基于脂質(zhì)代謝組學(xué)研究芪參益氣滴丸保護高脂血癥心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌損傷的機制*

趙聰娜，羅洋，馮利民

（1．天津市北辰區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，天津 300400；2．天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300250）

隨著人們生活方式和飲食習慣的變化，缺血性心腦血管疾病發(fā)病率呈逐年增高的趨勢，其中急性心肌梗死的防治一直是醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點，雖然經(jīng)皮冠狀動脈介入治療可迅速恢復(fù)心肌血氧供應(yīng)，但常伴隨著心肌缺血再灌注損傷[1]，目前尚無很好的治療策略。芪參益氣滴丸主要由黃芪、丹參、三七、降香油等組成，用于治療氣虛血瘀型胸痹，研究報道其對心肌梗死及其再灌注有明顯療效[2]，人們對其作用機制也進行了較為系統(tǒng)的研究[3]。然而冠心病常伴有高血脂狀態(tài)，該狀態(tài)下伴發(fā)的心肌組織脂質(zhì)代謝異常與心肌缺血再灌注損傷密切相關(guān)[4]，目前尚缺少芪參益氣滴丸對心肌缺血再灌注脂質(zhì)代謝影響的相關(guān)研究。本研究擬利用高脂血癥心肌缺血再灌注損傷大鼠模型，考察芪參益氣滴丸對心肌缺血再灌注損傷大鼠脂質(zhì)代謝的影響，以期為進一步明確芪參益氣滴丸的藥效特點及機制提供一定線索。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 雄性清潔級SD大鼠，體質(zhì)量220～250 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號SCXK（京）2016-0002。

1.2 藥物與試劑 芪參益氣滴丸由天津天士力制藥集團股份有限公司提供（批號：181110）；高脂飼料購于北京華阜康生物科技股份有限公司（批號：H10060）；CK、LDH、低密度脂蛋白（LDL）、總膽固醇（TC）以及高密度脂蛋白（HDL）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所（批號：20190604、20190528、20190528、20190610、20190605）。

1.3 實驗儀器 Q-Exactive Plus質(zhì)譜儀（Thermo Scientific）；UHPLC Nexera LC-30A超高效液相色譜儀（SHIMADZU）；色譜柱（Waters，ACQUITY UPLC CSH C18，1．7 μm，2．1 mm×100 mm）。

2 實驗方法

2.1 心肌缺血再灌注損傷模型的復(fù)制及動物分組給藥 所有實驗大鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，給予高脂飼料喂養(yǎng)以復(fù)制高血脂癥大鼠模型，實驗設(shè)置假手術(shù)組（Sham組）、模型組（Mod組）、芪參益氣滴丸低、中、高（QSYQL 組 62．5mg/kg，QSYQM 組 135mg/kg，QSYQH組270 mg/kg）劑量組，其中中劑量為等效劑量系數(shù)折算法換算所得臨床等效劑量。藥物治療組每日灌胃給予不同劑量芪參益氣滴丸，假手術(shù)組和模型組灌胃等體積蒸餾水，高脂飼料喂養(yǎng)2周時開始給藥干預(yù)，同時繼續(xù)高脂飲食飼養(yǎng)1周后，采用結(jié)扎冠狀動脈左前降支的方法復(fù)制心肌缺血再灌注模型：手術(shù)當日給藥1 h后，麻醉并仰臥位固定，在胸骨左緣0．5 cm處橫向剪開胸部皮膚，沿第四、五肋間開胸，鈍性分離胸肌，在左心耳和動脈圓錐之間，左前降支起始部位以下3～4 mm處以7．0帶線縫合針結(jié)扎冠狀動脈左前降支，逐層縫合，術(shù)后5 min采用生理記錄儀檢測大鼠心電圖，以ST段顯著上升或降低確定模型成功。剔除不成模動物，每組保留8只，假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。于冠狀動脈結(jié)扎1 h后再灌注，再灌注3 h后深度麻醉，取材。

2.2 血清心肌酶及血脂檢測 再灌注3 h后，麻醉實驗動物并腹主動脈取血，室溫靜置30 min后采用低溫離心機（離心半徑13．5 cm）3 000 rpm離心15 min，取上層血清，于-80℃保存?zhèn)溆?。按照試劑盒說明書步驟，檢測各組大鼠血清心肌損傷指標CK和 LDH 含量以及血脂（LDL、TC、HDL）水平。

2.3 心肌缺血面積檢測 腹主動脈取血后，取心臟組織，生理鹽水清洗，去除心房，于結(jié)扎線下沿心臟橫軸將心臟平均切成5片，放入1% TTC，37℃避光孵育10 min左右染色，正常心肌顏色為紅色，缺血心肌為白色，根據(jù)染色結(jié)果用圖像分析軟件計算心肌缺血面積占心肌總面積百分比，評價芪參益氣滴丸對心肌缺血面積的影響。

2.4 心臟脂質(zhì)組學(xué)研究 1）心肌組織處理：每樣等量稱取30 mg心臟組織，加入200 μL水和800 μL甲基叔丁基醚（MTBE）渦旋混合，14 000×g 10℃離心15 min，全部取出上層有機相，氮氣吹干，質(zhì)譜分析時加入 200 μL 90%異丙醇/乙腈溶液復(fù)溶，14 000×g 10℃離心15 min，取2 μL上清進樣分析。2）色譜條件：樣品采用 UHPLC Nexera LC-30A超高效液相色譜系統(tǒng)進行分離，柱溫30℃，流速0．3 mL/min。流動相組成A：10 mM甲酸銨乙腈水溶液（乙腈∶水=6∶4，V/V）；B：10 mmol/L 甲酸銨乙腈異丙醇溶液（乙腈∶異丙醇=1∶9，V/V），梯度洗脫。3）質(zhì)譜條件：分別采用電噴霧電離（ESI）正離子和負離子模式進行檢測，樣品經(jīng)UHPLC分離后采用Q Exactive plus質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析。正離子MS1掃描 m/z范圍：200～1 800 Da，加熱溫度：300℃，鞘氣流速：45 arb，輔助氣流：15 arb，吹掃氣流：1 arb，透鏡電壓：50%，噴霧電壓：3．0 kV。負離子MS1掃描m/z范圍：250～1 800 Da，加熱溫度300℃，鞘氣流速：45 arb，吹掃氣流：1 arb，透鏡電壓：60%，噴霧電壓2．5 kV。4）數(shù)據(jù)處理：采用 LipidSearch軟件（Thermo Scientific，4．1版本）進行峰識別、脂質(zhì)鑒定、峰提取、峰對齊以及定量等處理。提取得到的數(shù)據(jù)，刪除RSD＞30%的脂質(zhì)分子。對LipidSearch提取得到的數(shù)據(jù)，刪除組內(nèi)缺失值＞50%的脂質(zhì)分子，對數(shù)據(jù)進行總峰面積歸一化。將得到的包含保留時間、質(zhì)荷比、樣品名稱和峰面積的數(shù)據(jù)矩陣輸入SIMCA-P 13．0軟件，進行最小二乘判別分析（PLSDA）的多元統(tǒng)計分析。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17．0統(tǒng)計軟件進行處理，實驗結(jié)果以均數(shù)±標椎差（±s）表示，采用單因素方差分析組間差異，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 芪參益氣滴丸保護高脂血癥心肌缺血再灌注大鼠心肌損傷 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒檢測了血清中心肌損傷相關(guān)酶CK和LDH含量，結(jié)果如表1所示，與Sham組相比，Mod組大鼠血清CK和 LDH 明顯升高（P＜0．05），梗死面積較為明顯。而與Mod組相比，QSYQL和QSYQM組大鼠血清中CK 水平顯著降低（P＜0．05），LDH 有降低趨勢（P＞0．05），QSYQM 組梗死面積顯著減?。≒＜0．05），提示芪參益氣滴丸具有保護高脂血癥缺血再灌注心肌損傷的作用。

表1 芪參益氣滴丸對缺血再灌注大鼠心肌保護作用（±s）Tab.1 Protective effect of Qishen Yiqi Dropping Pills on myocardium in ischemia-reperfusion rats（±s）

表1 芪參益氣滴丸對缺血再灌注大鼠心肌保護作用（±s）Tab.1 Protective effect of Qishen Yiqi Dropping Pills on myocardium in ischemia-reperfusion rats（±s）

注：與 Sham 組相比，*P＜0．05，與 Mod 組相比，#P＜0．05。

組別 動物數(shù) C K（U/m L） L D H（m m o l/L） 梗塞面積（%）S h a m 組 8 2．1 3±0．2 0 8 0 4 1±1 6 8 3 -M o d 組 8 2．6 6±0．3 5* 9 9 1 7±1 1 8 4* 3 4．3± 7．4 Q S Y Q L 組 8 1．7 7±0．5 0# 9 1 8 4±1 9 2 7 3 3．3±1 0．7 Q S Y Q M 組 8 2．0 8±0．6 8# 9 3 1 8±1 8 4 4 2 0．2± 4．7#Q S Y S H 組 8 2．7 8±0．9 3 9 6 5 0±1 7 9 9 2 5．3±1 5．5

3.2 芪參益氣滴丸對高脂血癥心肌缺血再灌注大鼠血脂的影響 在明確芪參益氣滴丸具有保護高脂血癥心肌缺血再灌注大鼠心肌損傷作用的基礎(chǔ)上，采用ELISA試劑盒考察了芪參益氣滴丸對高脂血癥心肌缺血再灌注大鼠血清LDL、HDL以及TC的影響，結(jié)果如表2所示，與Sham組相比，Mod組大鼠血清 LDL、TC 顯著升高（P＜0．05），HDL 有降低趨勢（P＞0．05）；與 Mod組相比，QSYQ 組大鼠血清TC 顯著降低，治療各組 HDL 均顯著升高（P＜0．05），提示芪參益氣滴丸對高脂血癥心肌缺血再灌注大鼠血脂具有一定調(diào)節(jié)作用。

圖1 芪參益氣滴丸對模型大鼠梗塞面積的影響Fig.1 Effect of Qishen Yiqi Dropping Pills on the infarct area in model rats

表2 芪參益氣滴丸對高脂血癥心肌缺血再灌注大鼠血脂的影響（±s）Tab.2 Effect of Qishen Yiqi Dropping Pills on blood lipid of myocardial ischemia reperfusion in hyperlipidemia（±s）mmol/L

表2 芪參益氣滴丸對高脂血癥心肌缺血再灌注大鼠血脂的影響（±s）Tab.2 Effect of Qishen Yiqi Dropping Pills on blood lipid of myocardial ischemia reperfusion in hyperlipidemia（±s）mmol/L

注：與 Sham 組相比，*P＜0．05，與 Mod 組相比，#P＜0．05。

組別 動物數(shù) LDL HDL TC Sham 組 8 0．54±0．23 1．25±0．20 2．82±1．14 Mod 組 8 0．63±0．31* 1．02±0．18 3．32±1．95*QSYQL 組 8 0．71±0．18 1．26±0．30# 2．75±0．41 QSYQM 組 8 0．66±0．17 1．19±0．35 2．44±0．59#QSYSH 組 8 0．59±0．20 1．44±0．65# 2．40±0．33

3.3 芪參益氣滴丸對高脂血癥心肌缺血再灌注大鼠心臟脂質(zhì)成分及含量的影響 采用LipidSearch對正、負離子模式下得到的數(shù)據(jù)進行分析，共鑒定出脂質(zhì)亞類32種，脂質(zhì)分子1 141種（圖2A）。脂質(zhì)亞類相對含量分析結(jié)果顯示，與Sham組相比，Mod組大鼠心臟中神經(jīng)酰胺（Cer）、雙糖基神經(jīng)酰胺（CerG2）、糖基神經(jīng)酰胺（CerG2GNAc1）、輔酶（Co）、甘油二酯（DG）、磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PIP）、鞘氨醇（So）等含量顯著降低（P＜0．05），而脂肪酸（FA）、神經(jīng)節(jié)苷脂（GM3）、溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）、溶血磷脂酰絲氨酸（LPS）以及硫代異鼠李糖甘油二酯（SQDG）等亞類的含量顯著升高（P＜0．05）；而與 Mod 組相比，QSYQM 組大鼠心臟中 Cer、CerG2GNAc1、Co、LPC 以及 So 等亞類的含量顯著升高（P＜0．05）見圖2B-C，初步揭示芪參益氣滴丸具有改善高脂血癥心肌缺血再灌注大鼠心臟脂質(zhì)代謝紊亂的作用。

圖2 芪參益氣滴丸對心肌缺血再灌注大鼠心臟脂質(zhì)代謝的影響Fig.2 Effects of Qishen Yiqi Dropping Pills on cardiac lipid metabolism in myocardial ischemia-reperfusion rats

3.4 芪參益氣滴丸對高脂血癥心肌缺血再灌注大鼠心臟脂質(zhì)分子的影響 LS-DA分析顯示，各組樣本代謝譜分離度較高，提示組間脂質(zhì)代謝譜差異明顯（圖3A，C）。為了確保模型的可靠性，經(jīng)7次循環(huán)交互驗證以獲取模型的R2和Q2值。模型參數(shù)如下：R2Y（cum）=0．951，Q2（cum）=0．954，均大于0．5且接近于1，表明模型越穩(wěn)定可靠，充分提取了組間的差異信息，具有良好的解釋率和預(yù)測能力。為避免有監(jiān)督模型在建模過程中發(fā)生過擬合，使用置換檢驗通過隨機多次（n=200）改變分類變量Y的排列順序?qū)δＰ瓦M行檢驗以保證模型的有效性，置換檢驗參數(shù)R2Y（cum）=0．0，0．91，Q2（cum）=0．0，0．063，表明模型不存在過擬合現(xiàn)象（圖3B，D），模型可以很好地解釋各組樣本間的差異。

圖3 各組PLS-DA得分圖和置換檢驗擬合圖Fig.3 PLS-DA score plots and displacement test fit plots for each group

篩選差異性脂質(zhì)分子：根據(jù)PLS-DA模型得到的VIP來衡量各脂質(zhì)的表達模式對各組樣本分類判別的影響強度和解釋能力，挖掘具有生物學(xué)意義的差異脂質(zhì)。Mod組和Sham組篩選的差異性脂質(zhì)分子（P＜0．05，且 VIP＞1．0）共有 44 種，其中 4 種脂質(zhì)分子顯著升高[LPE（16∶0）、LPE（18∶1）、LPE（18∶0）、FA（22∶6），P＜0．05]，顯著降低的脂質(zhì)分子有 40 種，主要包括 15種 PE、4種 LPC、2種 Cer、14種 PC、3種SM、Co以及DG；QSYQM組和Mod組有差異脂質(zhì)分子 13種，包括 5種 PC、2種 LPC、3種 PE、Cer、LPE以及TG。其中芪參益氣滴丸治療后與Mod組出現(xiàn)顯著相反趨勢的脂質(zhì)分子有6種（P＜0．05，且VIP＞1．0），分別為 Cer（d18∶1/18∶0）+H、PE（16∶0p/22∶4）+H、PE（18∶2p/18∶2）+H、LPC（18∶0）+H、LPC（18∶0）+Na 以及 PC（16∶0/18∶1）+HCOO，提示芪參益氣滴丸通過調(diào)節(jié)心臟Cer、PE、LPC等脂質(zhì)分子發(fā)揮保護高脂血癥心肌缺血再灌注大鼠的心肌損傷。見圖4。

圖4 芪參益氣滴丸對高脂血癥心肌缺血再灌注大鼠心臟脂質(zhì)分子的影響Fig.4 Effect of Qishen Yiqi Dropping Pills on lipid molecules in cardiac ischemia reperfusion in rats with hyperlipidemia

4 討論

近年大量研究表明心肌組織脂質(zhì)代謝異常與心肌缺血再灌注損傷密切相關(guān)，急性心肌缺血缺氧狀態(tài)下導(dǎo)致心肌能量代謝由脂肪酸代謝而轉(zhuǎn)化為以葡萄糖代謝為主，從而加速了糖酵解，降低了細胞 pH 值、鉀（K+）外排、鈣（Ca2+）積累、腺苷形成、細胞腫脹和破裂、細胞凋亡和死亡[5]。再灌注復(fù)氧期間，當血流恢復(fù)時，氧氣水平也隨著再灌注而恢復(fù)，脂肪酸β-氧化迅速恢復(fù)，并成為線粒體氧化代謝的主要途徑[5-6]，葡萄糖氧化率的大幅降低。心臟脂肪酸β-氧化率總體增加，導(dǎo)致脂質(zhì)代謝異常，啟動并誘發(fā)各種代謝通路激活，加重心肌損傷[7]。芪參益氣滴丸是臨床常用于治療心肌梗死的有效藥物[8-10]，但缺少芪參益氣滴丸對心肌缺血再灌注脂質(zhì)代謝影響的相關(guān)研究。本研究模擬臨床高血脂狀態(tài)，從脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)角度進一步豐富完善了芪參益氣滴丸的現(xiàn)代作用機制，有利于更好的指導(dǎo)其臨床應(yīng)用。

本研究在證實芪參益氣滴丸改善心肌缺血再灌注損傷作用的基礎(chǔ)上，采用基于UPLC-Orbitrap質(zhì)譜系統(tǒng)的非靶向脂質(zhì)組學(xué)分析平臺對心肌缺血再灌注模型大鼠進行了心臟脂質(zhì)代謝譜及脂質(zhì)代謝標志物動態(tài)變化規(guī)律研究。通過脂質(zhì)亞類結(jié)果分析，初步明確了芪參益氣滴丸具有改善高脂血癥心肌缺血再灌注損傷大鼠心臟脂質(zhì)代謝的作用。進一步差異脂質(zhì)分子篩選結(jié)果顯示，芪參益氣滴丸可以降低模型組大鼠心肌組織脂肪酸FA（22∶6）-H水平，提示在心肌組織中脂肪酸氧化降低，脂質(zhì)堆積，而芪參益氣滴丸能夠減低心肌組織脂肪堆積。PC是細胞膜脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的主要成分，本實驗結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌組織4種LPC、14種PC含量顯著降低，其原因可能是在心肌缺血再灌注過程中，心肌細胞膜磷脂酰膽堿發(fā)生降解。而與模型組比較，芪參益氣滴丸治療組大鼠心臟中 LPC（18∶0）+H、LPC（18∶0）+Na、PC（39∶4）+H、PC（16∶0/18∶1）+HCOO 含量顯著升高，提示芪參益氣滴丸對心肌細胞膜脂質(zhì)降解具有改善作用。另外，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌組織2種神經(jīng)酰胺以及輔酶 Co（Q9）+H、DG（34∶2p）+H 含量顯著降低，提示在心肌缺血再灌注過程中脂質(zhì)代謝障礙不僅使脂肪酸進入β氧化減少，而且轉(zhuǎn)化成神經(jīng)酰胺及甘油二酯也出現(xiàn)障礙。與模型組比較芪參益氣滴丸治療組大鼠心臟 Co（Q9）+H、Cer（d18∶1/18∶0）+H 顯著升高，提示芪參益氣滴丸具有改善心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織中脂質(zhì)分子向神經(jīng)酰胺及甘油二酯轉(zhuǎn)化的作用。

綜上所述，本研究模擬臨床高血脂病理狀態(tài)，在明確芪參益氣滴丸改善心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌損傷作用的基礎(chǔ)上，采用脂質(zhì)代謝組學(xué)技術(shù)闡明了芪參益氣滴丸對心肌缺血再灌注損傷大鼠心臟脂質(zhì)代謝的影響，發(fā)現(xiàn)了芪參益氣滴丸通過改善心肌細胞膜脂質(zhì)降解以及脂質(zhì)分子向神經(jīng)酰胺及甘油二酯轉(zhuǎn)化的作用機制，進一步豐富了其保護心肌損傷的作用機制，同時為其臨床應(yīng)用提供了新依據(jù)。