2018-2020年云南省邊境地區(qū)豬群PRRSV抗體檢測(cè)與分析

謝佳芮，寇美玲，李 樂(lè)，苗海生

(云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

鑒于云南省緊鄰東南亞國(guó)家，邊境線上有多個(gè)通往內(nèi)地的口岸和多條販賣(mài)走私家畜的非法通道，受到利益驅(qū)使，我國(guó)邊境很多不法分子以走私動(dòng)物為盈，包括活體動(dòng)物、動(dòng)物產(chǎn)品等。這些行為，不僅偷逃國(guó)家稅款、擾亂市場(chǎng)秩序，而且所走私的動(dòng)物也有可能來(lái)自疫區(qū)，給我國(guó)畜禽養(yǎng)殖、公共衛(wèi)生安全帶來(lái)了極大的影響。東南亞國(guó)家獸醫(yī)防控體系不完全，防控意識(shí)與水平薄弱，特殊的氣候條件和地理環(huán)境，導(dǎo)致動(dòng)物疫情發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較大，疫情防控形勢(shì)嚴(yán)峻。為了解邊境地區(qū)豬群PRRSV抗體水平，本試驗(yàn)于2018-2020年在邊境14個(gè)地區(qū)采集了2 900份豬血清樣品，進(jìn)行了PRRSV抗體檢測(cè)分析，對(duì)PRRSV抗體有計(jì)劃的進(jìn)行監(jiān)測(cè),準(zhǔn)確掌握邊境地區(qū)PRRSV的流行動(dòng)態(tài),了解邊境地區(qū)豬群的免疫狀態(tài),對(duì)降低PRRSV風(fēng)險(xiǎn)有重要意義，以期為云南省PRRS的免疫防控提供流行病學(xué)數(shù)據(jù)，為相關(guān)的防控政策的研究與制定提供資料。

1 材料與方法

1.1 監(jiān)測(cè)點(diǎn)選擇

豬血清樣品連續(xù)3年隨機(jī)采自云南省富寧、勐臘、隴川、勐海、滄源、耿馬、鎮(zhèn)康、盈江、瀾滄、景洪、孟連、瑞麗、芒市、祿豐14個(gè)邊境縣的218個(gè)散養(yǎng)戶、43個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)、29個(gè)屠宰場(chǎng)、33個(gè)交易市場(chǎng)、3個(gè)填埋場(chǎng)。

1.2 樣品采集及抽樣原則

每個(gè)采樣點(diǎn)利用無(wú)菌技術(shù)采集豬前腔靜脈血3～5 mL，析出血清于滅菌離心管內(nèi)，分別編號(hào)。對(duì)存欄量大于10頭的養(yǎng)殖戶，按照估計(jì)流行率方法采樣：95%置信水平、10%預(yù)期流行率、5%可接受誤差；對(duì)于存欄少于10頭的養(yǎng)殖戶，全群采樣。由當(dāng)?shù)乜h級(jí)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心負(fù)責(zé)樣本采集，登記各區(qū)縣樣本數(shù)量以及樣本來(lái)源、采樣情況。其中，富寧縣采集樣品200份，勐臘縣500份，勐海縣200份，孟連縣300份，滄源縣235份，鎮(zhèn)康縣230份，耿馬縣235份，芒市100份，瑞麗市100份，盈江縣100份，隴川縣200份，瀾滄縣100份，景洪市300份，祿豐縣100份(表1)。

表1 2018-2020年各地區(qū)豬血清樣品采集數(shù)量統(tǒng)計(jì) 份，個(gè)

1.3 檢測(cè)方法與判斷標(biāo)準(zhǔn)

采用云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院自行研制的PRRSV ELISA抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。取出試劑盒提供的96孔ELISA板，每孔加入46 μL稀釋液，4 μL待檢血清，對(duì)照樣品不加稀釋液。震蕩混勻；37℃溫育1 h。PBST洗液洗板5次，拍干；每孔加入50 μL羊抗豬酶標(biāo)二抗，37℃溫育30 min，用PBST洗液洗板5次，拍干；每孔加入100 μL底物反應(yīng)液，37℃避光溫育10～15 min，再加入100 μL終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下讀取結(jié)果。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照平均OD值≥1，陰性對(duì)照平均OD值≤0.2，試驗(yàn)結(jié)果成立。檢測(cè)儀器使用BioTek ELX-800酶標(biāo)儀;AquaMax2000洗板機(jī)，購(gòu)自Molecular Devices公司。按照以下公式進(jìn)行結(jié)果判定：樣品S/P值≤0.4，判為PRRSV抗體陰性;S/P值≥0.4，判為PRRSV抗體陽(yáng)性。S/P=。PC：陽(yáng)性對(duì)照OD值；NCA450：陰性對(duì)照OD值。采用IBM SPSS Statistics22軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分析抗體的S/P平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、陽(yáng)性率，用變異系數(shù)來(lái)表示各類別豬群的抗體的離散度，其中變異系數(shù)=(標(biāo)準(zhǔn)差÷S/P平均值)×100%，用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)間顯著性分析，用Excel2007軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。根據(jù)樣品的背景記錄，最后對(duì)檢測(cè)的樣品區(qū)分采樣地區(qū)，采樣豬群的類別，采樣季度，以及采樣的場(chǎng)點(diǎn)來(lái)分類進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 邊境地區(qū)豬群PRRSV抗體時(shí)間分布情況

以年份統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表2)表明：2018—2020年，共檢測(cè)樣品2900份，檢出抗體陽(yáng)性2179份，2018—2020年平均抗體陽(yáng)性率為75.14%(2179/2900)，各年的抗體陽(yáng)性率分別為70.63%(986/1396)，73.81%(372/504)、82.1%(821/1000)。抗體陽(yáng)性率都高于國(guó)家規(guī)定的PRRSV抗體水平標(biāo)準(zhǔn)(70%)，把能夠達(dá)到國(guó)家規(guī)定的抗體水平標(biāo)準(zhǔn)(70%)定義為抗體合格率，且各年間無(wú)顯著差異(P>0.05)。以季度統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表3)表明：不同季度的PRRSV抗體陽(yáng)性率均達(dá)到抗體合格率水平，且季度間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表2 不同年份PRRSV抗體檢測(cè)結(jié)果 份，%

表3 豬群不同采樣季度PRRSV抗體平均陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì) %

2.2 邊境地區(qū)豬群PRRSV抗體地域分布情況

各縣(市、區(qū))豬群抗體陽(yáng)性率在 50%～90%之間(表4)，并且地區(qū)間差異極顯著(P<0.01)，其中抗體陽(yáng)性率最高為孟連91.33%(274/300)。檢測(cè)結(jié)果顯示PRRSV在云南邊境地區(qū)存在地域分布差異,且地區(qū)間差異較大。PRRSV抗體平均陽(yáng)性率為75.14%(2179/2900)，S/P平均值為1.0510±0.7484，變異系數(shù)為70.77%，變異系數(shù)最高的為芒市158.1%，最低的盈江47.33%。滄源和富寧、勐臘、瀾滄、隴川、勐海、孟連、盈江、祿豐這8個(gè)地區(qū)差異顯著(P<0.05)，隴川和富寧、勐臘、瀾滄、勐海、鎮(zhèn)康、孟連、盈江、祿豐這8個(gè)地區(qū)差異不顯著(P>0.05)。

表4 2018-2020年各地區(qū)豬PRRSV抗體檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì) 份，%

境內(nèi)豬群和入境豬群PRRSV抗體統(tǒng)計(jì)表明(表5)，境內(nèi)豬群PRRSV抗體陽(yáng)性率為94.32%(1678/1779)，入境豬群PRRSV抗體陽(yáng)性率為44.69%(501/1121)，利用SSPS軟件進(jìn)行兩組陽(yáng)性率數(shù)據(jù)無(wú)重復(fù)雙因素方差分析，得出P<0.01,兩組數(shù)據(jù)差異極顯著。

表5 境內(nèi)豬群和入境豬群PRRSV抗體統(tǒng)計(jì) 份，%

按照采樣場(chǎng)點(diǎn)分類統(tǒng)計(jì)(表6)，來(lái)自交易市場(chǎng)、屠宰場(chǎng)以及養(yǎng)殖場(chǎng)的豬群抗體陽(yáng)性率都在75%以上，散養(yǎng)戶豬群抗體陽(yáng)性率為60.29%(287/476)，散養(yǎng)戶、填埋場(chǎng)的豬群抗體陽(yáng)性率與其他場(chǎng)點(diǎn)相比差異極顯著(P<0.01)。

表6 同采樣場(chǎng)點(diǎn)的豬群PRRSV抗體統(tǒng)計(jì)

2.3 不同生產(chǎn)階段豬群PRRSV抗體情況

哺乳仔豬的抗體陽(yáng)性率最低為48.14%(297/617)。S/P值最高的是種豬(1.7248±0.1879)，S/P值最低為哺乳仔豬(1.0133±0.3373)。哺乳仔豬的變異系數(shù)最高(90.1%)、種豬的變異系數(shù)最低(49.85%)。不同豬群之間PRRSV平均抗體水平存在差異，種豬和哺乳仔豬、保育豬、育肥豬差異顯著(P<0.05)；保育豬和哺乳仔豬差異不顯著(P>0.05),見(jiàn)表7。

表7 2018-2020年不同類別豬群PRRSV抗體陽(yáng)性統(tǒng)計(jì) 份，%

3 討論

3.1 邊境地區(qū)豬群免疫效果評(píng)價(jià)

邊境地區(qū)14個(gè)縣(市、區(qū))豬群PRRSV抗體陽(yáng)性率在50%～90%之間，PRRSV平均抗體陽(yáng)性率為75.14%(2179/2900)，孟連、景洪、祿豐、鎮(zhèn)康、瑞麗、瀾滄、耿馬、芒市、盈江、隴川、滄源各地豬群的PRRSV 抗體陽(yáng)性率都高于國(guó)家規(guī)定的抗體水平標(biāo)準(zhǔn)(70%)，能夠達(dá)到控制PRRSV疫情所達(dá)到的抗體水平(90%以上)有孟連。瀾滄、盈江的豬群的變異系數(shù)均≤50%，說(shuō)明抗體整齊度高，免疫狀況良好。其他地區(qū)的變異系數(shù)均大于60%，對(duì)抗體整齊度不高，抗體陰性豬只多的地區(qū)還需要進(jìn)行補(bǔ)免。2015年譚銳等檢測(cè)到云南部分地區(qū)的PRRSV免疫抗體陽(yáng)性率為69.6%。2013年至2015年，胡忠燕等對(duì)景洪市進(jìn)行PRRSV抗體檢測(cè)的平均陽(yáng)性率為64.12%。2016年曾夢(mèng)穎等對(duì)云南玉溪、曲靖、楚雄三地的血清樣品中檢測(cè)出PRRSV免疫抗體平均陽(yáng)性率為47.85%。2017年朱麗等對(duì)云南多地的PRRSV抗體進(jìn)行調(diào)查，除了麗江市以外，其他地區(qū)抗體平均陽(yáng)性率都不低于70.00%。綜合以上結(jié)果說(shuō)明，近幾年云南的PRRSV抗體陽(yáng)性率呈逐年遞增趨勢(shì)。云南邊境地區(qū)整體的PRRSV抗體變異系數(shù)為70.77%，變異系數(shù)越大，說(shuō)明抗體水平不整齊，地區(qū)間抗體水平差異變大的原因有很多，常見(jiàn)的直接原因可能有：疫苗的注射和保存操作不當(dāng)，使用的疫苗品牌參差不齊，質(zhì)量不統(tǒng)一，不同地區(qū)采集的血清樣本數(shù)本身具有差異，所得結(jié)果在一定程度上具有主觀性，并不能完全客觀的反應(yīng)各地PRRSV免疫效果的真實(shí)情況等；間接原因常為：母源抗體干擾、免疫抑制疾病的感染、飼養(yǎng)管理不當(dāng)、免疫程序制定不合理、動(dòng)物來(lái)源途徑復(fù)雜等。

3.2 各類別豬群抗體的差異

各生產(chǎn)階段豬群的PRRSV 抗體水平存在差異?？贵w水平最高的是育肥豬87.30%(949/1087)和種豬79.92%(426/533)，抗體陽(yáng)性率較低的為哺乳仔豬48.14%(297/617)和保育豬76.47%(507/663)。根據(jù)以上數(shù)據(jù)分析原因，哺乳仔豬和保育豬抗體陽(yáng)性率低，首先可以認(rèn)為仔豬斷奶，母源抗體水平下降；同時(shí)給仔豬轉(zhuǎn)至保育圈舍時(shí)，斷奶和環(huán)境改變?nèi)菀桩a(chǎn)生應(yīng)激性，使抗體水平下降。

通過(guò)監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，邊境地區(qū)PRRSV豬群抗體水平呈逐年升高的態(tài)勢(shì)，同時(shí)對(duì)比境外走私的豬群抗體和境內(nèi)養(yǎng)殖的豬群抗體水平，發(fā)現(xiàn)兩種來(lái)源的豬群PRRSV抗體水平差異顯著，我國(guó)境內(nèi)養(yǎng)殖的豬群抗體水平均在90%以上，而境外走私豬群抗體水平低于50%。由于外來(lái)豬群免疫背景不明確，試驗(yàn)數(shù)據(jù)在一定程度上只能說(shuō)明境外走私入境的豬群免疫情況不容樂(lè)觀，有可能存在入境豬群注射過(guò)PRRSV疫苗,但疫苗品質(zhì)未可知，造成抗體保護(hù)率偏低；如果從未注射過(guò)疫苗,說(shuō)明存在野毒感染抗體,可能入境的豬群已經(jīng)存在PRRSV野毒感染,應(yīng)該淘汰。境內(nèi)豬群PRRSV抗體水平的持續(xù)提升，結(jié)合數(shù)據(jù)分析原因，可能是由于非洲豬瘟在我國(guó)大肆流行，經(jīng)過(guò)非洲豬瘟疫情的影響，以及國(guó)家防疫政策的及時(shí)實(shí)施，使得生豬養(yǎng)殖主體生物安全意識(shí)大幅提高、更加重視疫病防控和飼養(yǎng)管理，嚴(yán)格執(zhí)行了各項(xiàng)免疫程序，并在各關(guān)卡、各道路、各區(qū)域嚴(yán)格執(zhí)行了消毒、隔離等工作。本研究采樣點(diǎn)位于云南省邊境地區(qū)，這些地區(qū)主要與緬甸、老撾、越南相鄰，鑒于邊境地區(qū)的特殊性，邊民之間相互交易不可避免，這些國(guó)家的豬肉制品，經(jīng)常在農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)銷(xiāo)售, 豬群又常在邊境兩側(cè)相鄰牧場(chǎng)上交叉放牧或混群放牧，加之經(jīng)常有境外走私的豬群流入我國(guó)境內(nèi)，在這種情況下，動(dòng)物疫病可能傳染頻繁，使得邊境地區(qū)PRRSV抗體水平差異大，同時(shí)境外豬群非法入境頻繁內(nèi)調(diào)，將造成我國(guó)內(nèi)地PRRSV的擴(kuò)散。這不僅使國(guó)內(nèi)重大動(dòng)物疫病防控形勢(shì)嚴(yán)峻，而且還涉及毒品殘留，食品衛(wèi)生安全等問(wèn)題。

比較不同場(chǎng)點(diǎn)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，養(yǎng)殖場(chǎng)、屠宰場(chǎng)和交易市場(chǎng)的抗體陽(yáng)性率均在75%以上，說(shuō)明邊境地區(qū)疫病防控監(jiān)督工作扎實(shí)，動(dòng)物疫病防控人員積極督促養(yǎng)殖主體提升防疫水平，提高該病防控能力，使得豬群頻繁匯集的地區(qū)，抗體水平能有效的防止疫情的發(fā)生。

4 結(jié)論和建議

本研究通過(guò)隨機(jī)抽樣方法，在云南邊境14縣(市、區(qū))，抽取2900份豬血清樣品進(jìn)行PRRSV血清學(xué)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)最近幾年，邊境地區(qū)豬群PRRSV抗體陽(yáng)性率對(duì)比云南省其他地區(qū)有顯著提升，不同地區(qū)PRRSV抗體陽(yáng)性率存在差異，血清抗體陽(yáng)性率的高低同時(shí)受到某些地區(qū)入境動(dòng)物的影響。

為了使我國(guó)的畜牧業(yè)長(zhǎng)足健康持續(xù)有效的發(fā)展，結(jié)合邊境地區(qū)的特殊情況，提升邊境地區(qū)豬群的PRRSV防疫管理，現(xiàn)提出以下建議：一是持續(xù)加強(qiáng)生物安全管控措施。具體方法為：加強(qiáng)對(duì)現(xiàn)有養(yǎng)殖場(chǎng)、屠宰場(chǎng)，牲畜交易市場(chǎng)嚴(yán)格管理的措施，加強(qiáng)豬群的免疫和檢疫工作，隔離外來(lái)動(dòng)物，加強(qiáng)生物安全措施、疫苗免疫接種，提高PRRSV的免疫密度和抗體水平。二是制定嚴(yán)格的消毒措施，從根本上消滅病原、切斷一切傳播途徑和保護(hù)易感動(dòng)物，嚴(yán)控邊境地區(qū)易感動(dòng)物的無(wú)序流動(dòng)，降低境外動(dòng)物對(duì)國(guó)內(nèi)家畜的威脅。三是加大推廣PRRSV滅活疫苗的應(yīng)用。鑒于疫苗免疫并不能完全控制疫情發(fā)生，而PRRSV減毒活疫苗長(zhǎng)期大量頻率的使用，給PRRSV自然重組創(chuàng)造了更加便利的條件和機(jī)會(huì)，疫苗的使用需要專業(yè)技術(shù)人員的指導(dǎo)，邊境地區(qū)技術(shù)人才缺乏，存在疫苗使用不規(guī)范、頻繁無(wú)序現(xiàn)象，從而導(dǎo)致該病復(fù)雜程度隨毒株增多而加劇疫情的發(fā)生。因此，PRRSV滅活疫苗在邊境地區(qū)的使用還是優(yōu)于減毒活疫苗，且沒(méi)有擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)能抑制患病豬只肺部病變，在較長(zhǎng)的一段時(shí)間使得機(jī)體不斷的產(chǎn)生抗體，所以今后應(yīng)考慮在基層加大推廣應(yīng)用。四是加強(qiáng)對(duì)哺乳仔豬和保育豬群的防控。最后，邊境地區(qū)的防控工作，還應(yīng)按照不同區(qū)域的實(shí)際情況，分別在引種安全性、物流水平、飼養(yǎng)主體的管理水平、生物安全性上采取堅(jiān)持處理主要矛盾為主、次要矛盾為輔的防控策略。