耐藥菌種的流行越來越嚴峻，一般抗結(jié)核治療效果較差，易引起復(fù)發(fā)，結(jié)核病的復(fù)治難度要遠高于初治難度，如果通過基因診斷技術(shù)同時對菌種和耐藥基因做出檢測，使用更加敏感的抗結(jié)核藥物，則可顯著降低患者的復(fù)治率，減少患者的經(jīng)濟負擔(dān)，使患者在經(jīng)濟和健康上獲得更多的收益。而且，隨著科技的進步及分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，基因診斷的成本和價值也會進一步優(yōu)化。