基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探討糖網(wǎng)明目顆粒治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的作用機(jī)制*

王芳，王譽(yù)程，ODURO Patrick Kwabena，仝婉昱，冷玲，2，黎瑞巧，2，王啟隆，2，劉二偉，2

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 301617；2.組分中藥國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617）

糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）作為糖尿病最常見的微血管病變之一，是造成糖尿病患者視力障礙的主要原因[1]。研究表明，炎癥和氧化應(yīng)激可以促進(jìn)非增殖性DR向增殖性DR的轉(zhuǎn)變[2-3]，血-視網(wǎng)膜屏障（BRB）完整性的破壞會加劇視網(wǎng)膜血管生成，進(jìn)而損傷視力[4]。臨床常用的激光療法或者玻璃體內(nèi)注射血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）抗體治療[5]具有成本高昂，不良反應(yīng)多，治療時(shí)間長等局限性[6-7]。

中藥對糖尿病血管并發(fā)癥的保護(hù)作用受到越來越多關(guān)注，為DR的防治提供了新的途徑。糖網(wǎng)明目顆粒是基于治療DR的臨床經(jīng)驗(yàn)方——密蒙花方而開發(fā)的中藥6類新藥[8-9]。密蒙花方是在長期防治DR的臨床基礎(chǔ)上，在“心腎論治早期DR”的新思路指導(dǎo)下，以益氣養(yǎng)陰、交通心腎、和血明目為組方原則，用于防治非增殖期DR的經(jīng)驗(yàn)方。臨床研究表明該方對于早期DR患者，具有改善其全身及眼睛癥狀的功效，包括提高DR患者的視力、改變視疲勞、改善眼底血管狀態(tài)等，且證實(shí)了該方臨床長期用藥的安全性[10-11]。方中黃芪益氣健脾生血，烏梅收斂生津止血，兩者共為君藥以益氣養(yǎng)陰；黃連，肉桂能引火歸源，交通心腎，為臣藥；益母草、女貞子益肝腎明目、和血化瘀共為佐藥；密蒙花清熱瀉火、養(yǎng)肝明目，又可引藥上行，為使藥[9，12]。糖網(wǎng)明目顆粒利用現(xiàn)代工藝制藥，將以預(yù)防和早期治療為主要目的參與DR治療。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，通過建立“藥物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)”，從多角度分析藥物治療疾病的潛在機(jī)制[13]。分子對接技術(shù)通過模擬藥物分子和靶蛋白之間的潛在連接方式，預(yù)測藥物配體和蛋白質(zhì)受體的對接模式和結(jié)合親和力，為中藥多成分、多靶點(diǎn)的藥物作用機(jī)制探索提供研究策略[14]。本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)初步探討糖網(wǎng)明目顆粒治療DR的活性成分和作用機(jī)制并通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，旨在為進(jìn)一步研究糖網(wǎng)明目顆粒治療DR的機(jī)制以及臨床應(yīng)用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 糖網(wǎng)明目顆粒的化學(xué)成分以及靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建 依據(jù)糖網(wǎng)明目顆粒所含的中藥，借助中藥系統(tǒng)藥理分析平臺（TCMSP，https：//tcmsp-e.com/）查詢化學(xué)成分，按照口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18的條件篩選具有活性成分的化合物，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，補(bǔ)充含量較高、有藥理作用的活性成分納入表中。

通過 PharmMapper服務(wù)器（http：//lilab-ecust.cn/pharmmapper/）對活性成分進(jìn)行模擬分子-靶蛋白對接，構(gòu)建活性成分靶點(diǎn)庫。將糖網(wǎng)明目顆?；瘜W(xué)成分的Mol2格式結(jié)構(gòu)文件，上傳至PharmMapper服務(wù)器，以活性小分子為探針，搜尋潛在藥物靶點(diǎn)，進(jìn)行虛擬篩選和預(yù)測化合物生物活性，得到活性成分的靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果，根據(jù)Norm Fit值由高到低排序，選擇前10個(gè)靶點(diǎn)作為活性成分的重要靶標(biāo)，導(dǎo)入 UniProt數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/）中，限定物種為“人”，查詢對應(yīng)的UniProtKB編碼和基因名稱。

1.2 DR靶基因數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建 在數(shù)據(jù)庫Disgenet（https：//www.disgenet.org/）和GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）中以“Diabetic retinopathy”作為關(guān)鍵詞構(gòu)建疾病靶點(diǎn)庫。

1.3 靶點(diǎn)篩選 繪制維恩圖（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），對糖網(wǎng)明目顆粒的藥物靶點(diǎn)與DR靶基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，選擇交集靶點(diǎn)作為糖網(wǎng)明目顆粒治療DR的潛在靶點(diǎn)。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 使用STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/，version11.5），輸入潛在靶點(diǎn)，在organism項(xiàng)設(shè)置物種為“Homo sapiens”，隱藏單獨(dú)靶點(diǎn)得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）。將PPI數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件中，利用MCODE功能篩選連接最為緊密的功能模塊。

1.5 中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將中藥、藥物有效成分、核心靶點(diǎn)文件導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建中藥-活性成分-核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 基因富集分析和通路注釋研究 基因本體論（GO）是注釋基因及其表達(dá)產(chǎn)物的常用方法。使用R-4.1.1，導(dǎo)入作用靶點(diǎn)，引用“Stringr”“tidyr”“ggpubr”等程序包，設(shè)定閾值P≤0.05篩選具有顯著性差異的生物過程，并可視化GO富集分析結(jié)果。

京都基因與基因組百科全書（KEGG）可對藥物作用靶點(diǎn)或差異表達(dá)基因進(jìn)行信號通路分析。將作用靶點(diǎn)導(dǎo)入 R-4.1.1，運(yùn)用“DOSE”“clusterProfiler”“pathview”等程序包進(jìn)行KEGG通路富集分析，設(shè)定閾值P≤0.05篩選具有顯著性差異的可靠靶點(diǎn)通路。

1.7 分子對接 從RSCB PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）下載核心靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)保存為PDB格式文件，從TCMSP數(shù)據(jù)庫下載藥物活性成分的3D結(jié)構(gòu)，保存為mol2格式。使用AutoDockTools 1.5.6軟件，以靶蛋白作為受體，將核心活性成分作為配體，根據(jù)靶蛋白復(fù)合物中配體的坐標(biāo)確定活性位點(diǎn)，設(shè)置活性口袋，運(yùn)行AutoDock Vina進(jìn)行對接，用PyMol 2.2.0和Discovery Studio 2019進(jìn)行結(jié)果分析。

1.8 體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.8.1 藥物 糖網(wǎng)明目顆粒，實(shí)驗(yàn)使用該藥浸膏粉，3.5 g生藥/g，由北京紅太陽藥業(yè)有限公司提供，溶于無菌超純水中配制成300 mg/mL的母液。

1.8.2 細(xì)胞 人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株Y79購自北納生物河南省工業(yè)微生物菌種工程技術(shù)研究中心（BNCC341293）。

1.8.3 試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基，胎牛血清（FBS），青鏈霉素混合液購于美國Gibco公司；CCK8試劑盒，5×蛋白上樣緩沖液購于北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒和SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；表皮生長因子受體（EGFR，貨號：0407-21）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）14（貨號：R1308-3）購于杭州華安生物技術(shù)有限公司；Tubulin（貨號：AC007）購于武漢愛博泰克生物科技有限公司。

1.8.4 儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱（HF240，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）、電泳儀（PowerPACTMHC，美國Bio-Rad公司）；Amershan Imager 600凝膠成像系統(tǒng)（日本GE公司）等。

1.8.5 細(xì)胞培養(yǎng) Y79細(xì)胞在RPMI-1640培養(yǎng)基（10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液）中，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待培養(yǎng)瓶中細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)，可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.8.6 糖網(wǎng)明目顆粒的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 將Y79細(xì)胞以3×104個(gè)/孔的細(xì)胞密度，接種于96孔板中培養(yǎng) 12 h。加入不同濃度的糖網(wǎng)明目顆粒（0．2、0．4、0．8、1．0 mg/mL）干預(yù) 24 h。利用 CCK8 試劑盒測定細(xì)胞的生存率以探究糖網(wǎng)明目顆粒是否對該細(xì)胞具有毒性作用。

1.8.7 細(xì)胞分組及處理 細(xì)胞造模：在6孔板中均勻接種生長良好的Y79細(xì)胞，按5×105個(gè)/mL細(xì)胞密度加入2 mL完全培養(yǎng)基，每孔加入25 mmol/L高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h建立高糖損傷模型。細(xì)胞分組：正常對照組（NG組），高糖模型組（HG組），等滲對照組（DS組），0．4 mg/mL糖網(wǎng)明目顆粒干預(yù)高糖組（HG-TWMM G 組），0．2 mg/mL糖網(wǎng)明目顆粒干預(yù)高糖組（HG-TWMM L組）。去掉原高糖培養(yǎng)液，各組中加入含藥培養(yǎng)基或空白對照培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。

1.8.8 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測細(xì)胞中EGFR和MAPK14蛋白表達(dá) 藥物干預(yù)48 h后，提取細(xì)胞蛋白并利用BCA試劑盒測定各樣品蛋白濃度，稀釋配平變性后進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞蛋白上樣量為10 μg/孔；電泳轉(zhuǎn)膜完成后封閉2 h，按照蛋白分子量裁取條帶，一抗孵育過夜。第2天洗膜進(jìn)行二抗孵育1．5 h，洗膜。AI600凝膠成像系統(tǒng)曝光，統(tǒng)計(jì)條帶灰度值。目的蛋白相對表達(dá)量為蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值/正常組，采用SPSS 25．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)，P＜0．05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糖網(wǎng)明目顆粒活性成分的篩選 糖網(wǎng)明目顆粒中包含的活性成分信息表見OSID碼。根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取黃芪，黃連，密蒙花，女貞子，烏梅，益母草所含成分。由于肉桂中沒有符合OB≥30%，DL≥0．18的活性成分，通過查閱文獻(xiàn)補(bǔ)充肉桂中的有效成分（如：肉桂酸，異甘草素，醋酸桂皮酯等）[15-16]納入到活性成分表中，最終得到黃芪化學(xué)成分20個(gè)，黃連化學(xué)成分14個(gè)，密蒙花化學(xué)成分4個(gè)，女貞子化學(xué)成分13個(gè)，烏梅化學(xué)成分8個(gè)，益母草化學(xué)成分8個(gè)，肉桂化學(xué)成分5個(gè)。

2.2 靶點(diǎn)預(yù)測以及PPI網(wǎng)絡(luò)分析 將活性成分在PharmMapper中返回的前300個(gè)潛在作用靶點(diǎn)依據(jù)Norm Fit值由高到低排序，選擇前10個(gè)作為活性成分的重要靶標(biāo)。在Uniprot數(shù)據(jù)庫的檢索功能中輸入靶標(biāo)的PDB ID，限定物種為“人”，對應(yīng)得到靶點(diǎn)的基因名稱，去除重復(fù)后得到271個(gè)靶點(diǎn)。將獲得的271個(gè)靶點(diǎn)與Disgenet及GeneCards數(shù)據(jù)庫中與DR相關(guān)的疾病靶標(biāo)對比分析，交集歸納得到62個(gè)與糖網(wǎng)明目顆粒治療DR相關(guān)聯(lián)的潛在作用靶點(diǎn)，見圖1。

圖1 糖網(wǎng)明目顆粒-DR共同靶基因韋恩圖Fig.1 Venn diagram of Tangwang Mingmu Granules-DR common target gene

將62個(gè)潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入到STRING數(shù)據(jù)庫中，建立 PPI網(wǎng)絡(luò)。將 PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入 Cytoscape 3．6．0軟件，得到56個(gè)相互作用的節(jié)點(diǎn)和297條邊。利用MCODE功能篩選出連接最為緊密的功能模塊（Score=12．333），得到19個(gè)核心靶點(diǎn)，111條邊（圖2）。核心靶點(diǎn)信息見表1。

圖2 作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建Fig.2 PPI network construction of action target

表1 核心靶點(diǎn)信息Tab.1 Core target information

2.3 中藥-活性成分-核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析使用Cytoscape 3．6．0軟件構(gòu)建糖網(wǎng)明目顆?；钚猿煞?核心靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)模型，如圖3所示。圖中共產(chǎn)生87個(gè)節(jié)點(diǎn)，185條邊。不同顏色的節(jié)點(diǎn)分別代表中藥、活性成分、調(diào)節(jié)的核心靶點(diǎn)，邊代表活性成分和靶點(diǎn)間的相互作用。結(jié)果表明了糖網(wǎng)明目顆粒多成分、多靶點(diǎn)的協(xié)同作用模式。

圖3 中藥-活性成分-核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Network diagram of Chinese medicine，active ingredients and core targets

2.4 潛在靶點(diǎn)的GO生物功能注釋分析 GO生物功能注釋分為3個(gè)方面：生物過程（BP）、細(xì)胞組成（CC）和分子功能（MF）。對62個(gè)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，得到147條BP相關(guān)，31項(xiàng)CC相關(guān)，48條MF相關(guān)。將最顯著的前10條進(jìn)行展示。見圖4。其中，糖網(wǎng)明目顆粒作用靶點(diǎn)在BP中的富集包括細(xì)胞過程、凋亡過程、蛋白代謝過程、RNA生物合成過程、化學(xué)反應(yīng)、細(xì)胞蛋白修飾過程等主要生物過程，富集條目如：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（signal transduction），占總富集數(shù)目的18．03%；抗細(xì)胞凋亡（negative regulation of apoptotic process），占總富集數(shù)目的 14．75%；RNA聚合酶Ⅱ?qū)D(zhuǎn)錄的正調(diào)控（positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter），占總富集數(shù)目的14．75%。在CC中，富集條目分布于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)（cytosol）、細(xì)胞質(zhì)（cytoplasm），分別各占據(jù)總富集數(shù)目的 49．18%與47．54%。MF 中，富集條目主要是蛋白質(zhì)結(jié)合（protein binding），占總富集數(shù)目的78．68%。

圖4 GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis

2.5 潛在靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析 運(yùn)用R語言，對糖網(wǎng)明目顆粒的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路分析，以P≤0．05為篩選條件，得到163條生物通路，取前20條生物通路進(jìn)行可視化分析（圖5），涉及糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化產(chǎn)物（AGE）-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、內(nèi)分泌抵抗、FoxO信號通路、白細(xì)胞介素-17（IL-17）信號通路等。

圖5 KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

2.6 分子對接分析 選取中藥-活性成分-核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中，度值＞5的靶點(diǎn)作為受體，每味藥中度值最高的活性成分作為配體，進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，結(jié)合自由能如表3所示。普遍認(rèn)為，Affinity＞-4 kcal/mol，結(jié)合力極弱或認(rèn)為無結(jié)合；-7 kcal/mol＜Affinity≤-4 kcal/mol，結(jié)合力中等；Affinity≤-7 kcal/mol，結(jié)合力較強(qiáng)。選取每個(gè)靶點(diǎn)與活性成分結(jié)合自由能最低的對接結(jié)果用PyMol進(jìn)行可視化分析圖見OSID碼。結(jié)果顯示靶點(diǎn)與活性成分之間均可以穩(wěn)定結(jié)合，相互影響，表明糖網(wǎng)明目顆粒對DR多成分，多靶點(diǎn)的協(xié)同治療作用。

表3 分子對接結(jié)果Tab.3 Molecular docking results

2.7 糖網(wǎng)明目顆粒對Y79細(xì)胞高糖模型的影響

2.7.1 糖網(wǎng)明目顆粒的安全濃度篩選 糖網(wǎng)明目顆粒濃度在0．2～0．8 mg/mL范圍對Y79細(xì)胞沒有毒性。故選擇 0．2 mg/mL，0．4 mg/mL 為糖網(wǎng)明目顆粒的細(xì)胞給藥劑量。見圖6。

圖6 糖網(wǎng)明目顆粒對Y79細(xì)胞活力的影響（n=3）Fig.6 Impacts of Tangwang Mingmu Granules on the expression of EGFR and MAPK14 proteins(n=3)

2.7.2 糖網(wǎng)明目顆粒對Y79細(xì)胞中EGFR和MAPK14蛋白表達(dá)的影響 與NG組相比，HG組的EGFR、MAPK14 蛋白表達(dá)水平明顯增高（P＜0．05），但給藥組可顯著降低EGFR、MAPK14蛋白表達(dá)水平。見圖7。

圖7 糖網(wǎng)明目顆粒對EGFR和MAPK14蛋白表達(dá)的影響（n=3）Fig.7 Impacts of Tangwang Mingmu Granules on the expression of EGFR and MAPK14 proteins（n=3）

3 討論

糖網(wǎng)明目顆粒中黃柏酮，7-O-甲基異鼠李糖醇，金合歡素，木犀草素，表兒茶素，花生四烯酸甲酯，花生四烯酸與PPI核心靶點(diǎn)具有良好的結(jié)合能力，提示其可能是治療DR的關(guān)鍵成分。其中木犀草素可抑制VEGF誘導(dǎo)的血管生成，有助于抑制早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變的發(fā)病[17-18]。表兒茶素顯著減少高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞ARPE-19細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生，并減少細(xì)胞凋亡和炎癥相關(guān)因素[19]?；ㄉ南┧岬亩喾N代謝產(chǎn)物被證實(shí)與DR期間的微血管功能障礙有關(guān)[20-21]；黃柏酮可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和凋亡[22]等。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）是PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出的核心靶點(diǎn)之一。研究表明，BMP2的水平在DR患者和DR小鼠視網(wǎng)膜中升高，破壞了內(nèi)皮屏障功能，上調(diào)視網(wǎng)膜中VEGF水平，誘導(dǎo)內(nèi)皮-白細(xì)胞黏附并上調(diào)炎癥標(biāo)志物和細(xì)胞因子，如細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和白細(xì)胞介素-8（IL-8）[23-24]。類固醇激素受體輔激活子（SRC）在細(xì)胞增殖，分化等細(xì)胞進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，可以直接與VE-鈣黏蛋白結(jié)合，從而調(diào)節(jié)VE-鈣黏蛋白酪氨酸磷酸化和內(nèi)皮通透性[25]。纖維連接蛋白1（FN1）參與調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、遷移或腫瘤轉(zhuǎn)移等，研究表明，纖維連接蛋白在視網(wǎng)膜血管化活動區(qū)中上調(diào)，并可能參與DR中病理性血管的生成[26-27]。

GO富集分析結(jié)果表明，糖網(wǎng)明目顆粒治療DR機(jī)制主要涉及的關(guān)鍵生物過程包括凋亡過程的負(fù)調(diào)控，細(xì)胞增殖的正調(diào)控，RNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控等，分子功能涉及蛋白質(zhì)結(jié)合，受體結(jié)合，激酶活性等方面。KEGG富集分析說明，糖網(wǎng)明目顆粒的主要活性成分可能是通過介導(dǎo)AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、內(nèi)分泌抵抗、FoxO信號通路、IL-17信號通路等途徑來治療DR。其中AGE-RAGE信號通路可激活蛋白激酶C（PKC）和MAPKs等多個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號通路，導(dǎo)致細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）激活，促進(jìn)多種促炎細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-1（IL-1），IL-6和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達(dá)，可引起視網(wǎng)膜毛細(xì)血管細(xì)胞凋亡，血管通透性增加，破壞血-視網(wǎng)膜屏障，促進(jìn)DR的發(fā)展[28-30]。研究顯示，AGEs可以通過RAGE/Src/ERK信號通路發(fā)揮血管生成作用，激活的SRC參與引起內(nèi)皮細(xì)胞存活和血管生成刺激的信號通路，表明SRC可能是預(yù)防和治療AGEs相關(guān)微血管病變的合適靶點(diǎn)[31]。AGEs還可導(dǎo)致DR中的病理性血管生成，提示AGE是糖網(wǎng)明目顆粒治療DR的靶點(diǎn)[32]，此推測需要通過體內(nèi)外研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

分子對接結(jié)果表明，糖網(wǎng)明目顆粒中木犀草素、金合歡素等活性成分與EGFR、BMP2、MAPK1、MAPK14等靶點(diǎn)具有良好的結(jié)合作用，能夠與氨基酸形成較強(qiáng)的氫鍵相互作用。該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選結(jié)果，表明糖網(wǎng)明目顆粒治療DR的主要作用機(jī)制在于木犀草素、金合歡素、表兒茶素等活性成分通過 EGFR、BMP2、MAPK1、MAPK14等靶點(diǎn)對腫瘤壞死因子、FoxO等信號通路進(jìn)行調(diào)控，從而參與DR的治療過程。

上述結(jié)果在細(xì)胞模型中進(jìn)行了驗(yàn)證。高糖環(huán)境刺激Y79細(xì)胞可增加EGFR、MAPK14蛋白表達(dá)，而糖網(wǎng)明目顆粒有效抑制了EGFR和MAPK14蛋白表達(dá)。MAPK14是MAP激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要組成部分，MAPK信號通路與TNF信號通路相關(guān)聯(lián)；EGFR則會激活下游的PI3激酶（PI3K）-絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT）、轉(zhuǎn)錄活化因子（STATs）等模塊[33]，涉及到炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖與凋亡、氧化應(yīng)激等。該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了糖網(wǎng)明目顆粒治療DR的作用機(jī)制。但是，本研究僅通過數(shù)據(jù)挖掘?qū)μ蔷W(wǎng)明目顆粒治療DR的機(jī)制進(jìn)行了預(yù)測以及簡單驗(yàn)證，仍然存在局限性，尚需要進(jìn)行基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)深入研究。

4 結(jié)論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法篩選糖網(wǎng)明目顆粒中的有效成分和治療DR的作用靶點(diǎn)，繼而以細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對所預(yù)測機(jī)制中的相關(guān)蛋白進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果表明糖網(wǎng)明目顆粒有效抑制了EGFR和MAPK14蛋白表達(dá)。推測糖網(wǎng)明目顆粒通過參與調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激，炎癥反應(yīng)，細(xì)胞增殖和凋亡等生物過程，達(dá)到對DR的治療作用。本研究充分體現(xiàn)了糖網(wǎng)明目顆粒治療DR具有多成分，多靶點(diǎn)，多途徑協(xié)同發(fā)揮藥效的特點(diǎn)，為糖網(wǎng)明目顆粒對DR的治療及后續(xù)深入研發(fā)提供指導(dǎo)與依據(jù)。