miR-223-3p調(diào)控NLRP3炎癥小體對自身免疫性葡萄膜炎大鼠M1/M2巨噬細(xì)胞極化平衡的影響△

屈如意 周夢賢 彭 媛 殷學(xué)偉 郭大東

自身免疫性葡萄膜炎是一種眼睛血管層的炎癥性非感染性疾病，可導(dǎo)致視功能嚴(yán)重受損甚至失明，占美國所有致盲疾病的10%～15%[1]。雖然皮質(zhì)類固醇是目前治療葡萄膜炎的有效方法，但嚴(yán)重的不良反應(yīng)以及副作用使其不適合長期治療[2]。因此，更好地認(rèn)識自身免疫性葡萄膜炎的發(fā)病機(jī)制可以為自身免疫性葡萄膜炎的治療提供新靶點(diǎn)。MicroRNAs (miRNAs) 是一類長度約為22 個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，可在轉(zhuǎn)錄后下調(diào)蛋白表達(dá)。miRNAs在多種疾病中低表達(dá)，其中miR-223-3p 可參與如NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NLRP3)炎癥小體、核因子κB(NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3 激酶/ 蛋白激酶(PI3K/AKT)和核糖體蛋白S6 激酶/低氧誘導(dǎo)因子-1(RPS6KB1/HIF-1α)等多種信號通路的調(diào)控影響疾病發(fā)展進(jìn)程[3]。miR-223-3p與NLRP3炎癥小體之間存在密切聯(lián)系，在多種炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病中發(fā)揮作用，但它們在自身免疫性葡萄膜炎中的作用尚不清楚。巨噬細(xì)胞在炎癥和宿主防御中發(fā)揮重要作用，執(zhí)行重要的組織特異性功能。巨噬細(xì)胞能夠響應(yīng)許多不同的刺激而改變其表型，這一過程稱為激活[4]。巨噬細(xì)胞的兩種主要表型包括經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞 (M1) 的極化促炎表型和交替活化巨噬細(xì)胞 (M2) 的極化抗炎表型[5]。巨噬細(xì)胞M1/M2極化的不平衡通常與各種疾病或炎癥狀況有關(guān)[6]。影響巨噬細(xì)胞極化動態(tài)變化的因素很多，主要受體內(nèi)微環(huán)境的影響。近年的研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體也可以通過介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化來促進(jìn)炎癥的進(jìn)程。本研究擬通過探討miR-223-3p調(diào)控NLRP3炎癥小體對巨噬細(xì)胞極化的影響來闡釋葡萄膜炎發(fā)生過程中巨噬細(xì)胞極化的變化規(guī)律，為臨床設(shè)計(jì)以巨噬細(xì)胞為干預(yù)靶點(diǎn)治療炎癥性疾病的治療策略提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器光感受器間維生素A結(jié)合蛋白(IRBP)(上海生工公司);結(jié)核分枝桿菌(TB)(Difco公司，美國);完全弗式佐劑(CFA)(Sigma公司，美國); miR-223-3p慢病毒(吉滿生物科技，上海)；高純度質(zhì)粒抽提試劑盒(TIANGEN，北京)；報(bào)告基因檢測試劑盒(吉滿生物科技,上海);大鼠組織單核細(xì)胞分離液試劑盒(Solarbio公司，北京)；藻紅蛋白(PE)CD86(eBioscience公司，美國)；PE-CD206(圣克魯斯生物技術(shù)有限公司，上海)；BCA蛋白定量試劑盒(碧云天公司，上海),NLRP3、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素10(IL-10)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(江萊生物技術(shù)有限公司，上海)；RNA提取試劑盒(思科捷公司，濟(jì)南);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(諾唯贊生物科技股份有限公司，南京);LightCycler 480實(shí)時熒光定量PCR(Q-PCR)儀(Roche公司，美國); 多功能酶標(biāo)儀(Perkin-Elmer公司，美國);流式細(xì)胞儀(BD FACSVerseTM流式細(xì)胞儀,美國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物分組及處理將48只健康Lewis雌性大鼠(鼠齡6～8周，體重160～180 g，Charles River維通利華公司，北京)隨機(jī)分為正常對照(NC)組、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)組和miR-223-3p慢病毒組，每組16只。EAU組和miR-223-3p慢病毒組大鼠腹部兩側(cè)、頸背部、兩足底分別注射200 μL含IRBP、CFA和TB的乳糜液以誘導(dǎo)EAU模型，NC組大鼠在相同部位注射200 μL只含CFA、TB的混合液(無IRBP多肽)，miR-223-3p慢病毒組大鼠雙眼玻璃體內(nèi)分別注射8 μL攜帶miR-223-3p的慢病毒。大鼠飼養(yǎng)于 24 ℃、相對濕度60%的環(huán)境中，并保持充足的食物和水，12 d后取材。

1.3 雙熒光素酶表達(dá)報(bào)告系統(tǒng)檢測miR-223-3p調(diào)控NLRP3基因根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測miR-223-3p與NLRP3基因的結(jié)合位點(diǎn)的信息，將NLRP3基因的3’UTR序列及其突變體克隆到雙熒光素酶報(bào)告基因載體中，構(gòu)建野生型(WT)及突變型(MT)重組雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒載體，采用PCR及基因測序方法鑒定載體是否構(gòu)建成功。將構(gòu)建好的野生型和突變型重組雙熒光素酶報(bào)告載體，通過mimic(miR過表達(dá))+NLRP3野生型，mimics NC(miR過表達(dá)陰性對照)+NLRP3野生型， mimic+NLRP3突變型，mimics NC+NLRP3突變型進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后48 h以空白細(xì)胞裂解液為對照，觀察報(bào)告基因相對熒光值(RLU)變化，明確miR-223-3p對NLRP3的調(diào)控作用。

1.4 Q-PCR檢測各組大鼠眼、脾臟和淋巴結(jié)組織中miR-223-3p、NLRP3、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和精氨酸酶-1的基因表達(dá)水平造模12 d后，分別取各組大鼠的眼、脾臟和淋巴結(jié)組織，經(jīng)RNA提取和反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行Q-PCR檢測。U6為miR-223-3p的內(nèi)參，GAPDH為NLRP3、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和精氨酸酶-1(Arg-1)的內(nèi)參。U6反轉(zhuǎn)錄引物序列為5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’，miR-223-3p反轉(zhuǎn)錄引物序列為5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGGG-TA-3’。U6上游引物序列：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游引物序列：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’;miR-223-3p上游引物序列：5’-GCGCGTGTCAGTTTGTCAAA-3’，下游引物序列：5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’：GAPDH上游引物序列：5’-CACGGCAAGTTCAACGGCACAGT-3’，下游引物序列：5’-AGCGGAAGGGGCGGAGATGAT-3’：NLRP3上游引物序列：5’-TCTTTGCGGCTATGTACTATCTGC-3，下游引物序列:5’-CTTCTTGGCCTTGGCTTTCACTTC-3’;iNOS上游引物序列:5’-CTTCCGGGCAGCCTGTGAGACG-3’,下游引物序列：5’-ATCCCCAGGTGTTCCCCAGGTAGG-3’；Arg-1上游引物序列：5’-CGGCTTGCGAGATGTGG-3’，下游引物序列：5’-TAGCCGGGGTGAATACTGG-3’。Q-PCR反應(yīng)條件設(shè)置為：95 ℃、5 min,反應(yīng)循環(huán)1次；95 ℃、20 s,57 ℃、25 s,60 ℃、25 s,循環(huán)45次。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)擴(kuò)增3次。Q-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，以NC組為對照(1.00±0.00),通過E=2-ΔΔCt計(jì)算mRNA的相對表達(dá)水平。

1.5 ELISA檢測各組大鼠眼、脾臟和淋巴結(jié)組織中NLRP3、TNF-α、IL-10的蛋白表達(dá)水平造模12 d后，取各組大鼠眼、脾臟和淋巴結(jié)組織，用組織剪剪碎并在液氮條件下研磨成粉末后，根據(jù)組織的重量，加入350～800 μL的RIPA裂解液和苯甲基磺酰氟(PMSF)混合液(RIPAPMSF=1001)使蛋白溶解，然后組織勻漿機(jī)低溫條件下研磨5 min使蛋白充分裂解,超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)超聲10 min,8000 r·min-1離心10 min去除泡沫,收集上清液即可得到所需蛋白樣品。BCA法檢測各組大鼠以上各組織樣品的蛋白濃度，ELISA試劑盒分別檢測各組大鼠眼、脾臟和淋巴結(jié)組織中NLRP3、TNF-α、IL-10的蛋白表達(dá)水平。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組大鼠眼、脾臟和淋巴結(jié)組織中M1、M2巨噬細(xì)胞極化水平造模12 d后，分別取各組大鼠的眼、脾臟和淋巴結(jié)組織，用1640細(xì)胞培養(yǎng)基充分研磨，經(jīng)過濾、離心、分離后得到所需單核細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至6孔板，每孔加15 μL雙抗，放入37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育4 h，胰蛋白酶消化后得到貼壁細(xì)胞(單核細(xì)胞)。首先用FITC-F4/80和APC-CD11b抗體進(jìn)行細(xì)胞表面染色30 min，將細(xì)胞固定破膜1 h后，然后用PE-CD206和PE-CD86進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，流式清洗劑清洗細(xì)胞后離心，去上清，最后加入500 μL PBS將細(xì)胞重懸，經(jīng)濾網(wǎng)過濾后將得到的細(xì)胞懸液置于流式管中，然后用流式細(xì)胞儀檢測各組織中M1、M2型巨噬細(xì)胞極化水平及M1/M2巨噬細(xì)胞比例變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)均用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組內(nèi)比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異(LSD-t)檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 雙熒光素酶基因檢測報(bào)告與NC組相比，WT組miR-233-3p對NLRP3基因野生型有較明顯的下調(diào)表達(dá)(P<0.01)，但MT組對預(yù)測的靶基因位點(diǎn)進(jìn)行突變后，突變型載體中的RLU值表達(dá)水平與NC組相比未發(fā)生顯著改變(P>0.05)(圖1)。因此，miR-223-3p可明顯調(diào)控帶有NLRP3基因片段 3’UTR 基因的表達(dá)，NLRP3為miR-223-3p調(diào)控的靶基因。

圖1 各組miR-223-3p與質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞后NLRP3表達(dá)水平

2.2 各組大鼠眼、脾臟和淋巴結(jié)組織中miR-223-3p、NLRP3、Arg-1和iNOS的mRNA表達(dá)水平Q-PCR檢測結(jié)果顯示，與NC組(均為1.00±0.00)相比，造模12 d后，EAU組大鼠眼、脾臟和淋巴結(jié)組織中miR-223-3p表達(dá)水平均顯著降低，而NLRP3和iNOS的mRNA表達(dá)水平均顯著升高，Arg-1的mRNA表達(dá)水平均顯著降低(均為P<0.05)。與EAU組相比，造模12 d后，miR-223-3p慢病毒組大鼠眼、脾臟和淋巴結(jié)組織中NLRP3和iNOS的mRNA表達(dá)水平均降低，而Arg-1的mRNA表達(dá)水平均升高(均為P<0.05)(見表1)。

2.3 各組大鼠眼、脾臟和淋巴結(jié)組織中NLRP3、TNF-α、IL-10的蛋白表達(dá)水平ELISA檢測結(jié)果顯示，與NC組相比，造模12 d后,EAU組大鼠眼、脾臟和淋巴結(jié)組織中TNF-α和NLRP3的蛋白表達(dá)水平均升高，而IL-10的蛋白表達(dá)水平均降低(均為P<0.05);與EAU組相比，造模12 d后，miR-223-3p慢病毒組大鼠眼、脾臟和淋巴結(jié)組織中TNF-α和NLRP3的蛋白表達(dá)水平均降低，而IL-10的蛋白表達(dá)水平均明顯升高(均為P<0.05)(見表2)。

表1 造模12 d后各組大鼠眼、脾臟和淋巴結(jié)組織中miR-223-3p、NLRP3、Arg-1和iNOS 的mRNA表達(dá)

表2 造模12 d后各組大鼠眼、脾臟和淋巴結(jié)組織中IL-10、TNF-α和NLRP3的蛋白表達(dá)

2.4 各組大鼠眼、脾臟和淋巴結(jié)組織中M1、M2型巨噬細(xì)胞極化水平流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示(見圖2、圖3、表3)，與NC組相比，造模12 d后，EAU組大鼠眼、脾臟和淋巴結(jié)組織中M1型巨噬細(xì)胞極化水平均顯著升高，而M2型巨噬細(xì)胞極化水平則均降低，M1/M2巨噬細(xì)胞比例均升高(均為P<0.05);與EAU組相比，造模12 d后，miR-223-3p慢病毒組大鼠眼、脾臟和淋巴結(jié)組織中M1型巨噬細(xì)胞極化水平均降低，而M2型巨噬細(xì)胞極化水平均升高，M1/M2型巨噬細(xì)胞比例均恢復(fù)平衡(均為P<0.05)。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測各組大鼠眼、脾臟和淋巴結(jié)組織中M1型巨噬細(xì)胞水平變化 A：右上象限為F4/80+CD11b+細(xì)胞；B:右上象限為F4/80+CD11b+CD86+巨噬細(xì)胞(M1型巨噬細(xì)胞)。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測各組大鼠眼、脾臟和淋巴結(jié)組織中M2型巨噬細(xì)胞水平變化 A:右上象限為F4/80+CD11b+細(xì)胞；B:右上象限為F4/80+CD11b+CD206+巨噬細(xì)胞(M2型巨噬細(xì)胞)。

表3 各組大鼠眼、脾臟和淋巴結(jié)組織中M1和M2型巨噬細(xì)胞水平以及M1/M2巨噬細(xì)胞比例變化

3 討論

葡萄膜炎是臨床常見、嚴(yán)重危害眼健康的常見疾病，眼睛血管層的炎癥是葡萄膜炎最常見的病理學(xué)表現(xiàn)。最近，miRNAs 在自身免疫性疾病和炎癥性疾病中的作用越來越受到關(guān)注[7]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-223-3p與多種炎癥和免疫反應(yīng)有關(guān)，可作為評估盆腔炎和阿爾茨海默病疾病嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物[8-9]。MiR-223-3p在巨噬細(xì)胞、血小板、肝細(xì)胞和心肌細(xì)胞等多種細(xì)胞中表達(dá)，并通過多個靶向基因調(diào)節(jié)細(xì)胞活動[3]，在多種疾病發(fā)病期間的炎癥或免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。已知miR-223-3p參與調(diào)節(jié)多個關(guān)鍵信號通路，如NLRP3炎癥小體、NF-κB、MAPK、PI3K/AKT、RPS6KB1/HIF-1α信號通路。NLRP3炎癥小體是一種細(xì)胞溶質(zhì)蛋白復(fù)合物，由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)和caspase-1組成[10]，作為固有免疫的組分在免疫防御中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)[11],miR-223-3p與NLRP3 的 3’非翻譯區(qū)片段相互作用并抑制其表達(dá),與多種自身炎癥性疾病有關(guān)，這與我們的雙熒光素酶表達(dá)報(bào)告系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。miR-223-3p通過負(fù)調(diào)節(jié)急性和慢性肝損傷中NLRP3炎癥小體的水平，使單核細(xì)胞、早期活化的巨噬細(xì)胞的浸潤減少，從而防止炎癥的發(fā)生[12]。在一項(xiàng)動物研究中[13]，miR-223-3p 抑制 NLRP3 炎癥小體的表達(dá)，促進(jìn)樹突狀細(xì)胞向耐受性樹突狀細(xì)胞極化并可以防止小鼠發(fā)生自身免疫性心肌炎。因此我們推測，miR-223-3p調(diào)控NLRP3炎癥小體可能與葡萄膜炎的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本研究通過建立大鼠EAU模型發(fā)現(xiàn)造模12 d后，與NC組相比，EAU組大鼠體內(nèi)miR-223-3p基因表達(dá)水平顯著降低，而NLRP3的mRNA和蛋白表達(dá)水平升高，與FAU組相比，miR-223-3p慢病毒組NLRP3的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低，提示miR-223-3p可以負(fù)向調(diào)控NLRP3炎癥小體的表達(dá)從而影響葡萄膜炎炎癥進(jìn)程，與既往研究結(jié)果相符。

巨噬細(xì)胞是組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)和炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵細(xì)胞，執(zhí)行重要的組織特異性功能[14]。巨噬細(xì)胞根據(jù)其所處環(huán)境表現(xiàn)出不同的表型，兩種主要的表型包括M1 極化促炎表型和M2 極化抗炎表型。巨噬細(xì)胞的典型M1型是由脂多糖(LPS)、C反應(yīng)蛋白(CRP)以及Th1型細(xì)胞因子引起的[15]。而巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、Th2型細(xì)胞因子能夠使巨噬細(xì)胞向替代途徑M2型極化[15]。M1型巨噬細(xì)胞的特點(diǎn)是能夠分泌CD86、TNF-α、iNOS和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)等促炎因子來介導(dǎo)急性炎癥反應(yīng)[16]。隨著炎癥的發(fā)展，M2型巨噬細(xì)胞分泌IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)等抗炎介質(zhì)來對抗炎癥、促進(jìn)組織修復(fù)和血管生成，其特征在于CD206標(biāo)記的表達(dá)和Arg-1的產(chǎn)生[16-18]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體也可以通過介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化來促進(jìn)炎癥的進(jìn)程。有研究表明，氧化三甲胺(TMAO)通過NLRP3炎癥小體的激活來增強(qiáng)M1型巨噬細(xì)胞的極化[19]。為了驗(yàn)證EAU模型中NLRP3炎癥小體對巨噬細(xì)胞極化的影響，本實(shí)驗(yàn)從mRNA、蛋白、細(xì)胞三個層面展開了研究發(fā)現(xiàn)，與NC組相比,造模后12 d的EAU大鼠各組織iNOS mRNA、 TNF-α蛋白和巨噬細(xì)胞表面CD86的表達(dá)水平升高，而Arg-1 mRNA、IL-10蛋白和巨噬細(xì)胞表面CD206的表達(dá)水平降低。MiR-223-3p慢病毒組NLRP3炎癥小體表達(dá)水平降低從而逆轉(zhuǎn)以上炎癥性相關(guān)因子的表達(dá)水平，恢復(fù)M1/M2巨噬細(xì)胞極化平衡，提示NLRP3 炎癥小體可能誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞的極化，并增加促炎細(xì)胞因子的分泌來影響葡萄膜炎的發(fā)展進(jìn)程。與本研究機(jī)制相似的是，Zhang等[20]發(fā)現(xiàn)，在牙周組織中，正畸力刺激的人牙周韌帶細(xì)胞通過激活M1型巨噬細(xì)胞中的NLRP3炎癥小體可促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞極化，增加IL-1β的產(chǎn)生，從而啟動RR(牙根吸收)的發(fā)生。Ye等[21]發(fā)現(xiàn)，在大腦中動脈栓塞模型中用MCC950(NLRP3 炎癥小體的選擇性抑制劑)治療3 d后，巨噬細(xì)胞從促炎M1型轉(zhuǎn)化為組織修復(fù)抗炎M2型。另外IL-37也可以抑制M1型巨噬細(xì)胞中的NLRP3炎癥小體的激活，將巨噬細(xì)胞的極化從促炎M1型轉(zhuǎn)移到有益的抗炎M2型，從而治療顳下頜關(guān)節(jié)炎癥[22]，與本研究結(jié)果一致，說明NLRP3炎癥小體成分的激活對M1型巨噬細(xì)胞極化有很大的促進(jìn)作用。

本研究首先通過雙熒光素酶檢測證實(shí)了NLRP3是miR-223-3p調(diào)控的靶基因，并且與NC組相比，EAU組大鼠 miR-223-3p 基因表達(dá)水平降低，與NLRP3 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，說明miR-223-3p可以通過負(fù)調(diào)控NLRP3影響炎癥進(jìn)程。其次，EAU組大鼠M1/M2比例失衡(升高)，推測可能與NLRP3的表達(dá)密切相關(guān)。因此，我們向EAU大鼠玻璃體內(nèi)注射miR-223-3p慢病毒，通過提高EAU大鼠體內(nèi)miR-223-3p的表達(dá)水平來抑制NLRP3炎癥小體的激活，發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞極化水平和抗炎因子表達(dá)升高從而減輕炎癥反應(yīng)達(dá)到治療葡萄膜炎的作用?？傊?，提高miR-223-3p的表達(dá)水平可降低NLRP3炎癥小體的表達(dá)并使相關(guān)炎癥信號通路受到抑制，可能是開發(fā)自身免疫性葡萄膜炎新型治療的策略之一。