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    反式和順式二苯乙烯苷在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)比較研究*

    2023-01-31 12:13:02柴士偉高建厙立鶴于俏龐旭韓立峰
    天津中醫(yī)藥 2023年1期
    關(guān)鍵詞:藥代內(nèi)標(biāo)精密度

    柴士偉,高建,厙立鶴,于俏,龐旭,韓立峰

    (1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,天津 300193;2.國(guó)家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心,天津 300193;3.天津市中藥化學(xué)與分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 301617)

    何首烏為蓼科植物何首烏(Polygonum multiflorum Thunb.)的干燥塊根,味苦,歸肝、心和腎經(jīng)[1]?,F(xiàn)代研究表明,2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(二苯乙烯苷,TSG)是何首烏的主要活性成分[2],中國(guó)藥典在2000年將其作為何首烏的定量指標(biāo),一直沿用至今[3]。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn):該化合物具有抗炎[4-5]、抗衰老[6]、抗氧化[7]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[8]、保肝[9-10]和抗腫瘤[11]等多種生物活性。由結(jié)構(gòu)可知,TSG具有反式和順式兩種構(gòu)型[12],反式二苯乙烯苷(trans-TSG)可以在光異構(gòu)的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖蕉揭蚁┸眨╟is-TSG)。有文獻(xiàn)報(bào)道cis-TSG可能是何首烏造成肝損傷的潛在毒性成分[13],而trans-TSG目前為止未見(jiàn)任何肝毒性報(bào)道。由于trans-/cis-TSG的結(jié)構(gòu)可以相互轉(zhuǎn)變,而體內(nèi)安全性差異顯著,因此它們是否會(huì)表現(xiàn)出不同的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)行為,值得進(jìn)一步研究。前期已有文獻(xiàn)報(bào)道trans-/cis-TSG的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù),但主要是以中藥制劑和提取物為主[14-15],而這些制劑中的其他成分可能會(huì)對(duì)trans-/cis-TSG的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)行為產(chǎn)生影響。因此,本實(shí)驗(yàn)以trans-/cis-TSG單體化合物為研究對(duì)象,建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)分析方法,考察了單次給藥后,trans-/cis-TSG在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)行為,為后續(xù)何首烏致肝損傷物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究提供參考依據(jù)。

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 12只雄性SD大鼠(200±20)g,購(gòu)自北京維通利華生物科技股份有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(京)2016-0011,實(shí)驗(yàn)已通過(guò)天津中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),倫理審批編號(hào)為T(mén)CM-LAEC2021151。

    1.2 藥品與試劑 trans-TSG(純度,HPLC面積歸一化法:99.13%),cis-TSG(純度,HPLC 面積歸一化法:100%)為實(shí)驗(yàn)室自制,虎杖苷(上海源葉生物科技有限公司,ZM0530LA14,HPLC≥98%)。色譜乙腈、色譜甲醇(Thermo Fisher Scientific,美國(guó)),色譜甲酸(Anaqua Chemicals Supply,美國(guó))。

    1.3 儀器 Acquity H-Class UPLC超高效液相色譜系統(tǒng)和Xevo TQ-S質(zhì)譜系統(tǒng)聯(lián)用儀(Waters,美國(guó));KQ-1000DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);XW-80A型渦旋混合器(上海滬西分析儀器廠);微量移液器(Eppendorf,德國(guó));Centrifuge冷凍臺(tái)式高速離心機(jī)(Eppendorf,德國(guó));BP121S型天平(Sartorius,德國(guó));Millipore純水器(Millipore,美國(guó))。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18Column(2.1 mm×50 mm,1.7 μm,Waters,美國(guó))。乙腈(A)和 0.1%甲酸水(B)作為流動(dòng)相,梯度洗脫,0~8 min,5%~45%B。柱溫設(shè)置為30℃,進(jìn)樣體積為3 μL,流速為 0.3 mL/min。

    2.2 質(zhì)譜條件 負(fù)離子模式下,儀器方法的毛細(xì)管電壓、錐孔電壓和去溶劑化溫度分別設(shè)置為2.5 kV,30 V和650℃;氮?dú)庾鳛槿ト軇怏w,流速設(shè)置為800 L/h;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式和其他關(guān)鍵參數(shù)設(shè)置如表1所示,基于Masslynx 4.1和TargetLynx軟件,同時(shí)采集和分析大鼠血漿中trans-TSG和cis-TSG的定量信息。

    表1 目標(biāo)化合物的MRM參數(shù)Tab.1 MRM parameters of the target compounds

    2.3 動(dòng)物分組和給藥 12只大鼠隨機(jī)分為兩組,trans-TSG組和cis-TSG組,每組6只。嚴(yán)格按照天津中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心管理規(guī)范飼養(yǎng),在室溫(20±5)℃,相對(duì)濕度55%~65%,通風(fēng)良好,環(huán)境安靜,定期消毒的環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)一周,期間自由飲水和飲食。分別單次給藥60 mg/kg的trans-TSG和cis-TSG[16],在給藥后按照時(shí)間點(diǎn):0,0.033,0.083,0.17,0.25,0.33,0.5,1,2,4,8,10,24 h,眼眶內(nèi)眥取血,取至預(yù)先加入 10 μL肝素鈉(100單位)的 1.5 mL離心管中,4 ℃離心 10 min(6 600×g),取上層血漿于-80℃冰箱冷凍保存。

    2.4 血漿樣本的處理 取出-80℃冰箱冷凍保存的大鼠血漿樣品各100 μL,于4℃環(huán)境下解凍,分別加入600 μL冰甲醇和10 μL的內(nèi)標(biāo)溶液,渦旋震蕩5 min,4 ℃下離心 20 min(13 200×g),取出上清,氮吹干。加入100 μL 50%的甲醇水溶液復(fù)溶,渦旋震蕩 5 min,4 ℃下離心 20 min(13 200×g),取出上清,待測(cè)。

    2.5 對(duì)照品溶液的配制 精確稱(chēng)量trans-TSG、cis-TSG和虎杖苷(內(nèi)標(biāo))各1 mg分別溶解于1 mL的甲醇溶液中得1 mg/mL的溶液,然后用甲醇分別進(jìn)行稀釋得10 μg/mL的trans-TSG、cis-TSG和虎杖苷儲(chǔ)備液。

    2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 trans-TSG、cis-TSG的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)使用DAS藥代動(dòng)力學(xué)軟件(版本1.0,中國(guó)藥理學(xué)會(huì),中國(guó))進(jìn)行計(jì)算。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入graphpad prism 8.0進(jìn)行分析,計(jì)算結(jié)果使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),相關(guān)分析采用線(xiàn)性相關(guān)與回歸分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2.7 方法學(xué)考察

    2.7.1 專(zhuān)屬性 按照“1.2.4血漿樣本的處理”項(xiàng)下的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)空白血漿(A)、空白血漿加入對(duì)照品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液(B)和血漿樣品加入內(nèi)標(biāo)溶液(C)進(jìn)行分析。分別得到空白血漿色譜圖、血漿對(duì)照品色譜圖和血漿樣品色譜圖。

    2.7.2 線(xiàn)性關(guān)系 精密吸取適量濃度為10 μg/mL的trans-TSG、cis-TSG儲(chǔ)備液,加入適量甲醇,cis-TSG 分別稀釋為 3.90,7.81,15.62,31.25,62.5,125,250,500,1 000和2 000 ng/mL一系列對(duì)照品溶液;trans-TSG 稀釋濃度為 1.95,3.90,7.81,15.62,31.25,62.5,125,250,500 和 1 000 ng/mL 一系列對(duì)照品溶液。分別吸取上述對(duì)照品溶液100 μL,氮?dú)獯蹈扇軇尤?100 μL 空白血漿,按“1.2.4 血漿樣本的處理”項(xiàng)下操作,然后進(jìn)樣分析??v坐標(biāo)表示標(biāo)準(zhǔn)品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰峰面積比值,橫坐標(biāo)表示標(biāo)準(zhǔn)品濃度,繪制回歸曲線(xiàn),計(jì)算得線(xiàn)性回歸方程。

    2.7.3 日內(nèi)和日間精密度 各取空白血漿100 μL按照“1.2.4 血漿樣本的處理”項(xiàng)下的制備方法,配制“表3”中低、中、高3個(gè)濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)品血漿樣品。日內(nèi)精密度即測(cè)定低、中、高3個(gè)濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)品血漿樣品,水平重復(fù)6次。日間精密度即連續(xù)3 d測(cè)定“日內(nèi)精密度的樣品”,根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)確定濃度。計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),并用測(cè)定濃度和已知濃度的百分比來(lái)評(píng)價(jià)準(zhǔn)確度。

    2.7.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 配制低、中、高質(zhì)量濃度的 trans-TSG(10、100和 1600 ng/mL)和 cis-TSG(5、50 和 800 ng/mL)的標(biāo)準(zhǔn)溶液,各取 100 μL,平行6份,分別加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液和100 μL空白血漿,樣品預(yù)處理后測(cè)定,所得峰面積結(jié)果記為A;另取同樣份數(shù)的空白血漿,加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液,經(jīng)樣品前處理后測(cè)定,所得峰面積結(jié)果記為B;準(zhǔn)備高、中、低3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液各100 μL,平行6份,分別加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液,氮吹干后,用100 μL 50%甲醇復(fù)溶,所得峰面積結(jié)果記為C。A/B×100%為提取回收率,A/C×100%為基質(zhì)效應(yīng)。

    2.7.5 穩(wěn)定性 按照“1.2.4血漿樣本的處理”項(xiàng)下制備方法,制備的低、中、高3個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)品血漿樣品,分別考察其穩(wěn)定性。穩(wěn)定性評(píng)價(jià)包括樣品盤(pán)內(nèi)24 h穩(wěn)定性、3次凍融循環(huán)穩(wěn)定性。

    3 結(jié)果

    3.1 方法學(xué)驗(yàn)證

    3.1.1 專(zhuān)屬性 空白血漿色譜圖(A),血漿對(duì)照品色譜圖(B),血漿樣品色譜圖(C),如圖1所示,結(jié)果表明樣品色譜峰不受溶劑和內(nèi)標(biāo)的干擾,專(zhuān)屬性良好。

    圖1 MRM模式下大鼠血漿中目標(biāo)化合物的專(zhuān)屬性色譜圖Fig.1 Specificity chromatogram of the target compounds in rat plasma with the MRM mode

    3.1.2 線(xiàn)性關(guān)系 目標(biāo)分析化合物的線(xiàn)性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線(xiàn)性范圍如表2所示。結(jié)果表明,大鼠血漿中trans-TSG在3.90~2 000 ng/mL的范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好,cis-TSG在1.95~1 000 ng/mL的范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

    表2 目標(biāo)化合物的線(xiàn)性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線(xiàn)性范圍Tab.2 Linear regression equation,correlation coefficient and linear range of the target compounds

    3.1.3 精密度和準(zhǔn)確度 trans-TSG和cis-TSG的低、中、高3個(gè)濃度的日內(nèi)精密度和日間精密度結(jié)果如表3所示,RSD值均小于12%,準(zhǔn)確度在87.3~101.2,表明所建方法的精密度和準(zhǔn)確度良好。

    表3 目標(biāo)化合物的精密度和準(zhǔn)確度Tab.3 Precision and accuracy of the target compounds

    3.1.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示,trans-TSG低、中、高3個(gè)濃度的平均回收率分別為91.7%、94.1%和92.2%;cis-TSG的低、中、高3個(gè)濃度的平均回收率分別為97.1%、90.1%和95.3%。兩者的各個(gè)濃度的平均提取回收率均大于91%,且RSD均小于4.7%,表明trans-TSG和cis-TSG的回收率較高。

    表4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)Tab.4 Recovery and matrix effect

    3.1.5 穩(wěn)定性 trans-TSG和cis-TSG在樣品盤(pán)放置24 h后以及3次凍融循環(huán)之后進(jìn)行處理的狀態(tài)下,低、中、高3個(gè)濃度的測(cè)定結(jié)果如圖表5所示,顯示出良好的穩(wěn)定性。

    表5 穩(wěn)定性考察Tab.5 Study on the stability of the target compounds

    3.2 血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn) 如圖2所示,大鼠單次灌胃60 mg/kg的trans-TSG和cis-TSG后,cis-TSG的血藥濃度高于trans-TSG。

    圖2 trans-TSG和cis-TSG的血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn)Fig.2 Plasma concentration time curves of trans-TSG and cis-TSG

    3.3 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) trans-TSG和cis-TSG藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)使用DAS藥代動(dòng)力學(xué)軟件進(jìn)行計(jì)算,符合一室模型,分析所得的藥-時(shí)曲線(xiàn)如圖2所示,藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表6所示,單次給藥trans-TSG和cis-TSG 后,cis-TSG 在大鼠體內(nèi)的 AUC0-t、AUC0-∞和Tmax均大于trans-TSG,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。cis-TSG在大鼠體內(nèi)的半衰期(T1/2)顯著大于trans-TSG(P<0.05)。而 trans-TSG 在大鼠體內(nèi)的達(dá)峰濃度(Cmax)和清除率(CLz/F)則顯著高于 cis-TSG(P<0.05)。

    表6 大鼠單次灌胃trans-TSG和cis-TSG的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(n=6)Tab.6 Pharmacokinetic parameters of trans-TSG and cis-TSG(n=6)

    4 討論

    具有順?lè)唇Y(jié)構(gòu)的化合物,在一定條件下可以實(shí)現(xiàn)相互轉(zhuǎn)化。順?lè)串悩?gòu)化過(guò)程及其機(jī)制,通常包括光異構(gòu)化[17]、熱致異構(gòu)化[18]和催化異構(gòu)化[19]。而何首烏中trans-TSG向cis-TSG的轉(zhuǎn)化屬于光致異構(gòu)化。一般來(lái)說(shuō),對(duì)于熱力學(xué)穩(wěn)定的二苯乙烯類(lèi)的反式結(jié)構(gòu),通過(guò)加熱條件是難以實(shí)現(xiàn)構(gòu)型轉(zhuǎn)換,但在光照射下,反式異構(gòu)體易轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖疆悩?gòu)體[20]。同時(shí),二苯乙烯苷是多酚類(lèi)化合物,意味著很容易發(fā)生氧化反應(yīng),因此二苯乙烯苷的降解除了可以通過(guò)光和熱的條件而引發(fā)之外,氧氣和堿性pH條件也應(yīng)該格外注意[21]。因此,本研究在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中全程避光,所配制的溶液也存放在低溫避光環(huán)境,避免了trans-TSG和cis-TSG的相互轉(zhuǎn)化。同時(shí),由于trans-TSG和cis-TSG的質(zhì)譜碎裂方式相同,因此,在提取離子流色譜圖時(shí),如果發(fā)生體內(nèi)轉(zhuǎn)化,將會(huì)同時(shí)出現(xiàn)trans-/cis-TSG的色譜峰,但在本研究中,未發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)化現(xiàn)象(圖1C)。

    單次灌胃給藥相同劑量的trans-TSG和cis-TSG后,cis-TSG在大鼠的AUC0-t大于trans-TSG,但未發(fā)現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)。trans-TSG 在大鼠體內(nèi)的 Cmax和 CLz/F 均顯著高于 cis-TSG(P<0.05),同時(shí)cis-TSG在大鼠體內(nèi)的達(dá)峰時(shí)間(Tmax)和半衰期(T1/2)均大于trans-TSG,其中T1/2約為trans-TSG的4.4 倍,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。以上結(jié)果表明,cis-TSG在大鼠體內(nèi)的暴露量高于trans-TSG,并且具有更低的清除率和較長(zhǎng)的半衰期(P<0.05),這表明cis-TSG在大鼠體內(nèi)更容易出現(xiàn)蓄積,而有研究發(fā)現(xiàn)cis-TSG可能是何首烏中潛在的肝損傷風(fēng)險(xiǎn)成分[22],這是否與cis-TSG在體內(nèi)的蓄積有關(guān),值得進(jìn)一步的研究。

    綜上所述,本研究建立了UPLC-MS/MS分析方法,研究比較了何首烏中trans-TSG和cis-TSG在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)行為,為后續(xù)trans-/cis-TSG的進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。

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