Fc段改造單克隆抗體在腫瘤治療中的應用

危彤，袁芃

（國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心/中國醫(yī)學科學院北京協和醫(yī)學院腫瘤醫(yī)院 特需醫(yī)療部，北京 100021）

在腫瘤治療中，相比于化療藥物，單克隆抗體因其能靶向到腫瘤組織的局部，從而大大降低對正常組織器官產生毒副作用，成為腫瘤治療的重要手段。單克隆抗體由位于兩臂末端的抗原結合片段（antigen-binding fragment，Fab）和結晶片段（crystalline fragment，Fc）組成。Fab 主要特異性識別腫瘤相關抗原，進而調控下游的信號通路，而Fc 段可以識別并結合表達Fc 受體的免疫細胞以及血液中的補體，發(fā)揮Fc 段效應功能。對Fc 段的改造，可影響Fc 段效應功能，從而改變單克隆抗體的生物活性。而相比于傳統單克隆抗體，經過Fc段工程化改造的單克隆抗體在許多腫瘤中展現出更好的抗腫瘤潛力，因而成為了當今腫瘤藥物研發(fā)的熱點。

1 治療性單克隆抗體研發(fā)歷程

1975 年，K?hler 等[1]開發(fā)出雜交瘤技術，為單克隆抗體的研發(fā)奠定了基礎，此技術在1984 年獲得諾貝爾醫(yī)學和生理學獎。在研究人員的不斷努力下，1986 年第一個鼠源性單克隆抗體藥物muromonab-CD3（orthoclone OKT3）在美國批準上市，但是該藥物為鼠源性，免疫源性強，導致藥物快速清除，而且IgE 抗體可能引起致命的過敏反應。基于此缺陷，借助細胞工程技術和基因工程技術，研究人員用人源性基因序列對鼠源性單克隆抗體的恒定區(qū)進行替換，制備出人-鼠嵌合抗體。此后，研究人員又使用人源互補決定簇堿基序列替換鼠源性序列，開發(fā)出人源性抗體，將單克隆抗體研發(fā)推進至人源化改造時期[2]。隨著生物技術的快速發(fā)展，單克隆抗體生產規(guī)模的急速擴大，生產技術也正在不斷完善，我國的抗體類新藥上市申請數量呈井噴式增長。大量研究通過對單克隆抗體進行Fc 段改造，調節(jié)抗體與免疫系統的相互作用，進一步提高疾病的治愈率。

2 Fc段作用機制

2.1 Fc段改造相關效應功能

目前臨床應用的單克隆抗體類藥物幾乎都屬于IgG 類。單克隆抗體的Fab 段介導特異性靶抗原結合，比如特異性識別腫瘤細胞表面的相關抗原（tumor-associated antigen，TAA），調控與該抗原相關的信號通路。而Fc 段可以識別并結合表達于免疫細胞表面的FcγR 以及血液中的補體，通過抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）、抗體依賴性細胞介導的吞噬作用（antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP）、補體依賴的細胞毒性作用（complement-dependent cytotoxicity，CDC）影響抗體半衰期等機制，影響抗體的生物活性，從而發(fā)揮一系列的生物學作用[3-5]。

作為Fc 段最為重要的效應功能之一，ADCC 效應指的是抗體的Fab 段結合腫瘤細胞的抗原表位，抗體Fc 段與NK 細胞、巨噬細胞等表面的FcγR 結合，介導殺傷細胞直接殺傷靶細胞的過程。

ADCP 效應，指抗體的Fab 段與相應的抗原表位結合，抗體的Fc 段與巨噬細胞或者中性粒細胞的Fc 受體結合，通過抗體的橋梁作用，促進吞噬細胞對細菌的吞噬，是治療性抗體作用于腫瘤細胞的機制之一。例如利妥昔單抗和其他抗CD20 抗體被認為在體外和體內的各種動物模型中都能引起有效的ADCP 效應[6]?；赟hields 等[7]的研究，通過在Fc 段的相關區(qū)域引入氨基酸突變，可增強ADCC 和ADCP 等效應。

CDC 效應，指的是補體參與的細胞毒作用，即通過特異性抗體與細胞膜表面相應抗原結合，形成復合物而激活補體經典途徑，所形成的膜攻擊復合體對靶細胞發(fā)揮裂解效應。研究[8]表明利妥昔單抗和奧法木單抗這兩個靶向CD20 的單克隆抗體在清除惡性B 細胞的過程中都發(fā)揮了CDC 效應。通過CDC 效應相關的氨基酸突變進行Fc 段改造，可增強CDC 效應。

Fc 段改造還可延長抗體在體內半衰期。FcRn是一種位于細胞膜表面的IgG 抗體受體，FcRn 可以和抗體的Fc 段結合，阻止抗體被溶酶體裂解，可以起到延長抗體在體內半衰期的作用[9]。通過相關的氨基酸突變進行Fc 段改造，可以增加Fc 段與FcRn 在細胞內的結合，或者減少Fc 段和FcRn 結合的解離，達到增加半衰期的目的[6]。臨床前研究[10]顯示，經Fc 段工程改造的西妥昔單抗和貝伐珠單抗的半衰期明顯優(yōu)于未改造的單抗，從而延長了作用時間。

雖然Fc 段改造作用的機制較多，但是目前臨床上以增強Fc 段效應功能為目的的抗體Fc 段改造的應用最為廣泛，主要是通過增強與FcγR 親和力，提升ADCC 效應，故本文著重介紹與ADCC 效應相關的單克隆抗體Fc 段改造。ADCC 效應主要由NK 細胞介導[11]，NK 細胞通過激活性FcγR 與抗體的Fc 段結合，激活NK 細胞并刺激穿孔素和顆粒酶等分子的釋放，最終導致靶細胞裂解（圖1）[12]。許多臨床相關的單克隆抗體類腫瘤藥物，如曲妥珠單抗和馬吉妥昔單抗等，均通過誘發(fā)ADCC 效應殺傷腫瘤細胞[13]。

圖1 ADCC作用機制示意圖Figure 1 Schematic illustration of the mechanism of ADCC

2.2 FcγR相關介紹

人體可產生6 種FcγR：FcγRI（CD64）、FcγRⅡ（CD32，包括FcγRⅡA、FcγRⅡB、FcγRⅡC）、FcγRⅢ（CD16，包括FcγRⅢA 和FcγRⅢB）[14]，它們均能夠結合IgG，但親和力大小不同。FcγR在功能上分為兩種類型：激活性FcγR 和抑制性FcγR。激活性FcγR（FcγRI、FcγRⅡA、FcγRⅡC、FcγR ⅢA）與免疫酪氨酸激活基序（immune tyrosine activation motif，ITAM）相關。在人類兩種激活受體（FcγRⅡA 和FcγRⅡC）中，ITAM 包含在FcγR 本身的胞質結構域內，而在其余激活受體上，ITAM 包含在相關的FcγR 中。FcγRⅡB 包含免疫酪氨酸抑制基序（immune tyrosine inhibitory motif，ITIM），是人類中唯一的抑制性FcγR。

由于大多數免疫細胞同時表達激活性和抑制性FcγR，抗體與FcγR 結合后發(fā)揮的Fc 段效應功能是與激活性和抑制性FcγR 結合的綜合結果，因此將抗體對FcγR 的相對親和力定義為激活抑制比（A/I）。A/I 率是對后續(xù)細胞效應的預測標志物，A/I 率越高，Fc 段效應功能越強[15-16]。

3 單克隆抗體Fc段改造的策略

抗體Fc 段結合活性除了由氨基酸序列決定外，以糖基化為主的翻譯后修飾也有重要影響。目前，廣泛應用的Fc 段工程化改造方法包括如下方向：針對抗體蛋白序列的改造，如基于氨基酸取代的蛋白工程技術；針對抗體蛋白翻譯后修飾部分的改造，這部分以糖基化改造技術為主。另外，針對IgG 亞型框架的改造，選用新的IgG 亞型（如IgG4）框架替代傳統IgG1，盡管不是典型的Fc 段改造，但也通過影響Fc 段與FcγR 的親和力發(fā)揮作用。應用不同改造技術，可以增強或降低其與FcγR 的親和力，在不同疾病領域中發(fā)揮重要作用。大多數情況下，單克隆抗體通過ADCC 效應介導的腫瘤細胞殺傷，則增強ADCC 效應可提高單克隆抗體腫瘤治療療效。然而，在以阻斷細胞表面受體或細胞因子為目標的單克隆抗體中，例如免疫檢查點抑制劑抗體，FcγR 和補體參與的免疫應答過強反而影響其療效，因此需要一些減弱ADCC 效應。

3.1 糖基化改造工程

蛋白質糖基化是在內質網和高爾基體中發(fā)生的一種翻譯后蛋白質修飾[17]。人類IgG 有兩個位于Asn297 的雙觸角聚糖，其中一個是N-聚糖修飾是巖藻糖基化[18]。巖藻糖會阻礙IgG 與CD16A 的最佳空間結合構象，去巖藻糖即可增強Fc 段與CD16A的結合能力，提高細胞效應功能[19-21]。例如，抗G蛋白偶聯受體的抗體莫格利珠單抗對Fc 段進行非巖藻糖基化改造，顯著提高了ADCC 效應[22-23]。應用該技術的還有去巖藻糖化的奧濱尤妥珠單抗[24-29]。烏利妥昔單抗是另一種具有低巖藻糖含量的抗CD20 抗體[30]。糖基化改造后增強了對所有FcRⅢa 變體的親和力，增強ADCC 效應[31]。

FcγR 和補體相互作用與免疫效應物的結合，也可能對某些單克隆抗體的作用機制有害，因此可能需要Fc 段功能下調或無效的抗體。例如免疫檢查抑制劑不需要Fc 段效應功能，反而需要防止ADCC 效應帶來的毒性。例如PD-L1 單抗阿替利珠單抗通過丙氨酸替換N-糖基化位點實現了該目的。

3.2 基于氨基酸取代的蛋白工程

氨基酸取代方法可以改造單克隆抗體的Fc 段結構，增加A/I 率，從而增強FcγR 介導的細胞效應功能。Shields 等[7]對IgG1 的Fc 段進行丙氨酸篩選，發(fā)現Ser298、Glu333 和Lys334 對丙氨酸的組合取代增加了對CD16A 的結合親和力。而其他點突變也已被證明可有效增加IgG 對CD16A 的親和力，包括Ser239Asp、Ile332Glu，以及GASDALIE 變異組合（即 Gly236Ala、Ser239Asp、Ala330Leu 和Ile332Glu 突變組合）[32-33]。GASDALIE 變異組合使IgG 的Fc 段與CD16A 的結合親和力增加了20 倍，而與抑制性FcγRⅡB 的結合親和力僅略微增加[33]。另 外，研 究[34]結果發(fā)現Phe243Leu、Arg292Pro、Tyr300Leu、Val305Ile 和Pro396Leu（稱為variant 18）的氨基酸變異組合也可以提高與CD16A 的結合親和力。

馬吉妥昔單抗是一款Fc 段優(yōu)化型抗HER-2 單克隆抗體，它同時優(yōu)化修飾Fc 段5 個氨基酸（L235V、F243L、R292P、Y300L 和P396L），增強CD16A 的親和力，降低FcγRⅡB 的親和力。既往研究發(fā)現，相較CD16A-158VV 基因型患者，F 基因型患者曲妥珠單抗臨床獲益較少，而FF/FV 基因型患者，占HER-2 陽性乳腺癌患者的85%～90%。馬吉妥昔單抗臨床前研究[35]發(fā)現，其應用提高了CD16A-158FF/FV 基因型細胞的ADCC 效應。

另外，在風濕免疫系統疾病中，也有研究[36-37]通過氨基酸取代后的單克隆抗體增強對抑制性FcγR（FcγRⅡB）的親和力，從而抑制Fc 段介導的免疫效應。而在腫瘤治療中，也有單克隆抗體藥物利用蛋白質工程技術實現降低ADCC 效應的作用。研究[38-39]表明，L235A/G237A/E318A IgG1 變異抗體無法與效應細胞結合，導致ADCC 效應降低25%。一項研究[38]指出了氨基酸取代L234F/L235E/P331S，可導致與低親和力FcγR 的親和力降低。靶向PD-L1 的度伐利尤單抗就包含了這三重突變，使其失去了結合所有FcγR 的能力[40-41]。

3.3 IgG4取代IgG1

不同的IgG1 類型框架的單克隆抗體，其Fc 段受體親和力不同，其親和力排序為：IgG1＞IgG3＞IgG4＞IgG2。改變Fc 段引發(fā)的細胞效應可通過使用不同的亞型抗體作為替代。不同IgG 亞型的單克隆抗體的功能差異歸因于它們與FcγR 和C1q 的結合能力差異[42-44]，特別是已知IgG4 同種型對除FcγRI之外的所有FcγR 均具有低親和力，因此使用IgG4 作為抗體亞型有利于開發(fā)Fc 段惰性抗體[42]。以奧尼妥單抗為例：這是一種基于Veloci-Bi 雙特異性抗體平臺生成的全人源化IgG4 型CD3×CD20 全長雙特異性抗體，通過同時靶向成熟T 細胞表面的CD3 分子以及B 細胞腫瘤蛋白CD20，將T 細胞與腫瘤細胞接合，實現靶向殺滅B 系腫瘤的效果。同時由于奧尼妥單抗是IgG4 型抗體，其Fc 段功能微弱有效減少ADCC 效應，避免T 細胞損耗，從而發(fā)揮更強效、持久的抗腫瘤作用[45]。

4 Fc段改造抗體藥物的臨床應用

4.1 乳腺癌

乳腺癌是目前女性發(fā)病率最高的癌種[46]。對于HER-2 陽性晚期乳腺癌，曲妥珠單抗聯合帕妥珠單抗聯合紫杉類是目前未用過曲妥珠單抗或曾用過曲妥珠單抗但符合再用條件的HER-2 陽性晚期乳腺癌的一線解救治療方案。

SOPHIA 是一項馬吉妥昔單抗與曲妥珠單抗頭對頭比較的隨機、開放標簽、Ⅲ期臨床研究[35]，其研究結果表明：相較曲妥珠單抗，馬吉妥昔單抗可降低24%疾病進展風險（HR=0.76，P=0.03）。CD16A-158F 基因攜帶者無進展生存期（progressionfree survival，PFS）分別為6.9 個月vs.5.1 個月（HR=0.68，P=0.005）?；?于SOPHIA 研究結果，2020 年12 月6 日美國食品藥品監(jiān)督管理局（food and drug administration，FDA）批準馬吉妥昔單抗聯合化療治療既往接受過兩種或以上抗HER-2 方案治療（至少一種用于轉移治療）的HER-2 陽性轉移乳腺癌患者。NCCN 乳腺癌指南推薦馬吉妥昔單抗聯合化療作為HER-2 陽性轉移性乳腺癌的三線治療方案[35]。

此外，三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）約占乳腺癌患者的15%，其臨床特征是侵襲性強，預后差[47]。過去幾十年中，TNBC的治療以化療為主，療效一直未取得突破。直至近兩年，免疫檢查點抑制劑等新型藥物的應用，為TNBC 患者帶來了新希望。FcγR 對靶向檢查點抑制受體PD-1 的抗體活性的有害作用是顯而易見的，經過合理改造的Fc 沉默抗體已獲得批準。在一項針對不可切除的局部晚期或轉移性TNBC的Ⅲ期臨床試驗[48]中，阿替利珠單抗聯合白蛋白紫杉醇顯著延長了轉移性TNBC 的無進展生存期（7.2 個月vs.5.5 個月）。

4.2 血液腫瘤

彌漫大B 細胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）是成人淋巴瘤中最常見的類型，占到大B 細胞淋巴瘤總數的80%以上[49]。在免疫化療時代，仍有40%～50%的患者存在難治或復發(fā)，DLBCL 的治療一直是臨床上的難點。

tafasitamab（MOR208）作為一種抗CD19 靶向藥物，于2020 年獲FDA 批準用于治療復發(fā)/難治性DLBCL。在RE-MIND 研究中，研究者將接受Tafasitamab 聯合來那度胺治療的DLBCL 患者與單獨接受來那度胺的患者的療效數據進行比較，發(fā)現聯合治療組的客觀緩解率（overall response rate，ORR）顯著優(yōu)于來那度胺單藥治療患者（67.1%vs.34.2%）。基于RE-MIND 的陽性結果，目前正在進行的L-MIND 試驗中，研究者將tafasitamab 與利妥昔單抗聯合苯達莫司汀進行直接比較，該研究的終點結果即將公布[50]。

臨床研究[50-51]數據顯示，與利妥昔單抗相比，奧濱尤妥珠單抗使慢性淋巴細胞白血?。╟hronic lymphocytic leukemia，CLL）患者的PFS 顯著延長，以及微小病灶殘留的檢出率下降。在一項治療急性髓系白血病（AML）患者臨床I/Ⅱ期試驗（NCT02789254）中，靶向Fms 樣酪氨酸激酶3（FLT3）的單克隆抗體也有良好的表現，FLT3 單克隆抗體對Fc 受體CD16a 具有增強的親和力，但其臨床療效仍待進一步探索[52]。

另一種類型的藥IgG4 取代類藥物奧尼妥單抗的臨床研究[45]結果顯示：在濾泡性淋巴瘤患者中，≥5 mg 劑量組ORR 達到92.9%，完全緩解率（complete response，CR）為75.0%；中位緩解持續(xù)時間（duration of overall response，DoR）為7.7 個月；在復發(fā)或難治性DLBCL 患者中，≥80 mg 劑量組未接受過CAR-T 治療的DLBCL 患者，ORR 和CR 率為60%，DoR 為10.3 個月。

外周T 細胞淋巴瘤是一類較少見的淋巴瘤亞型。由于發(fā)病率較低，異質性高，目前其臨床預后和療效尚落后于DLBCL。其標準治療方案是化療聯合自體造血干細胞移植[53]。隨著近年研究的深入，新型藥物的出現為患者爭取了更長的生存獲益。莫格利珠單抗早在2012 年已在日本批準，用于治療復發(fā)或難治性患者T 細胞白血病/淋巴瘤（adult T-cell leukemia/lymphoma，ATLL）[23]。隨后在系列臨床研究[22]結果支持下，莫格利珠單抗被FDA批準用于成人T 細胞白血病/淋巴瘤（ATLL）以及真菌性真菌?。∕F）和Sézary 綜合征。在皮膚T 細胞淋巴瘤（cutaneous T cell lymphoma，CTCL）的臨床試驗中，與HDAC 抑制劑伏立諾他相比，莫格利珠單抗組患者的PFS 更優(yōu)（7.7 個月vs.3.1 個月）[54]。在ATLL 中，莫格利珠單抗也具有顯著的ORR 獲益[55]。

4.3 肺癌

肺癌是免疫檢查點抑制劑應用較成熟的癌種之一，特別是對于無驅動基因突變的非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者。小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）是預后較差的肺癌亞型，約占肺癌患者的15%[56]。近20 年，以鉑類藥物為基礎的化療一直是SCLC 的一線標準治療方案。如今，免疫治療的應用，也改變了SCLC 的治療格局。在針對SCLC 的CASPIAN 臨床試驗中，與單獨化療相比，度伐利尤單抗與化療聯合延長了患者總生存期（overall survival，OS）（13.0 個月vs.10.3 個月）[57]，目前，度伐利尤單抗在小細胞肺癌及非小細胞肺癌患者中都有較好的臨床獲益。

在KEYNOTE-024 研究[58]中，與鉑類化療相比，帕博利珠單抗顯著改善了晚期一線NSCLC 患者的PFS 和OS。另外，替雷利珠單抗、帕博利珠單抗和納武利尤單抗都已在鱗狀NSCLC 中開展了臨床研究。隨著更多臨床研究數據的發(fā)布，Fc 段改造工程類抗體藥物的獲益將越來越明顯。

5 討論與展望

目前在腫瘤治療中，單克隆抗體的Fc 段改造技術要考慮人激活FcγR（FcγR I a、FcγR Ⅱa、FcγRⅢa）和抑制FcγR（FcγRⅡb）的比例[59]。其中，NK 細胞介導ADCC 效應的關鍵受體FcγRⅢa有兩個基因多態(tài)性變異：與IgG1 親和力較高的V158 基因型和與IgG1 親和力較低的F158 基因型[60]。這些多態(tài)性可增強與FcγR 結合以及由此產生的先天免疫細胞功能的增強，研究人員已經使用多種方法來設計單克隆抗體，包括Fc 段氨基酸的改變和糖基化工程。另外，改進Fc 段ADCC 效應與介導抗體依賴的細胞吞噬作用ADCP 效應的協同效應以增加腫瘤治療的效能也是當今的一個重要研究方向[61]。

目前已有較多的臨床證據證明，Fc 段改造的單克隆抗體能夠使多類型腫瘤患者臨床獲益。目前國內已上市的抗體類藥物中，越來越多藥物通過Fc 段工程改造增強對靶細胞的殺傷作用。臨床研究中的相關藥物療效也值得期待，比如針對HER-2 陽性晚期乳腺癌的馬吉妥昔單抗、應用于淋巴瘤的奧尼妥單抗在臨床試驗中都展現出了潛力。

但不容忽視的是，研發(fā)單個Fc 段改造的單克隆抗體需要高昂的時間、經濟成本，對其研發(fā)效率造成一定限制[62]?？贵w改造工程需要面對的另一個挑戰(zhàn)是抗體活性和毒性之間的平衡。所以，雖然Fc 段改造的單克隆抗體與傳統抗體藥物相比表現出了療效優(yōu)勢，但是還有很長一段路要走，如何在保證藥物療效的同時兼顧其他因素，也需要更多探索。

綜上，隨著醫(yī)藥技術的快速發(fā)展，越來越多的Fc 段改造的單克隆抗體進入臨床應用，抗體類藥物會隨著技術的進步克服目前的問題。相信在不久的未來，Fc 段改造的單克隆抗體將在腫瘤治療中占據更重要的地位。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。