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    基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探討糖網(wǎng)明目顆粒治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的作用機(jī)制*

    2023-01-31 11:57:12王芳王譽(yù)程ODUROPatrickKwabena仝婉昱冷玲黎瑞巧王啟隆劉二偉
    天津中醫(yī)藥 2023年1期
    關(guān)鍵詞:明目靶點(diǎn)通路

    王芳,王譽(yù)程,ODURO Patrick Kwabena,仝婉昱,冷玲,2,黎瑞巧,2,王啟隆,2,劉二偉,2

    (1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院,天津 301617;2.組分中藥國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 301617)

    糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)作為糖尿病最常見的微血管病變之一,是造成糖尿病患者視力障礙的主要原因[1]。研究表明,炎癥和氧化應(yīng)激可以促進(jìn)非增殖性DR向增殖性DR的轉(zhuǎn)變[2-3],血-視網(wǎng)膜屏障(BRB)完整性的破壞會加劇視網(wǎng)膜血管生成,進(jìn)而損傷視力[4]。臨床常用的激光療法或者玻璃體內(nèi)注射血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)抗體治療[5]具有成本高昂,不良反應(yīng)多,治療時(shí)間長等局限性[6-7]。

    中藥對糖尿病血管并發(fā)癥的保護(hù)作用受到越來越多關(guān)注,為DR的防治提供了新的途徑。糖網(wǎng)明目顆粒是基于治療DR的臨床經(jīng)驗(yàn)方——密蒙花方而開發(fā)的中藥6類新藥[8-9]。密蒙花方是在長期防治DR的臨床基礎(chǔ)上,在“心腎論治早期DR”的新思路指導(dǎo)下,以益氣養(yǎng)陰、交通心腎、和血明目為組方原則,用于防治非增殖期DR的經(jīng)驗(yàn)方。臨床研究表明該方對于早期DR患者,具有改善其全身及眼睛癥狀的功效,包括提高DR患者的視力、改變視疲勞、改善眼底血管狀態(tài)等,且證實(shí)了該方臨床長期用藥的安全性[10-11]。方中黃芪益氣健脾生血,烏梅收斂生津止血,兩者共為君藥以益氣養(yǎng)陰;黃連,肉桂能引火歸源,交通心腎,為臣藥;益母草、女貞子益肝腎明目、和血化瘀共為佐藥;密蒙花清熱瀉火、養(yǎng)肝明目,又可引藥上行,為使藥[9,12]。糖網(wǎng)明目顆粒利用現(xiàn)代工藝制藥,將以預(yù)防和早期治療為主要目的參與DR治療。

    網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)理論,通過建立“藥物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)”,從多角度分析藥物治療疾病的潛在機(jī)制[13]。分子對接技術(shù)通過模擬藥物分子和靶蛋白之間的潛在連接方式,預(yù)測藥物配體和蛋白質(zhì)受體的對接模式和結(jié)合親和力,為中藥多成分、多靶點(diǎn)的藥物作用機(jī)制探索提供研究策略[14]。本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)初步探討糖網(wǎng)明目顆粒治療DR的活性成分和作用機(jī)制并通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,旨在為進(jìn)一步研究糖網(wǎng)明目顆粒治療DR的機(jī)制以及臨床應(yīng)用提供一定參考。

    1 材料與方法

    1.1 糖網(wǎng)明目顆粒的化學(xué)成分以及靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建 依據(jù)糖網(wǎng)明目顆粒所含的中藥,借助中藥系統(tǒng)藥理分析平臺(TCMSP,https://tcmsp-e.com/)查詢化學(xué)成分,按照口服生物利用度(OB)≥30%,類藥性(DL)≥0.18的條件篩選具有活性成分的化合物,并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道,補(bǔ)充含量較高、有藥理作用的活性成分納入表中。

    通過 PharmMapper服務(wù)器(http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/)對活性成分進(jìn)行模擬分子-靶蛋白對接,構(gòu)建活性成分靶點(diǎn)庫。將糖網(wǎng)明目顆?;瘜W(xué)成分的Mol2格式結(jié)構(gòu)文件,上傳至PharmMapper服務(wù)器,以活性小分子為探針,搜尋潛在藥物靶點(diǎn),進(jìn)行虛擬篩選和預(yù)測化合物生物活性,得到活性成分的靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果,根據(jù)Norm Fit值由高到低排序,選擇前10個(gè)靶點(diǎn)作為活性成分的重要靶標(biāo),導(dǎo)入 UniProt數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)中,限定物種為“人”,查詢對應(yīng)的UniProtKB編碼和基因名稱。

    1.2 DR靶基因數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建 在數(shù)據(jù)庫Disgenet(https://www.disgenet.org/)和GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)中以“Diabetic retinopathy”作為關(guān)鍵詞構(gòu)建疾病靶點(diǎn)庫。

    1.3 靶點(diǎn)篩選 繪制維恩圖(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/),對糖網(wǎng)明目顆粒的藥物靶點(diǎn)與DR靶基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配,選擇交集靶點(diǎn)作為糖網(wǎng)明目顆粒治療DR的潛在靶點(diǎn)。

    1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 使用STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/,version11.5),輸入潛在靶點(diǎn),在organism項(xiàng)設(shè)置物種為“Homo sapiens”,隱藏單獨(dú)靶點(diǎn)得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)。將PPI數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件中,利用MCODE功能篩選連接最為緊密的功能模塊。

    1.5 中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將中藥、藥物有效成分、核心靶點(diǎn)文件導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建中藥-活性成分-核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

    1.6 基因富集分析和通路注釋研究 基因本體論(GO)是注釋基因及其表達(dá)產(chǎn)物的常用方法。使用R-4.1.1,導(dǎo)入作用靶點(diǎn),引用“Stringr”“tidyr”“ggpubr”等程序包,設(shè)定閾值P≤0.05篩選具有顯著性差異的生物過程,并可視化GO富集分析結(jié)果。

    京都基因與基因組百科全書(KEGG)可對藥物作用靶點(diǎn)或差異表達(dá)基因進(jìn)行信號通路分析。將作用靶點(diǎn)導(dǎo)入 R-4.1.1,運(yùn)用“DOSE”“clusterProfiler”“pathview”等程序包進(jìn)行KEGG通路富集分析,設(shè)定閾值P≤0.05篩選具有顯著性差異的可靠靶點(diǎn)通路。

    1.7 分子對接 從RSCB PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)下載核心靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)保存為PDB格式文件,從TCMSP數(shù)據(jù)庫下載藥物活性成分的3D結(jié)構(gòu),保存為mol2格式。使用AutoDockTools 1.5.6軟件,以靶蛋白作為受體,將核心活性成分作為配體,根據(jù)靶蛋白復(fù)合物中配體的坐標(biāo)確定活性位點(diǎn),設(shè)置活性口袋,運(yùn)行AutoDock Vina進(jìn)行對接,用PyMol 2.2.0和Discovery Studio 2019進(jìn)行結(jié)果分析。

    1.8 體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

    1.8.1 藥物 糖網(wǎng)明目顆粒,實(shí)驗(yàn)使用該藥浸膏粉,3.5 g生藥/g,由北京紅太陽藥業(yè)有限公司提供,溶于無菌超純水中配制成300 mg/mL的母液。

    1.8.2 細(xì)胞 人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株Y79購自北納生物河南省工業(yè)微生物菌種工程技術(shù)研究中心(BNCC341293)。

    1.8.3 試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基,胎牛血清(FBS),青鏈霉素混合液購于美國Gibco公司;CCK8試劑盒,5×蛋白上樣緩沖液購于北京索萊寶科技有限公司;BCA蛋白定量試劑盒和SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;表皮生長因子受體(EGFR,貨號:0407-21)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)14(貨號:R1308-3)購于杭州華安生物技術(shù)有限公司;Tubulin(貨號:AC007)購于武漢愛博泰克生物科技有限公司。

    1.8.4 儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱(HF240,力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)、電泳儀(PowerPACTMHC,美國Bio-Rad公司);Amershan Imager 600凝膠成像系統(tǒng)(日本GE公司)等。

    1.8.5 細(xì)胞培養(yǎng) Y79細(xì)胞在RPMI-1640培養(yǎng)基(10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液)中,于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待培養(yǎng)瓶中細(xì)胞融合至80%~90%時(shí),可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

    1.8.6 糖網(wǎng)明目顆粒的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 將Y79細(xì)胞以3×104個(gè)/孔的細(xì)胞密度,接種于96孔板中培養(yǎng) 12 h。加入不同濃度的糖網(wǎng)明目顆粒(0.2、0.4、0.8、1.0 mg/mL)干預(yù) 24 h。利用 CCK8 試劑盒測定細(xì)胞的生存率以探究糖網(wǎng)明目顆粒是否對該細(xì)胞具有毒性作用。

    1.8.7 細(xì)胞分組及處理 細(xì)胞造模:在6孔板中均勻接種生長良好的Y79細(xì)胞,按5×105個(gè)/mL細(xì)胞密度加入2 mL完全培養(yǎng)基,每孔加入25 mmol/L高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h建立高糖損傷模型。細(xì)胞分組:正常對照組(NG組),高糖模型組(HG組),等滲對照組(DS組),0.4 mg/mL糖網(wǎng)明目顆粒干預(yù)高糖組(HG-TWMM G 組),0.2 mg/mL糖網(wǎng)明目顆粒干預(yù)高糖組(HG-TWMM L組)。去掉原高糖培養(yǎng)液,各組中加入含藥培養(yǎng)基或空白對照培養(yǎng)基,培養(yǎng)48 h。

    1.8.8 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測細(xì)胞中EGFR和MAPK14蛋白表達(dá) 藥物干預(yù)48 h后,提取細(xì)胞蛋白并利用BCA試劑盒測定各樣品蛋白濃度,稀釋配平變性后進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞蛋白上樣量為10 μg/孔;電泳轉(zhuǎn)膜完成后封閉2 h,按照蛋白分子量裁取條帶,一抗孵育過夜。第2天洗膜進(jìn)行二抗孵育1.5 h,洗膜。AI600凝膠成像系統(tǒng)曝光,統(tǒng)計(jì)條帶灰度值。目的蛋白相對表達(dá)量為蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值/正常組,采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,組間比較采用單因素方差分析檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 糖網(wǎng)明目顆粒活性成分的篩選 糖網(wǎng)明目顆粒中包含的活性成分信息表見OSID碼。根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取黃芪,黃連,密蒙花,女貞子,烏梅,益母草所含成分。由于肉桂中沒有符合OB≥30%,DL≥0.18的活性成分,通過查閱文獻(xiàn)補(bǔ)充肉桂中的有效成分(如:肉桂酸,異甘草素,醋酸桂皮酯等)[15-16]納入到活性成分表中,最終得到黃芪化學(xué)成分20個(gè),黃連化學(xué)成分14個(gè),密蒙花化學(xué)成分4個(gè),女貞子化學(xué)成分13個(gè),烏梅化學(xué)成分8個(gè),益母草化學(xué)成分8個(gè),肉桂化學(xué)成分5個(gè)。

    2.2 靶點(diǎn)預(yù)測以及PPI網(wǎng)絡(luò)分析 將活性成分在PharmMapper中返回的前300個(gè)潛在作用靶點(diǎn)依據(jù)Norm Fit值由高到低排序,選擇前10個(gè)作為活性成分的重要靶標(biāo)。在Uniprot數(shù)據(jù)庫的檢索功能中輸入靶標(biāo)的PDB ID,限定物種為“人”,對應(yīng)得到靶點(diǎn)的基因名稱,去除重復(fù)后得到271個(gè)靶點(diǎn)。將獲得的271個(gè)靶點(diǎn)與Disgenet及GeneCards數(shù)據(jù)庫中與DR相關(guān)的疾病靶標(biāo)對比分析,交集歸納得到62個(gè)與糖網(wǎng)明目顆粒治療DR相關(guān)聯(lián)的潛在作用靶點(diǎn),見圖1。

    圖1 糖網(wǎng)明目顆粒-DR共同靶基因韋恩圖Fig.1 Venn diagram of Tangwang Mingmu Granules-DR common target gene

    將62個(gè)潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入到STRING數(shù)據(jù)庫中,建立 PPI網(wǎng)絡(luò)。將 PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入 Cytoscape 3.6.0軟件,得到56個(gè)相互作用的節(jié)點(diǎn)和297條邊。利用MCODE功能篩選出連接最為緊密的功能模塊(Score=12.333),得到19個(gè)核心靶點(diǎn),111條邊(圖2)。核心靶點(diǎn)信息見表1。

    圖2 作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建Fig.2 PPI network construction of action target

    表1 核心靶點(diǎn)信息Tab.1 Core target information

    2.3 中藥-活性成分-核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析使用Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建糖網(wǎng)明目顆?;钚猿煞?核心靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)模型,如圖3所示。圖中共產(chǎn)生87個(gè)節(jié)點(diǎn),185條邊。不同顏色的節(jié)點(diǎn)分別代表中藥、活性成分、調(diào)節(jié)的核心靶點(diǎn),邊代表活性成分和靶點(diǎn)間的相互作用。結(jié)果表明了糖網(wǎng)明目顆粒多成分、多靶點(diǎn)的協(xié)同作用模式。

    圖3 中藥-活性成分-核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Network diagram of Chinese medicine,active ingredients and core targets

    2.4 潛在靶點(diǎn)的GO生物功能注釋分析 GO生物功能注釋分為3個(gè)方面:生物過程(BP)、細(xì)胞組成(CC)和分子功能(MF)。對62個(gè)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析,得到147條BP相關(guān),31項(xiàng)CC相關(guān),48條MF相關(guān)。將最顯著的前10條進(jìn)行展示。見圖4。其中,糖網(wǎng)明目顆粒作用靶點(diǎn)在BP中的富集包括細(xì)胞過程、凋亡過程、蛋白代謝過程、RNA生物合成過程、化學(xué)反應(yīng)、細(xì)胞蛋白修飾過程等主要生物過程,富集條目如:信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction),占總富集數(shù)目的18.03%;抗細(xì)胞凋亡(negative regulation of apoptotic process),占總富集數(shù)目的 14.75%;RNA聚合酶Ⅱ?qū)D(zhuǎn)錄的正調(diào)控(positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter),占總富集數(shù)目的14.75%。在CC中,富集條目分布于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)(cytosol)、細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm),分別各占據(jù)總富集數(shù)目的 49.18%與47.54%。MF 中,富集條目主要是蛋白質(zhì)結(jié)合(protein binding),占總富集數(shù)目的78.68%。

    圖4 GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis

    2.5 潛在靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析 運(yùn)用R語言,對糖網(wǎng)明目顆粒的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路分析,以P≤0.05為篩選條件,得到163條生物通路,取前20條生物通路進(jìn)行可視化分析(圖5),涉及糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化產(chǎn)物(AGE)-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)信號通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、內(nèi)分泌抵抗、FoxO信號通路、白細(xì)胞介素-17(IL-17)信號通路等。

    圖5 KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

    2.6 分子對接分析 選取中藥-活性成分-核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中,度值>5的靶點(diǎn)作為受體,每味藥中度值最高的活性成分作為配體,進(jìn)行分子對接驗(yàn)證,結(jié)合自由能如表3所示。普遍認(rèn)為,Affinity>-4 kcal/mol,結(jié)合力極弱或認(rèn)為無結(jié)合;-7 kcal/mol<Affinity≤-4 kcal/mol,結(jié)合力中等;Affinity≤-7 kcal/mol,結(jié)合力較強(qiáng)。選取每個(gè)靶點(diǎn)與活性成分結(jié)合自由能最低的對接結(jié)果用PyMol進(jìn)行可視化分析圖見OSID碼。結(jié)果顯示靶點(diǎn)與活性成分之間均可以穩(wěn)定結(jié)合,相互影響,表明糖網(wǎng)明目顆粒對DR多成分,多靶點(diǎn)的協(xié)同治療作用。

    表3 分子對接結(jié)果Tab.3 Molecular docking results

    2.7 糖網(wǎng)明目顆粒對Y79細(xì)胞高糖模型的影響

    2.7.1 糖網(wǎng)明目顆粒的安全濃度篩選 糖網(wǎng)明目顆粒濃度在0.2~0.8 mg/mL范圍對Y79細(xì)胞沒有毒性。故選擇 0.2 mg/mL,0.4 mg/mL 為糖網(wǎng)明目顆粒的細(xì)胞給藥劑量。見圖6。

    圖6 糖網(wǎng)明目顆粒對Y79細(xì)胞活力的影響(n=3)Fig.6 Impacts of Tangwang Mingmu Granules on the expression of EGFR and MAPK14 proteins(n=3)

    2.7.2 糖網(wǎng)明目顆粒對Y79細(xì)胞中EGFR和MAPK14蛋白表達(dá)的影響 與NG組相比,HG組的EGFR、MAPK14 蛋白表達(dá)水平明顯增高(P<0.05),但給藥組可顯著降低EGFR、MAPK14蛋白表達(dá)水平。見圖7。

    圖7 糖網(wǎng)明目顆粒對EGFR和MAPK14蛋白表達(dá)的影響(n=3)Fig.7 Impacts of Tangwang Mingmu Granules on the expression of EGFR and MAPK14 proteins(n=3)

    3 討論

    糖網(wǎng)明目顆粒中黃柏酮,7-O-甲基異鼠李糖醇,金合歡素,木犀草素,表兒茶素,花生四烯酸甲酯,花生四烯酸與PPI核心靶點(diǎn)具有良好的結(jié)合能力,提示其可能是治療DR的關(guān)鍵成分。其中木犀草素可抑制VEGF誘導(dǎo)的血管生成,有助于抑制早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變的發(fā)病[17-18]。表兒茶素顯著減少高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞ARPE-19細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生,并減少細(xì)胞凋亡和炎癥相關(guān)因素[19]?;ㄉ南┧岬亩喾N代謝產(chǎn)物被證實(shí)與DR期間的微血管功能障礙有關(guān)[20-21];黃柏酮可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和凋亡[22]等。

    骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)是PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出的核心靶點(diǎn)之一。研究表明,BMP2的水平在DR患者和DR小鼠視網(wǎng)膜中升高,破壞了內(nèi)皮屏障功能,上調(diào)視網(wǎng)膜中VEGF水平,誘導(dǎo)內(nèi)皮-白細(xì)胞黏附并上調(diào)炎癥標(biāo)志物和細(xì)胞因子,如細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-8(IL-8)[23-24]。類固醇激素受體輔激活子(SRC)在細(xì)胞增殖,分化等細(xì)胞進(jìn)程中發(fā)揮重要作用,可以直接與VE-鈣黏蛋白結(jié)合,從而調(diào)節(jié)VE-鈣黏蛋白酪氨酸磷酸化和內(nèi)皮通透性[25]。纖維連接蛋白1(FN1)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、遷移或腫瘤轉(zhuǎn)移等,研究表明,纖維連接蛋白在視網(wǎng)膜血管化活動區(qū)中上調(diào),并可能參與DR中病理性血管的生成[26-27]。

    GO富集分析結(jié)果表明,糖網(wǎng)明目顆粒治療DR機(jī)制主要涉及的關(guān)鍵生物過程包括凋亡過程的負(fù)調(diào)控,細(xì)胞增殖的正調(diào)控,RNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控等,分子功能涉及蛋白質(zhì)結(jié)合,受體結(jié)合,激酶活性等方面。KEGG富集分析說明,糖網(wǎng)明目顆粒的主要活性成分可能是通過介導(dǎo)AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、內(nèi)分泌抵抗、FoxO信號通路、IL-17信號通路等途徑來治療DR。其中AGE-RAGE信號通路可激活蛋白激酶C(PKC)和MAPKs等多個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號通路,導(dǎo)致細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)激活,促進(jìn)多種促炎細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-1(IL-1),IL-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達(dá),可引起視網(wǎng)膜毛細(xì)血管細(xì)胞凋亡,血管通透性增加,破壞血-視網(wǎng)膜屏障,促進(jìn)DR的發(fā)展[28-30]。研究顯示,AGEs可以通過RAGE/Src/ERK信號通路發(fā)揮血管生成作用,激活的SRC參與引起內(nèi)皮細(xì)胞存活和血管生成刺激的信號通路,表明SRC可能是預(yù)防和治療AGEs相關(guān)微血管病變的合適靶點(diǎn)[31]。AGEs還可導(dǎo)致DR中的病理性血管生成,提示AGE是糖網(wǎng)明目顆粒治療DR的靶點(diǎn)[32],此推測需要通過體內(nèi)外研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

    分子對接結(jié)果表明,糖網(wǎng)明目顆粒中木犀草素、金合歡素等活性成分與EGFR、BMP2、MAPK1、MAPK14等靶點(diǎn)具有良好的結(jié)合作用,能夠與氨基酸形成較強(qiáng)的氫鍵相互作用。該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選結(jié)果,表明糖網(wǎng)明目顆粒治療DR的主要作用機(jī)制在于木犀草素、金合歡素、表兒茶素等活性成分通過 EGFR、BMP2、MAPK1、MAPK14等靶點(diǎn)對腫瘤壞死因子、FoxO等信號通路進(jìn)行調(diào)控,從而參與DR的治療過程。

    上述結(jié)果在細(xì)胞模型中進(jìn)行了驗(yàn)證。高糖環(huán)境刺激Y79細(xì)胞可增加EGFR、MAPK14蛋白表達(dá),而糖網(wǎng)明目顆粒有效抑制了EGFR和MAPK14蛋白表達(dá)。MAPK14是MAP激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要組成部分,MAPK信號通路與TNF信號通路相關(guān)聯(lián);EGFR則會激活下游的PI3激酶(PI3K)-絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)、轉(zhuǎn)錄活化因子(STATs)等模塊[33],涉及到炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖與凋亡、氧化應(yīng)激等。該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了糖網(wǎng)明目顆粒治療DR的作用機(jī)制。但是,本研究僅通過數(shù)據(jù)挖掘?qū)μ蔷W(wǎng)明目顆粒治療DR的機(jī)制進(jìn)行了預(yù)測以及簡單驗(yàn)證,仍然存在局限性,尚需要進(jìn)行基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)深入研究。

    4 結(jié)論

    本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法篩選糖網(wǎng)明目顆粒中的有效成分和治療DR的作用靶點(diǎn),繼而以細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對所預(yù)測機(jī)制中的相關(guān)蛋白進(jìn)行檢驗(yàn),結(jié)果表明糖網(wǎng)明目顆粒有效抑制了EGFR和MAPK14蛋白表達(dá)。推測糖網(wǎng)明目顆粒通過參與調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激,炎癥反應(yīng),細(xì)胞增殖和凋亡等生物過程,達(dá)到對DR的治療作用。本研究充分體現(xiàn)了糖網(wǎng)明目顆粒治療DR具有多成分,多靶點(diǎn),多途徑協(xié)同發(fā)揮藥效的特點(diǎn),為糖網(wǎng)明目顆粒對DR的治療及后續(xù)深入研發(fā)提供指導(dǎo)與依據(jù)。

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