腹主動(dòng)脈瘤特異性ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的篩選與構(gòu)建

霍金龍，吳浪，趙紀(jì)春，郭又銘，瞿銳，趙禮金

（1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 普通外科，貴州 遵義 563000；遵義市第一人民醫(yī)院/遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 2.乳甲中心 3.心臟血管外科，貴州 遵義 563000；4.四川大學(xué)華西醫(yī)院 血管外科，四川 成都 610043）

腹主動(dòng)脈瘤（abdominal aortic aneurysm，AAA）一般指腎動(dòng)脈下方的腹主動(dòng)脈呈瘤樣擴(kuò)張，通常直徑增大50%以上或直徑≥3 cm，是一種常見的、具有潛在致命性的血管退行性疾病，其特征是腹主動(dòng)脈（abdominal aorta，AA）壁變?nèi)酰S后逐漸擴(kuò)張，最終導(dǎo)致擴(kuò)張的動(dòng)脈破裂[1]。在老年男性（＞65 歲）和女性（＞60 歲）發(fā)病率分別約為8%、1.53%[2]，若發(fā)生破裂則致死率可達(dá)80%～90%[3-4]。AAA 形成的典型病理特征較為復(fù)雜，包括血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）表型轉(zhuǎn)換、VSMC 凋亡、炎癥細(xì)胞浸潤、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）重塑、強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激、內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，EC）功能障礙、腔內(nèi)血栓形成、主動(dòng)脈壁的惡化等[5]。目前具體發(fā)病機(jī)制不明，因此，闡明AAA 發(fā)病機(jī)制對疾病診斷、預(yù)測進(jìn)展、治療和預(yù)后具有重要的意義。

2011 年Salmena 等[6]在《Cell》上首次提出內(nèi)源性競爭RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）調(diào)控網(wǎng)絡(luò)概念，這是轉(zhuǎn)錄組中各RNA 相互間的新的調(diào)控模式，其認(rèn)為各RNA 共同構(gòu)成了一種復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)體系并處于動(dòng)態(tài)平衡，網(wǎng)絡(luò)中某一分子的表達(dá)上調(diào)或下調(diào)就會影響一系列的變化，最終這種動(dòng)態(tài)平衡被破壞，從而導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)相應(yīng)異常表現(xiàn)。在ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，微小RNA（miRNA）處于其核心地位，它是一種長度約為20 個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，通過堿基互補(bǔ)原則與靶基因結(jié)合來調(diào)控靶基因的表達(dá)[7]。調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，能與miRNA 競爭性結(jié)合調(diào)控靶基因表達(dá)水平的RNA 稱為ceRNA，常見的有長鏈非編碼RNA（lncRNA）、環(huán)狀RNA（circular RNA）。lncRNA 是長度＞200 個(gè)核苷酸的非編碼RNA[8]，具有表觀、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的潛力，并在生理過程中發(fā)揮重要作用[9]。lncRNA 的表達(dá)和調(diào)控在某些組織、細(xì)胞和疾病具有高度特異性，這使它們有希望成為新的治療干預(yù)點(diǎn)和生物候選標(biāo)志物[10-11]。研究表明lncRNA 參與了多種疾病的ceRNA 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，其作為上游分子競爭性與miRNA 結(jié)合，從而影響下游靶基因（即mRNA）的表達(dá)水平[12-14]，這 種lncRNA-miRNA-mRNA 網(wǎng)絡(luò)對疾病的發(fā)生發(fā)展起到關(guān)鍵的調(diào)控作用。因此，構(gòu)建ceRNA 網(wǎng)絡(luò)為探索疾病中尚未被鑒定的相關(guān)lncRNA 的功能提供了一個(gè)新的視角。

本研究結(jié)合基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（GEO 數(shù)據(jù)庫），選擇人的AAA 和AA 組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出AAA 和AA 的差異lncRNA（DElncRNA）和差異mRNA（DEmRNA），進(jìn)一步構(gòu)建了AAA 特異性基因診斷模型，通過預(yù)測與lncRNA 和mRNA 結(jié)合的miRNA，構(gòu)建了特異性基因診斷模型分子所參與的ceRNA 網(wǎng)絡(luò)。這不僅進(jìn)一步認(rèn)識AAA 的發(fā)病機(jī)制，而且為AAA 的診斷提供了新的分子標(biāo)記物及潛在的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 GEO數(shù)據(jù)集篩選及數(shù)據(jù)處理

從GEO 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中檢索關(guān)鍵詞“Abdominal Aortic Aneurysm”，閱讀數(shù)據(jù)集題目及摘要，選擇合適的數(shù)據(jù)集進(jìn)行后期分析。若有多個(gè)數(shù)據(jù)集則將合并數(shù)據(jù)去批次校正減少合并后數(shù)據(jù)誤差。

1.2 差異基因分析

基于生物信息學(xué)，利用R 語言對訓(xùn)練集中提取的基因進(jìn)行注釋，log fold chang（|logFC|）＞1 或＜-1，矯正后的P＜0.05 作為標(biāo)準(zhǔn)篩選DEmRNA；以矯正后的P＜0.05 作為標(biāo)準(zhǔn)篩選DElncRNA，并繪制差異基因的火山圖及熱圖，基因富集分析（GO 和KEGG）展示AAA 差異基因在細(xì)胞功能及信號通路上的區(qū)別。

1.3 AAA基因診斷模型構(gòu)建

利用Lasso 回歸對篩選的差異基因進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化分析，尋找診斷AAA 的最具有特征性的差異基因。

1.4 基因診斷模型中ceRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

首先通過Starbase 數(shù)據(jù)庫預(yù)測與之結(jié)合的miRNA；通過DElncRNA 預(yù)測與之結(jié)合的miRNA，兩者取交集，利用cytoscape 軟件構(gòu)建lncRNAmiRNA-mRNA 的ceRNA 網(wǎng)絡(luò)。利用cytoscape 中的cytoHubba 模塊尋找參與AAA 發(fā)展的關(guān)鍵ceRNA網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 篩選后的數(shù)據(jù)集

在GEO 數(shù)據(jù)庫檢索后共得到819 個(gè)AAA 相關(guān)數(shù)據(jù)集，最終經(jīng)篩選后獲得兩個(gè)數(shù)據(jù)集：GSE7084、GSE57691，將GSE7084 及GSE57691 兩數(shù)據(jù)集數(shù)據(jù)合并，共計(jì)AA 組18 例，AAA 組56 例。

2.2 差異基因分析

合并后的數(shù)據(jù)按|logFC|＞1，矯正后的P＜0.05，共篩選DEmRNA 114 個(gè)（上調(diào)基因34 個(gè)，下調(diào)基因80 個(gè)）（圖1）；基因GO 富集分析顯示，差異生物學(xué)功能主要體現(xiàn)肌肉系統(tǒng)過程（muscle system process）、抗氧化反應(yīng)（response to oxidative stress）、肌肉收縮（muscle contraction）等差別上；基因KEGG 富集分析顯示差異基因主要體現(xiàn)在脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化（lipid and atherosclerosis）、細(xì)胞因子受體相互作用（cytokine-cytokine receptor interaction）（圖2）；篩選到DElncRNA 13 個(gè)（上調(diào)9 個(gè)，下調(diào)4 個(gè)）（表1）。

表1 差異lncRNA列表Table 1 List of DElncRNAs

圖1 AAA與AA差異基因篩選（圖1A中綠色表示下調(diào)基因，紅色為上調(diào)基因，黑色無差異基因；圖1B中紅色為上調(diào)基因，藍(lán)色為下調(diào)基因） A：AAA與AA差異基因火山圖；B：AAA與AA差異基因熱圖Figure 1 Identification of the differentially expressed genes between AAA and AA (green color represents down-regulated genes,the red color represents up-regulated genes,and black color represents no difference genes in figure 1A;red color represents the up-regulated genes and blue color represents the down-regulated genes in figure 1B)A: Volcano map of differentially expressed genes between AAA and AA;B: Heat map of differentially expressed genes between AAA and AA

圖2 差異基因富集分析（顏色越紅代表差異越顯著，形狀越大表示在該分子功能上富集越顯著） A：GO 分析；B：KEGG 分析Figure 2 Enrichment analysis of the differentially expressed genes (the redder the color,the more significant the difference,and the larger the shape,the more significant of enrichment in the molecular function) A: GO analysis;B: KEGG analysis

2.3 基因診斷模型構(gòu)建

利用Lasso 回歸篩選差異基共得到17 個(gè)特異性基因模型（圖3、表2）。

表2 AAA的17個(gè)特異性基因診斷模型Table 2 17 specific gene diagnostic models of AAA

圖3 懲罰因素選擇的交叉驗(yàn)證Figure 3 Cross-validation for the choice of penalty factors

2.4 基因診斷模型相關(guān)ceRNA 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵ceRNA網(wǎng)絡(luò)

由17 個(gè)基因診斷模型構(gòu)建其參與到的ceRNA網(wǎng)絡(luò)（圖4A），利用cytoscape 中的cytoHubba 模塊尋找關(guān)鍵ceRNA 網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果提示，lncRNA HCP5-miR-27a/b-FOSB 可能是AAA 發(fā)生發(fā)展最為關(guān)鍵的ceRNA網(wǎng)絡(luò)（圖4B）。

圖4 基因診斷模型相關(guān)ceRNA 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵ceRNA 網(wǎng)絡(luò)分析（紅色代表上調(diào)的基因，藍(lán)色代表下調(diào)基因，綠色圓形為miRNA；方形為lncRNA，三角形為mRNA） A：AAA 特異性基因診斷模型參與的ceRNA 網(wǎng)絡(luò)；B：AAA 關(guān)鍵ceRNA網(wǎng)絡(luò)Figure 4 Establishment of ceRNA network involved in AAA-specific gene diagnosis model and analysis of key ceRNA network(red representing up-regulated genes,blue representing down-regulated genes,and green circles representing miRNAs;the square shapes representing lncRNAs,and the triangle representing mRNAs) A: The ceRNA network involved in AAA-specific gene diagnosis model;B: The key ceRNA network in AAA

3 討論

AAA 是一種常見的、具有潛在致命性的血管退行性疾病[1,15]。在AAA 破裂前患者常無臨床表現(xiàn)，老年患者中發(fā)病率及病死率較高[2-4]。病因較復(fù)雜，目前認(rèn)為其與動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系最為密切，遺傳因素、炎癥、免疫、血流動(dòng)力學(xué)等其他因素亦參與其中[16-18]。確切的致病機(jī)制上仍不明，充分了解AAA發(fā)生發(fā)展等相關(guān)的分子病理機(jī)制，不僅可用于疾病的早期診斷，同時(shí)也可能為治療提供新的方案。

lncRNA 作為一類長鏈非編碼的RNA 的總稱，據(jù)研究報(bào)道其參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[19-21]，且與某些疾病的預(yù)后有著密切的關(guān)系[22]。近年來，關(guān)于lncRNA 在AAA 的形成發(fā)展中的機(jī)制亦有諸多報(bào)道[23-26]，如缺氧誘發(fā)因子1α-AS1 是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)胸腹部主動(dòng)脈瘤的形成的lncRNA[27]；另外的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA GAS5 通過miR-185-5p/ADCY7 軸來影響血管平滑肌細(xì)胞的凋亡及炎癥反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)控AAA 的形成[26]；此外，Yang 等[28]采用測序數(shù)據(jù)識別了AAA 和正常腹主動(dòng)脈間3 688 個(gè)不同表達(dá)的lncRNA，從分子層面為后期AAA 的研究奠定了基礎(chǔ)，然而針對其分子作用及具體的機(jī)制卻未能做出明確的解釋。在本研究中，筆者借助生物信息學(xué)這一工具，分析了公共數(shù)據(jù)庫GEO 中AAA 和AA 之間的差異基因，按照|logFC|＞1，P＜0.05這一標(biāo)準(zhǔn)，總共篩選出DEmRNA 114 個(gè)，DElncRNA 13 個(gè)，通過GO 及Kegg 富集分析進(jìn)一步明確AAA 發(fā)生發(fā)展可能參與的重要的分子功能及信號通路，這同時(shí)也為AAA 后期基因?qū)用娴难芯刻峁┝酥匾睦碚摷皵?shù)據(jù)支持。

目前，國內(nèi)外期刊中關(guān)于AAA 中的特征性診斷基因的lncRNA 的模型研究較少[29-30]，僅一項(xiàng)研究通過熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）技術(shù)驗(yàn)證了lncRNA ENST00000566954、ENST00000580897和T181556 在AAA 與AA 之間的特異性表達(dá)；該項(xiàng)結(jié)論通過基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)獲得，結(jié)果可靠性較強(qiáng)，但研究者對其得出結(jié)論的過程卻未能給出詳細(xì)的描述[29]。在本研究中，筆者通過生物信息學(xué)手段篩選了114 個(gè)AAA 與AA 的DEmRNA，這些差異基因GO 和KEGG 富集分析顯示其差異主要體現(xiàn)在脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、細(xì)胞因子受體相互作用、IL-17信號通路等。既往研究對AAA 形成的病理方面的變化包括VSMC 表型轉(zhuǎn)換、VSMC 凋亡、炎癥細(xì)胞浸潤、ECM 重塑、強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激、EC 功能障礙、腔內(nèi)血栓形成、主動(dòng)脈壁的惡化等[5]。本研究所得富集分析結(jié)果顯示與既往認(rèn)識的AAA 的病理變化相類似，這也說明本研究篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性。為進(jìn)一步明確AAA 的特征性基因，筆者通過Lasso回歸篩選了17 個(gè)特異性的基因包括8 個(gè)上調(diào)基因，9 個(gè)下調(diào)基因，并構(gòu)建了其參與的ceRNA 網(wǎng)絡(luò)，最后揭示了lncRNA HCP5 可通過miRNA-27 來影響FOSB 的表達(dá)，同時(shí)也預(yù)測HCP5-miR27-FOSB 這條ceRNA 網(wǎng)絡(luò)在AAA 發(fā)生發(fā)展起到尤為特異且關(guān)鍵的作用。

HCP5 已被證實(shí)參與了多種惡性腫瘤及自身免疫性疾病的發(fā)生，異常表達(dá)的HCP5 和疾病的預(yù)后有密切的關(guān)系[30-32]，亦可作為胃癌早期診斷的潛在標(biāo)記物[33]，而在AAA 中的研究卻鮮有報(bào)道。miR-27，主要包括有miR-27a 和miR-27b 兩種，研究證實(shí)，其在血管內(nèi)皮細(xì)胞及高度血管化組織中富集，具有促血管生成的作用[34]。目前對FSOB 的研究未有實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展，僅作為診斷假肌源性血管內(nèi)皮瘤的一種有效標(biāo)志物[35-36]。而在本課題構(gòu)建的基因模型中，F(xiàn)OSB 在AAA 較AA 組基因表達(dá)差異性最大，加之目前尚無FOSB 在AAA 中的研究報(bào)道，這值得進(jìn)一步探究是否其參與到AAA 的形成及進(jìn)展。

本研究有以下幾點(diǎn)不足之處，其一，本研究來源于公共數(shù)據(jù)庫，雖為降低誤差筆者將兩個(gè)公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了合并分析，并做了批次化矯正，但并未在臨床中收集樣本做全基因測序來驗(yàn)證HCP5、miRNA-27 及FOSB 在AAA 中的表達(dá)情況。其二，未驗(yàn)證HCP5、miRNA-27 及FOSB 之間的動(dòng)態(tài)變化情況；如敲低HCP5 對miRNA-27 及FOSB 的影響及對血管平滑肌細(xì)胞凋亡的影響，在后期可開展基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步來驗(yàn)證。

綜上所述，本研究篩選的差異基因不僅從分子水平上揭示了AAA 發(fā)病機(jī)制，獲得的DEmRNA，可作為后期AAA 治療的潛在靶點(diǎn)，為AAA 的治療打開新的思路，這也將是未來精準(zhǔn)治療發(fā)展的一種趨勢。同時(shí)，診斷基因模型的構(gòu)建篩選出了AAA的特征性基因，為AAA 早期診斷提供了依據(jù)；最后，ceRNA 網(wǎng)絡(luò)HCP5-miR27-FOSB 可能在AAA 發(fā)生發(fā)展中起到尤為關(guān)鍵的作用，但這需要后續(xù)開展細(xì)胞、動(dòng)物、組織學(xué)層面來進(jìn)一步驗(yàn)證。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。