• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探討糖網(wǎng)明目顆粒治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的作用機(jī)制*

    2023-01-31 11:57:12王芳王譽(yù)程ODUROPatrickKwabena仝婉昱冷玲黎瑞巧王啟隆劉二偉
    天津中醫(yī)藥 2023年1期
    關(guān)鍵詞:明目靶點(diǎn)通路

    王芳,王譽(yù)程,ODURO Patrick Kwabena,仝婉昱,冷玲,2,黎瑞巧,2,王啟隆,2,劉二偉,2

    (1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院,天津 301617;2.組分中藥國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 301617)

    糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)作為糖尿病最常見的微血管病變之一,是造成糖尿病患者視力障礙的主要原因[1]。研究表明,炎癥和氧化應(yīng)激可以促進(jìn)非增殖性DR向增殖性DR的轉(zhuǎn)變[2-3],血-視網(wǎng)膜屏障(BRB)完整性的破壞會加劇視網(wǎng)膜血管生成,進(jìn)而損傷視力[4]。臨床常用的激光療法或者玻璃體內(nèi)注射血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)抗體治療[5]具有成本高昂,不良反應(yīng)多,治療時(shí)間長等局限性[6-7]。

    中藥對糖尿病血管并發(fā)癥的保護(hù)作用受到越來越多關(guān)注,為DR的防治提供了新的途徑。糖網(wǎng)明目顆粒是基于治療DR的臨床經(jīng)驗(yàn)方——密蒙花方而開發(fā)的中藥6類新藥[8-9]。密蒙花方是在長期防治DR的臨床基礎(chǔ)上,在“心腎論治早期DR”的新思路指導(dǎo)下,以益氣養(yǎng)陰、交通心腎、和血明目為組方原則,用于防治非增殖期DR的經(jīng)驗(yàn)方。臨床研究表明該方對于早期DR患者,具有改善其全身及眼睛癥狀的功效,包括提高DR患者的視力、改變視疲勞、改善眼底血管狀態(tài)等,且證實(shí)了該方臨床長期用藥的安全性[10-11]。方中黃芪益氣健脾生血,烏梅收斂生津止血,兩者共為君藥以益氣養(yǎng)陰;黃連,肉桂能引火歸源,交通心腎,為臣藥;益母草、女貞子益肝腎明目、和血化瘀共為佐藥;密蒙花清熱瀉火、養(yǎng)肝明目,又可引藥上行,為使藥[9,12]。糖網(wǎng)明目顆粒利用現(xiàn)代工藝制藥,將以預(yù)防和早期治療為主要目的參與DR治療。

    網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)理論,通過建立“藥物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)”,從多角度分析藥物治療疾病的潛在機(jī)制[13]。分子對接技術(shù)通過模擬藥物分子和靶蛋白之間的潛在連接方式,預(yù)測藥物配體和蛋白質(zhì)受體的對接模式和結(jié)合親和力,為中藥多成分、多靶點(diǎn)的藥物作用機(jī)制探索提供研究策略[14]。本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)初步探討糖網(wǎng)明目顆粒治療DR的活性成分和作用機(jī)制并通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,旨在為進(jìn)一步研究糖網(wǎng)明目顆粒治療DR的機(jī)制以及臨床應(yīng)用提供一定參考。

    1 材料與方法

    1.1 糖網(wǎng)明目顆粒的化學(xué)成分以及靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建 依據(jù)糖網(wǎng)明目顆粒所含的中藥,借助中藥系統(tǒng)藥理分析平臺(TCMSP,https://tcmsp-e.com/)查詢化學(xué)成分,按照口服生物利用度(OB)≥30%,類藥性(DL)≥0.18的條件篩選具有活性成分的化合物,并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道,補(bǔ)充含量較高、有藥理作用的活性成分納入表中。

    通過 PharmMapper服務(wù)器(http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/)對活性成分進(jìn)行模擬分子-靶蛋白對接,構(gòu)建活性成分靶點(diǎn)庫。將糖網(wǎng)明目顆?;瘜W(xué)成分的Mol2格式結(jié)構(gòu)文件,上傳至PharmMapper服務(wù)器,以活性小分子為探針,搜尋潛在藥物靶點(diǎn),進(jìn)行虛擬篩選和預(yù)測化合物生物活性,得到活性成分的靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果,根據(jù)Norm Fit值由高到低排序,選擇前10個(gè)靶點(diǎn)作為活性成分的重要靶標(biāo),導(dǎo)入 UniProt數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)中,限定物種為“人”,查詢對應(yīng)的UniProtKB編碼和基因名稱。

    1.2 DR靶基因數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建 在數(shù)據(jù)庫Disgenet(https://www.disgenet.org/)和GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)中以“Diabetic retinopathy”作為關(guān)鍵詞構(gòu)建疾病靶點(diǎn)庫。

    1.3 靶點(diǎn)篩選 繪制維恩圖(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/),對糖網(wǎng)明目顆粒的藥物靶點(diǎn)與DR靶基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配,選擇交集靶點(diǎn)作為糖網(wǎng)明目顆粒治療DR的潛在靶點(diǎn)。

    1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 使用STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/,version11.5),輸入潛在靶點(diǎn),在organism項(xiàng)設(shè)置物種為“Homo sapiens”,隱藏單獨(dú)靶點(diǎn)得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)。將PPI數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件中,利用MCODE功能篩選連接最為緊密的功能模塊。

    1.5 中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將中藥、藥物有效成分、核心靶點(diǎn)文件導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建中藥-活性成分-核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

    1.6 基因富集分析和通路注釋研究 基因本體論(GO)是注釋基因及其表達(dá)產(chǎn)物的常用方法。使用R-4.1.1,導(dǎo)入作用靶點(diǎn),引用“Stringr”“tidyr”“ggpubr”等程序包,設(shè)定閾值P≤0.05篩選具有顯著性差異的生物過程,并可視化GO富集分析結(jié)果。

    京都基因與基因組百科全書(KEGG)可對藥物作用靶點(diǎn)或差異表達(dá)基因進(jìn)行信號通路分析。將作用靶點(diǎn)導(dǎo)入 R-4.1.1,運(yùn)用“DOSE”“clusterProfiler”“pathview”等程序包進(jìn)行KEGG通路富集分析,設(shè)定閾值P≤0.05篩選具有顯著性差異的可靠靶點(diǎn)通路。

    1.7 分子對接 從RSCB PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)下載核心靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)保存為PDB格式文件,從TCMSP數(shù)據(jù)庫下載藥物活性成分的3D結(jié)構(gòu),保存為mol2格式。使用AutoDockTools 1.5.6軟件,以靶蛋白作為受體,將核心活性成分作為配體,根據(jù)靶蛋白復(fù)合物中配體的坐標(biāo)確定活性位點(diǎn),設(shè)置活性口袋,運(yùn)行AutoDock Vina進(jìn)行對接,用PyMol 2.2.0和Discovery Studio 2019進(jìn)行結(jié)果分析。

    1.8 體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

    1.8.1 藥物 糖網(wǎng)明目顆粒,實(shí)驗(yàn)使用該藥浸膏粉,3.5 g生藥/g,由北京紅太陽藥業(yè)有限公司提供,溶于無菌超純水中配制成300 mg/mL的母液。

    1.8.2 細(xì)胞 人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株Y79購自北納生物河南省工業(yè)微生物菌種工程技術(shù)研究中心(BNCC341293)。

    1.8.3 試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基,胎牛血清(FBS),青鏈霉素混合液購于美國Gibco公司;CCK8試劑盒,5×蛋白上樣緩沖液購于北京索萊寶科技有限公司;BCA蛋白定量試劑盒和SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;表皮生長因子受體(EGFR,貨號:0407-21)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)14(貨號:R1308-3)購于杭州華安生物技術(shù)有限公司;Tubulin(貨號:AC007)購于武漢愛博泰克生物科技有限公司。

    1.8.4 儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱(HF240,力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)、電泳儀(PowerPACTMHC,美國Bio-Rad公司);Amershan Imager 600凝膠成像系統(tǒng)(日本GE公司)等。

    1.8.5 細(xì)胞培養(yǎng) Y79細(xì)胞在RPMI-1640培養(yǎng)基(10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液)中,于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待培養(yǎng)瓶中細(xì)胞融合至80%~90%時(shí),可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

    1.8.6 糖網(wǎng)明目顆粒的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 將Y79細(xì)胞以3×104個(gè)/孔的細(xì)胞密度,接種于96孔板中培養(yǎng) 12 h。加入不同濃度的糖網(wǎng)明目顆粒(0.2、0.4、0.8、1.0 mg/mL)干預(yù) 24 h。利用 CCK8 試劑盒測定細(xì)胞的生存率以探究糖網(wǎng)明目顆粒是否對該細(xì)胞具有毒性作用。

    1.8.7 細(xì)胞分組及處理 細(xì)胞造模:在6孔板中均勻接種生長良好的Y79細(xì)胞,按5×105個(gè)/mL細(xì)胞密度加入2 mL完全培養(yǎng)基,每孔加入25 mmol/L高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h建立高糖損傷模型。細(xì)胞分組:正常對照組(NG組),高糖模型組(HG組),等滲對照組(DS組),0.4 mg/mL糖網(wǎng)明目顆粒干預(yù)高糖組(HG-TWMM G 組),0.2 mg/mL糖網(wǎng)明目顆粒干預(yù)高糖組(HG-TWMM L組)。去掉原高糖培養(yǎng)液,各組中加入含藥培養(yǎng)基或空白對照培養(yǎng)基,培養(yǎng)48 h。

    1.8.8 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測細(xì)胞中EGFR和MAPK14蛋白表達(dá) 藥物干預(yù)48 h后,提取細(xì)胞蛋白并利用BCA試劑盒測定各樣品蛋白濃度,稀釋配平變性后進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞蛋白上樣量為10 μg/孔;電泳轉(zhuǎn)膜完成后封閉2 h,按照蛋白分子量裁取條帶,一抗孵育過夜。第2天洗膜進(jìn)行二抗孵育1.5 h,洗膜。AI600凝膠成像系統(tǒng)曝光,統(tǒng)計(jì)條帶灰度值。目的蛋白相對表達(dá)量為蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值/正常組,采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,組間比較采用單因素方差分析檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 糖網(wǎng)明目顆粒活性成分的篩選 糖網(wǎng)明目顆粒中包含的活性成分信息表見OSID碼。根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取黃芪,黃連,密蒙花,女貞子,烏梅,益母草所含成分。由于肉桂中沒有符合OB≥30%,DL≥0.18的活性成分,通過查閱文獻(xiàn)補(bǔ)充肉桂中的有效成分(如:肉桂酸,異甘草素,醋酸桂皮酯等)[15-16]納入到活性成分表中,最終得到黃芪化學(xué)成分20個(gè),黃連化學(xué)成分14個(gè),密蒙花化學(xué)成分4個(gè),女貞子化學(xué)成分13個(gè),烏梅化學(xué)成分8個(gè),益母草化學(xué)成分8個(gè),肉桂化學(xué)成分5個(gè)。

    2.2 靶點(diǎn)預(yù)測以及PPI網(wǎng)絡(luò)分析 將活性成分在PharmMapper中返回的前300個(gè)潛在作用靶點(diǎn)依據(jù)Norm Fit值由高到低排序,選擇前10個(gè)作為活性成分的重要靶標(biāo)。在Uniprot數(shù)據(jù)庫的檢索功能中輸入靶標(biāo)的PDB ID,限定物種為“人”,對應(yīng)得到靶點(diǎn)的基因名稱,去除重復(fù)后得到271個(gè)靶點(diǎn)。將獲得的271個(gè)靶點(diǎn)與Disgenet及GeneCards數(shù)據(jù)庫中與DR相關(guān)的疾病靶標(biāo)對比分析,交集歸納得到62個(gè)與糖網(wǎng)明目顆粒治療DR相關(guān)聯(lián)的潛在作用靶點(diǎn),見圖1。

    圖1 糖網(wǎng)明目顆粒-DR共同靶基因韋恩圖Fig.1 Venn diagram of Tangwang Mingmu Granules-DR common target gene

    將62個(gè)潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入到STRING數(shù)據(jù)庫中,建立 PPI網(wǎng)絡(luò)。將 PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入 Cytoscape 3.6.0軟件,得到56個(gè)相互作用的節(jié)點(diǎn)和297條邊。利用MCODE功能篩選出連接最為緊密的功能模塊(Score=12.333),得到19個(gè)核心靶點(diǎn),111條邊(圖2)。核心靶點(diǎn)信息見表1。

    圖2 作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建Fig.2 PPI network construction of action target

    表1 核心靶點(diǎn)信息Tab.1 Core target information

    2.3 中藥-活性成分-核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析使用Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建糖網(wǎng)明目顆?;钚猿煞?核心靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)模型,如圖3所示。圖中共產(chǎn)生87個(gè)節(jié)點(diǎn),185條邊。不同顏色的節(jié)點(diǎn)分別代表中藥、活性成分、調(diào)節(jié)的核心靶點(diǎn),邊代表活性成分和靶點(diǎn)間的相互作用。結(jié)果表明了糖網(wǎng)明目顆粒多成分、多靶點(diǎn)的協(xié)同作用模式。

    圖3 中藥-活性成分-核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Network diagram of Chinese medicine,active ingredients and core targets

    2.4 潛在靶點(diǎn)的GO生物功能注釋分析 GO生物功能注釋分為3個(gè)方面:生物過程(BP)、細(xì)胞組成(CC)和分子功能(MF)。對62個(gè)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析,得到147條BP相關(guān),31項(xiàng)CC相關(guān),48條MF相關(guān)。將最顯著的前10條進(jìn)行展示。見圖4。其中,糖網(wǎng)明目顆粒作用靶點(diǎn)在BP中的富集包括細(xì)胞過程、凋亡過程、蛋白代謝過程、RNA生物合成過程、化學(xué)反應(yīng)、細(xì)胞蛋白修飾過程等主要生物過程,富集條目如:信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction),占總富集數(shù)目的18.03%;抗細(xì)胞凋亡(negative regulation of apoptotic process),占總富集數(shù)目的 14.75%;RNA聚合酶Ⅱ?qū)D(zhuǎn)錄的正調(diào)控(positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter),占總富集數(shù)目的14.75%。在CC中,富集條目分布于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)(cytosol)、細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm),分別各占據(jù)總富集數(shù)目的 49.18%與47.54%。MF 中,富集條目主要是蛋白質(zhì)結(jié)合(protein binding),占總富集數(shù)目的78.68%。

    圖4 GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis

    2.5 潛在靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析 運(yùn)用R語言,對糖網(wǎng)明目顆粒的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路分析,以P≤0.05為篩選條件,得到163條生物通路,取前20條生物通路進(jìn)行可視化分析(圖5),涉及糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化產(chǎn)物(AGE)-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)信號通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、內(nèi)分泌抵抗、FoxO信號通路、白細(xì)胞介素-17(IL-17)信號通路等。

    圖5 KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

    2.6 分子對接分析 選取中藥-活性成分-核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中,度值>5的靶點(diǎn)作為受體,每味藥中度值最高的活性成分作為配體,進(jìn)行分子對接驗(yàn)證,結(jié)合自由能如表3所示。普遍認(rèn)為,Affinity>-4 kcal/mol,結(jié)合力極弱或認(rèn)為無結(jié)合;-7 kcal/mol<Affinity≤-4 kcal/mol,結(jié)合力中等;Affinity≤-7 kcal/mol,結(jié)合力較強(qiáng)。選取每個(gè)靶點(diǎn)與活性成分結(jié)合自由能最低的對接結(jié)果用PyMol進(jìn)行可視化分析圖見OSID碼。結(jié)果顯示靶點(diǎn)與活性成分之間均可以穩(wěn)定結(jié)合,相互影響,表明糖網(wǎng)明目顆粒對DR多成分,多靶點(diǎn)的協(xié)同治療作用。

    表3 分子對接結(jié)果Tab.3 Molecular docking results

    2.7 糖網(wǎng)明目顆粒對Y79細(xì)胞高糖模型的影響

    2.7.1 糖網(wǎng)明目顆粒的安全濃度篩選 糖網(wǎng)明目顆粒濃度在0.2~0.8 mg/mL范圍對Y79細(xì)胞沒有毒性。故選擇 0.2 mg/mL,0.4 mg/mL 為糖網(wǎng)明目顆粒的細(xì)胞給藥劑量。見圖6。

    圖6 糖網(wǎng)明目顆粒對Y79細(xì)胞活力的影響(n=3)Fig.6 Impacts of Tangwang Mingmu Granules on the expression of EGFR and MAPK14 proteins(n=3)

    2.7.2 糖網(wǎng)明目顆粒對Y79細(xì)胞中EGFR和MAPK14蛋白表達(dá)的影響 與NG組相比,HG組的EGFR、MAPK14 蛋白表達(dá)水平明顯增高(P<0.05),但給藥組可顯著降低EGFR、MAPK14蛋白表達(dá)水平。見圖7。

    圖7 糖網(wǎng)明目顆粒對EGFR和MAPK14蛋白表達(dá)的影響(n=3)Fig.7 Impacts of Tangwang Mingmu Granules on the expression of EGFR and MAPK14 proteins(n=3)

    3 討論

    糖網(wǎng)明目顆粒中黃柏酮,7-O-甲基異鼠李糖醇,金合歡素,木犀草素,表兒茶素,花生四烯酸甲酯,花生四烯酸與PPI核心靶點(diǎn)具有良好的結(jié)合能力,提示其可能是治療DR的關(guān)鍵成分。其中木犀草素可抑制VEGF誘導(dǎo)的血管生成,有助于抑制早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變的發(fā)病[17-18]。表兒茶素顯著減少高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞ARPE-19細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生,并減少細(xì)胞凋亡和炎癥相關(guān)因素[19]?;ㄉ南┧岬亩喾N代謝產(chǎn)物被證實(shí)與DR期間的微血管功能障礙有關(guān)[20-21];黃柏酮可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和凋亡[22]等。

    骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)是PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出的核心靶點(diǎn)之一。研究表明,BMP2的水平在DR患者和DR小鼠視網(wǎng)膜中升高,破壞了內(nèi)皮屏障功能,上調(diào)視網(wǎng)膜中VEGF水平,誘導(dǎo)內(nèi)皮-白細(xì)胞黏附并上調(diào)炎癥標(biāo)志物和細(xì)胞因子,如細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-8(IL-8)[23-24]。類固醇激素受體輔激活子(SRC)在細(xì)胞增殖,分化等細(xì)胞進(jìn)程中發(fā)揮重要作用,可以直接與VE-鈣黏蛋白結(jié)合,從而調(diào)節(jié)VE-鈣黏蛋白酪氨酸磷酸化和內(nèi)皮通透性[25]。纖維連接蛋白1(FN1)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、遷移或腫瘤轉(zhuǎn)移等,研究表明,纖維連接蛋白在視網(wǎng)膜血管化活動區(qū)中上調(diào),并可能參與DR中病理性血管的生成[26-27]。

    GO富集分析結(jié)果表明,糖網(wǎng)明目顆粒治療DR機(jī)制主要涉及的關(guān)鍵生物過程包括凋亡過程的負(fù)調(diào)控,細(xì)胞增殖的正調(diào)控,RNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控等,分子功能涉及蛋白質(zhì)結(jié)合,受體結(jié)合,激酶活性等方面。KEGG富集分析說明,糖網(wǎng)明目顆粒的主要活性成分可能是通過介導(dǎo)AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、內(nèi)分泌抵抗、FoxO信號通路、IL-17信號通路等途徑來治療DR。其中AGE-RAGE信號通路可激活蛋白激酶C(PKC)和MAPKs等多個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號通路,導(dǎo)致細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)激活,促進(jìn)多種促炎細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-1(IL-1),IL-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達(dá),可引起視網(wǎng)膜毛細(xì)血管細(xì)胞凋亡,血管通透性增加,破壞血-視網(wǎng)膜屏障,促進(jìn)DR的發(fā)展[28-30]。研究顯示,AGEs可以通過RAGE/Src/ERK信號通路發(fā)揮血管生成作用,激活的SRC參與引起內(nèi)皮細(xì)胞存活和血管生成刺激的信號通路,表明SRC可能是預(yù)防和治療AGEs相關(guān)微血管病變的合適靶點(diǎn)[31]。AGEs還可導(dǎo)致DR中的病理性血管生成,提示AGE是糖網(wǎng)明目顆粒治療DR的靶點(diǎn)[32],此推測需要通過體內(nèi)外研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

    分子對接結(jié)果表明,糖網(wǎng)明目顆粒中木犀草素、金合歡素等活性成分與EGFR、BMP2、MAPK1、MAPK14等靶點(diǎn)具有良好的結(jié)合作用,能夠與氨基酸形成較強(qiáng)的氫鍵相互作用。該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選結(jié)果,表明糖網(wǎng)明目顆粒治療DR的主要作用機(jī)制在于木犀草素、金合歡素、表兒茶素等活性成分通過 EGFR、BMP2、MAPK1、MAPK14等靶點(diǎn)對腫瘤壞死因子、FoxO等信號通路進(jìn)行調(diào)控,從而參與DR的治療過程。

    上述結(jié)果在細(xì)胞模型中進(jìn)行了驗(yàn)證。高糖環(huán)境刺激Y79細(xì)胞可增加EGFR、MAPK14蛋白表達(dá),而糖網(wǎng)明目顆粒有效抑制了EGFR和MAPK14蛋白表達(dá)。MAPK14是MAP激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要組成部分,MAPK信號通路與TNF信號通路相關(guān)聯(lián);EGFR則會激活下游的PI3激酶(PI3K)-絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)、轉(zhuǎn)錄活化因子(STATs)等模塊[33],涉及到炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖與凋亡、氧化應(yīng)激等。該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了糖網(wǎng)明目顆粒治療DR的作用機(jī)制。但是,本研究僅通過數(shù)據(jù)挖掘?qū)μ蔷W(wǎng)明目顆粒治療DR的機(jī)制進(jìn)行了預(yù)測以及簡單驗(yàn)證,仍然存在局限性,尚需要進(jìn)行基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)深入研究。

    4 結(jié)論

    本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法篩選糖網(wǎng)明目顆粒中的有效成分和治療DR的作用靶點(diǎn),繼而以細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對所預(yù)測機(jī)制中的相關(guān)蛋白進(jìn)行檢驗(yàn),結(jié)果表明糖網(wǎng)明目顆粒有效抑制了EGFR和MAPK14蛋白表達(dá)。推測糖網(wǎng)明目顆粒通過參與調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激,炎癥反應(yīng),細(xì)胞增殖和凋亡等生物過程,達(dá)到對DR的治療作用。本研究充分體現(xiàn)了糖網(wǎng)明目顆粒治療DR具有多成分,多靶點(diǎn),多途徑協(xié)同發(fā)揮藥效的特點(diǎn),為糖網(wǎng)明目顆粒對DR的治療及后續(xù)深入研發(fā)提供指導(dǎo)與依據(jù)。

    猜你喜歡
    明目靶點(diǎn)通路
    明目養(yǎng)胃食薺菜
    中老年保健(2022年3期)2022-11-21 09:40:36
    清心明目上清丸中9種成分的含量測定
    維生素D受體或是糖尿病治療的新靶點(diǎn)
    中老年保健(2021年3期)2021-12-03 02:32:25
    腫瘤免疫治療發(fā)現(xiàn)新潛在靶點(diǎn)
    UPLC-Q-TOF法分析雙丹明目膠囊化學(xué)成分
    中成藥(2017年7期)2017-11-22 07:34:05
    UPLC-Q-TOF-MS法分析雙丹明目膠囊入血成分
    中成藥(2017年10期)2017-11-16 00:50:42
    Kisspeptin/GPR54信號通路促使性早熟形成的作用觀察
    心力衰竭的分子重構(gòu)機(jī)制及其潛在的治療靶點(diǎn)
    proBDNF-p75NTR通路抑制C6細(xì)胞增殖
    通路快建林翰:對重模式應(yīng)有再認(rèn)識
    男人操女人黄网站| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 黄色女人牲交| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产单亲对白刺激| 久久精品国产综合久久久| 久久精品91蜜桃| 国产高清激情床上av| 99国产综合亚洲精品| 女警被强在线播放| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 欧美黄色淫秽网站| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产欧美日韩一区二区三| cao死你这个sao货| 欧美另类亚洲清纯唯美| www日本在线高清视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 久久久水蜜桃国产精品网| 大香蕉久久成人网| 欧美一级a爱片免费观看看 | 中出人妻视频一区二区| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产成人系列免费观看| а√天堂www在线а√下载| 精品无人区乱码1区二区| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲成人久久性| 亚洲男人天堂网一区| 麻豆av在线久日| 亚洲男人的天堂狠狠| 国产精品一区二区在线不卡| 国产精品99久久99久久久不卡| 欧美在线黄色| 母亲3免费完整高清在线观看| 少妇的丰满在线观看| 在线观看舔阴道视频| 日韩免费av在线播放| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 丝袜人妻中文字幕| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 成在线人永久免费视频| 国产97色在线日韩免费| 午夜福利影视在线免费观看| 在线视频色国产色| 狠狠狠狠99中文字幕| 欧美黄色淫秽网站| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 大型黄色视频在线免费观看| 免费看美女性在线毛片视频| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 精品久久久精品久久久| 美女大奶头视频| 国产亚洲精品久久久久5区| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 日本黄色视频三级网站网址| 欧美激情 高清一区二区三区| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 免费高清视频大片| 99精品久久久久人妻精品| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国语自产精品视频在线第100页| 美女免费视频网站| 午夜精品国产一区二区电影| 99热只有精品国产| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 一区二区三区激情视频| 淫秽高清视频在线观看| 国产区一区二久久| 久久国产精品影院| 天堂动漫精品| 国内精品久久久久久久电影| 亚洲国产精品合色在线| 国产91精品成人一区二区三区| 亚洲精品久久国产高清桃花| 天堂影院成人在线观看| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 国产亚洲欧美98| 国产精品亚洲美女久久久| 午夜福利18| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 在线播放国产精品三级| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 免费观看人在逋| 久久久久国产一级毛片高清牌| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 久久国产精品男人的天堂亚洲| а√天堂www在线а√下载| 成人三级做爰电影| 精品国产亚洲在线| 久久久精品欧美日韩精品| 国产区一区二久久| 欧美激情久久久久久爽电影 | 欧美最黄视频在线播放免费| 波多野结衣av一区二区av| 精品免费久久久久久久清纯| 国产人伦9x9x在线观看| 精品国产亚洲在线| 久久久国产精品麻豆| 女人精品久久久久毛片| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲人成伊人成综合网2020| 美女国产高潮福利片在线看| 99精品欧美一区二区三区四区| 好男人在线观看高清免费视频 | 91字幕亚洲| 成在线人永久免费视频| 国产精品永久免费网站| 丝袜在线中文字幕| 男女之事视频高清在线观看| 久久人妻av系列| 亚洲精品中文字幕在线视频| 成在线人永久免费视频| 成人亚洲精品av一区二区| 国产精品1区2区在线观看.| 岛国视频午夜一区免费看| 在线观看日韩欧美| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产精品久久久人人做人人爽| 老司机午夜福利在线观看视频| 在线观看舔阴道视频| www.www免费av| 欧美一级a爱片免费观看看 | 黄频高清免费视频| 老司机午夜十八禁免费视频| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 日韩欧美一区二区三区在线观看| xxx96com| av中文乱码字幕在线| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产亚洲欧美精品永久| 一进一出抽搐gif免费好疼| 午夜福利免费观看在线| 日韩欧美在线二视频| 亚洲国产高清在线一区二区三 | av电影中文网址| 日韩高清综合在线| 亚洲av片天天在线观看| 国产免费av片在线观看野外av| 国产色视频综合| 免费看a级黄色片| 亚洲av熟女| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲精品一区av在线观看| 国产片内射在线| 亚洲午夜理论影院| 亚洲视频免费观看视频| 十分钟在线观看高清视频www| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 国产一区二区三区综合在线观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 天天添夜夜摸| 国产精品一区二区在线不卡| 色在线成人网| 好男人在线观看高清免费视频 | 亚洲自拍偷在线| av视频免费观看在线观看| 亚洲精华国产精华精| 日日夜夜操网爽| 久久香蕉国产精品| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产乱人伦免费视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 老司机午夜福利在线观看视频| 国产亚洲av高清不卡| 成人免费观看视频高清| 成人18禁在线播放| 国产精品影院久久| 视频在线观看一区二区三区| 国产精品亚洲美女久久久| 色综合亚洲欧美另类图片| 99香蕉大伊视频| 成人永久免费在线观看视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲avbb在线观看| 亚洲 国产 在线| 久久人妻熟女aⅴ| 久久国产精品人妻蜜桃| 神马国产精品三级电影在线观看 | 大陆偷拍与自拍| 欧美国产日韩亚洲一区| 国产精品影院久久| 欧美乱妇无乱码| 久久精品国产综合久久久| 国产av一区二区精品久久| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲色图av天堂| 国产欧美日韩精品亚洲av| 首页视频小说图片口味搜索| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 男女之事视频高清在线观看| 麻豆一二三区av精品| 老司机福利观看| 欧美乱码精品一区二区三区| 嫁个100分男人电影在线观看| 一级毛片女人18水好多| 啦啦啦免费观看视频1| 中国美女看黄片| 欧美日韩黄片免| 色综合婷婷激情| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲国产看品久久| av天堂在线播放| www国产在线视频色| 亚洲中文av在线| 色精品久久人妻99蜜桃| 免费观看人在逋| 男人的好看免费观看在线视频 | 欧美日韩精品网址| 亚洲成人免费电影在线观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 丁香欧美五月| 久久中文看片网| 午夜福利,免费看| 日本免费a在线| 免费看美女性在线毛片视频| 久久久久国内视频| 99在线视频只有这里精品首页| 国产精品 国内视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 97人妻天天添夜夜摸| 在线观看免费视频日本深夜| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲,欧美精品.| 日日干狠狠操夜夜爽| 精品无人区乱码1区二区| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲专区字幕在线| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产精品一区二区免费欧美| 国产精品一区二区精品视频观看| 一二三四在线观看免费中文在| 欧美+亚洲+日韩+国产| 黄色视频不卡| 午夜免费激情av| 午夜成年电影在线免费观看| 曰老女人黄片| 在线观看免费视频网站a站| 欧美成人性av电影在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 欧美一级毛片孕妇| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 两个人看的免费小视频| 淫妇啪啪啪对白视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 男人舔女人的私密视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| 久久九九热精品免费| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 国产99白浆流出| 久久人妻熟女aⅴ| 午夜免费鲁丝| 国产真人三级小视频在线观看| 久久久国产成人免费| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产三级黄色录像| 人人澡人人妻人| 午夜a级毛片| 免费不卡黄色视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 色播在线永久视频| 天堂√8在线中文| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产精品免费视频内射| 亚洲七黄色美女视频| 国内精品久久久久精免费| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 久久这里只有精品19| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 又紧又爽又黄一区二区| 99国产综合亚洲精品| 亚洲五月天丁香| 狂野欧美激情性xxxx| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲av熟女| 久久久久久久久中文| 深夜精品福利| 级片在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 97碰自拍视频| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲精品在线美女| 日韩高清综合在线| 一二三四在线观看免费中文在| 国产伦人伦偷精品视频| 成人精品一区二区免费| 99在线人妻在线中文字幕| √禁漫天堂资源中文www| 国产男靠女视频免费网站| 欧美成狂野欧美在线观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 美女扒开内裤让男人捅视频| 免费少妇av软件| 可以在线观看的亚洲视频| 国产精品1区2区在线观看.| 大陆偷拍与自拍| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲国产看品久久| 99久久综合精品五月天人人| 国产男靠女视频免费网站| 中国美女看黄片| 99国产精品一区二区三区| 成人亚洲精品一区在线观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 久久这里只有精品19| 午夜视频精品福利| 麻豆国产av国片精品| 国产精品98久久久久久宅男小说| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 麻豆国产av国片精品| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲九九香蕉| 国产亚洲精品av在线| 国产午夜精品久久久久久| 欧美久久黑人一区二区| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产精品久久电影中文字幕| 日韩精品免费视频一区二区三区| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 日本五十路高清| 日韩有码中文字幕| 精品电影一区二区在线| 亚洲人成电影免费在线| ponron亚洲| 午夜精品在线福利| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲人成电影观看| 亚洲熟女毛片儿| 色精品久久人妻99蜜桃| 女同久久另类99精品国产91| 久久久久国内视频| 激情视频va一区二区三区| 18美女黄网站色大片免费观看| 欧美激情久久久久久爽电影 | 午夜两性在线视频| 99riav亚洲国产免费| 国产精品一区二区精品视频观看| 免费看十八禁软件| 激情视频va一区二区三区| 国产成人影院久久av| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 国产免费男女视频| 精品免费久久久久久久清纯| 天天一区二区日本电影三级 | 久久久久久免费高清国产稀缺| 桃红色精品国产亚洲av| 久久香蕉精品热| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 亚洲专区字幕在线| 满18在线观看网站| 欧美性长视频在线观看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产亚洲精品久久久久5区| 韩国av一区二区三区四区| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产成+人综合+亚洲专区| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产高清视频在线播放一区| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国产区一区二久久| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 久99久视频精品免费| 国产午夜福利久久久久久| 午夜免费激情av| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲国产精品成人综合色| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产成人精品久久二区二区91| 日韩国内少妇激情av| av视频在线观看入口| 欧美精品啪啪一区二区三区| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲av熟女| 日日爽夜夜爽网站| 欧美激情极品国产一区二区三区| 9191精品国产免费久久| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 亚洲成国产人片在线观看| 91成人精品电影| 国产97色在线日韩免费| 在线观看一区二区三区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 久久久久精品国产欧美久久久| 在线观看一区二区三区| 国产精品一区二区在线不卡| 天堂√8在线中文| 看片在线看免费视频| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产一卡二卡三卡精品| 午夜成年电影在线免费观看| 久久人人精品亚洲av| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产精品一区二区三区四区久久 | 一级a爱片免费观看的视频| 日韩有码中文字幕| 亚洲欧美激情在线| 午夜福利免费观看在线| 国内精品久久久久久久电影| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 成人三级做爰电影| 久久久久亚洲av毛片大全| 欧美在线一区亚洲| 麻豆一二三区av精品| 美女午夜性视频免费| 国产1区2区3区精品| 1024香蕉在线观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 亚洲最大成人中文| 最近最新免费中文字幕在线| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 搡老岳熟女国产| 久久伊人香网站| 国产私拍福利视频在线观看| 国产99久久九九免费精品| 成人免费观看视频高清| 国产伦一二天堂av在线观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 妹子高潮喷水视频| 美女 人体艺术 gogo| 男女午夜视频在线观看| 在线观看日韩欧美| 在线观看免费视频日本深夜| 久久香蕉激情| 无遮挡黄片免费观看| 午夜久久久在线观看| 99热只有精品国产| 99国产精品99久久久久| 欧美成人性av电影在线观看| 一区二区三区激情视频| 日本一区二区免费在线视频| 日本欧美视频一区| 级片在线观看| 视频区欧美日本亚洲| 成人永久免费在线观看视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 欧美成人午夜精品| 热99re8久久精品国产| 亚洲美女黄片视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 欧美日本中文国产一区发布| 国产熟女xx| 亚洲av熟女| 成人特级黄色片久久久久久久| 一进一出抽搐动态| 国产又色又爽无遮挡免费看| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲人成77777在线视频| 日韩国内少妇激情av| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲 国产 在线| 亚洲成国产人片在线观看| 国产精品久久久人人做人人爽| 精品一区二区三区av网在线观看| 俄罗斯特黄特色一大片| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 制服诱惑二区| 精品久久久久久,| 久久久久精品国产欧美久久久| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 又黄又粗又硬又大视频| 视频在线观看一区二区三区| 久久久久久人人人人人| 老司机福利观看| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲黑人精品在线| 久久久久久人人人人人| 人妻久久中文字幕网| 宅男免费午夜| 久久久久久久久中文| 69av精品久久久久久| 日本黄色视频三级网站网址| 久久这里只有精品19| 亚洲片人在线观看| 免费观看精品视频网站| 91av网站免费观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 老司机午夜十八禁免费视频| 少妇被粗大的猛进出69影院| 丁香六月欧美| 最近最新中文字幕大全免费视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 中出人妻视频一区二区| 亚洲久久久国产精品| 在线观看舔阴道视频| 夜夜爽天天搞| 大型黄色视频在线免费观看| 成人亚洲精品av一区二区| 免费高清视频大片| www日本在线高清视频| 大香蕉久久成人网| av中文乱码字幕在线| 日韩欧美在线二视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产免费男女视频| 成年人黄色毛片网站| 亚洲欧美日韩无卡精品| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产亚洲精品久久久久5区| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲激情在线av| 国产亚洲精品av在线| 免费看十八禁软件| 国产男靠女视频免费网站| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲九九香蕉| 久久久久久免费高清国产稀缺| 欧美中文日本在线观看视频| 国产精品二区激情视频| 无限看片的www在线观看| 大香蕉久久成人网| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 日韩欧美免费精品| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 久久草成人影院| 亚洲,欧美精品.| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产成人系列免费观看| 亚洲在线自拍视频| 最近最新中文字幕大全免费视频| ponron亚洲| 日本三级黄在线观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 在线观看免费视频日本深夜| 女人精品久久久久毛片| 99精品欧美一区二区三区四区| 一本综合久久免费| 国产av又大| av在线播放免费不卡| 成人18禁在线播放| 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲成a人片在线一区二区| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 波多野结衣av一区二区av| aaaaa片日本免费| 神马国产精品三级电影在线观看 | 欧美一区二区精品小视频在线| 三级毛片av免费| 久久国产乱子伦精品免费另类| 中出人妻视频一区二区| 婷婷六月久久综合丁香| 伦理电影免费视频| 国产91精品成人一区二区三区| 亚洲在线自拍视频| 久久久久久大精品| 香蕉久久夜色| av视频在线观看入口| 精品不卡国产一区二区三区| 欧美色视频一区免费| 97碰自拍视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 一区福利在线观看| 久久影院123| www.999成人在线观看| 看免费av毛片| 久久久久久大精品| 欧美性长视频在线观看| 在线观看日韩欧美| 精品国产美女av久久久久小说| 在线观看舔阴道视频| tocl精华| 男女下面进入的视频免费午夜 | 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲视频免费观看视频| 99国产精品一区二区三区| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产一卡二卡三卡精品| www日本在线高清视频| 无人区码免费观看不卡| 久久天堂一区二区三区四区| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 无人区码免费观看不卡| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 手机成人av网站| 精品无人区乱码1区二区| 日本精品一区二区三区蜜桃| 又黄又爽又免费观看的视频| 很黄的视频免费| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 日本vs欧美在线观看视频| 99国产精品免费福利视频| 成年版毛片免费区| 老司机午夜十八禁免费视频| 免费高清视频大片| 精品不卡国产一区二区三区|