HPLC法同時測定補益中藥中尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷含量分析

張婷婷

江蘇省連云港市中醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇連云港 222004

對于生物細胞來說，核苷類成分是其維持生命的一種重要物質(zhì)，可發(fā)揮出免疫調(diào)節(jié)作用，具有多種藥理、生理活性，如對中樞神經(jīng)產(chǎn)生鎮(zhèn)靜作用、對腦細胞代謝產(chǎn)生改善作用等。目前，核苷制做為多種藥品、食品添加劑及保健品等，于市場上進行銷售。同時，在多種補益中藥中，如冬蟲夏草、靈芝等，核苷類物質(zhì)是一項重要的質(zhì)量控制指標[1]。既往研究發(fā)現(xiàn)，在多種補益中藥中，核苷類成分可能是藥物共有的物質(zhì)基礎(chǔ)，但相關(guān)研究較少[2]。故本次應(yīng)用高效液相色譜（high performance liquid chro?matography, HPLC）法對熟地黃、當(dāng)歸、人參、麥冬、黃芪及肉蓯蓉這6種補益中藥中腺嘌呤、尿苷、腺苷及鳥苷含量進行測定，以明確各成分在藥物中的實際含量，進而探究補益中藥中核苷類成分的重要作用。本研究于2021年1月采用HPLC法同時測定補益中藥中各成分含量，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

高效液相色譜儀選用Aglent 1100型設(shè)備，包括化學(xué)工作站、自動進樣器、四元泵等；超純水制備系統(tǒng)選用Millipore Milli-Q Plus型；平行反應(yīng)器。

麥冬（生產(chǎn)批號 121013-200908）、黃芪（生產(chǎn)批號 0011024）、熟地黃（生產(chǎn)批號 121196-201406）及肉蓯蓉（生產(chǎn)批號 121276-201102）均于藥店購買，當(dāng)歸（生產(chǎn)批號 120927-201516）于甘肅岷縣購買，人參（生產(chǎn)批號 121586-201202）于吉林撫松縣購買，藥材經(jīng)專業(yè)人士鑒定，分別為地黃、膜莢黃芪、麥冬、當(dāng)歸、人參、管花肉蓯蓉的藥用部位。水選取Milli-Q水；由Sigma公司提供對照品，包括腺苷（生產(chǎn)批號 110879-201703）、腺嘌呤（生產(chǎn)批號110886-201102）、鳥苷（生產(chǎn)批號 111977-201501）及尿苷（生產(chǎn)批號 110887-200202），各對照品純度均>98%。由Merck公司提供乙腈（生產(chǎn)批號130103-201902），且為色譜純；由廣東省光華化學(xué)有限公司提供甲酸（生產(chǎn)批號 101414-201902），且為分析純。

1.2 方法

1.2.1 制備對照品儲備液 稱取適量對照品包括腺苷、腺嘌呤、鳥苷及尿苷，注意精準稱量，并將其分別放置于量瓶（容量為5 mL）中，將適量水加入溶解對照品，溶解后繼續(xù)加水稀釋濃度，直至達到刻度，充分搖勻后制備對照品儲備液，其中腺嘌呤（58.29 μg/mL）、鳥苷（90.73 μg/mL）、尿 苷（77.32 μg/mL）及 腺 苷（157.07 μg/mL）。

1.2.2 制備供試品溶液 精密稱定5 g干燥藥材粉末（60目篩），準確加入15 ml水后稱重，設(shè)置平行反應(yīng)器為100℃，提取時間為90 min，對于失重用水補足，提取液離心處理（轉(zhuǎn)速為13 000 r/min，離心時間為5 min）后將上清液取出，濾過處理所選用濾膜為0.45 μm微孔濾膜，供試品溶液則稱取適量續(xù)濾液。

1.3 色譜條件

分析柱設(shè)置為 250 mm×4.6 mm，5 μm；控制流速為0.5 mL/min；柱溫為30℃；檢測波長設(shè)置為260 nm；進樣量設(shè)置為15 μL；流動相為0.05%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脫（0~12 min，0%B；12~17 min，0%B~2%B；17~27 min，2%B；27~45 min，2%B~20%B）。于以上色譜條件下對腺苷、腺嘌呤、鳥苷及尿苷進行分離，均達到基線分離，在本研究分析中樣品中各個成分除麥冬外，均未對結(jié)果產(chǎn)生明顯影響，而麥冬成分可對腺嘌呤分析產(chǎn)生一定影響。

2 結(jié)果

2.1 考察線性關(guān)系

分別對對照品儲備液（腺苷、腺嘌呤、鳥苷及尿苷）進行準確量取，加適量水進行稀釋，直至成為6個濃度的混合溶液，過濾處理選取0.5 μm微孔濾膜，最后行HPLC分析。線性回歸取各對照品峰面積為Y，濃度（μg/mL）為X。各成分的線性關(guān)系見表1。

表1 腺嘌呤、尿苷、腺苷及鳥苷測定結(jié)果分析

2.2 考察精密度

于同一天內(nèi)選取同一份對照品混合溶液，連續(xù)進樣（次數(shù)為6次），計算出各峰面積，并考察日內(nèi)精密度。進樣次數(shù)為2次/d，連續(xù)測定時間為3 d，計算出各峰面積，并對日間精密度進行考察。分析結(jié)果顯示，腺嘌呤、尿苷、腺苷及鳥苷的日間精密度RSD（n=6）分別為0.2%、0.5%、1.0%及0.7%；日內(nèi)精密度RSD（n=6）分別為0.1%、0.1%、0.1%、0%。

2.3 考察重復(fù)性

對同一當(dāng)歸樣品粉末進行精密稱取，各稱取0.25 g、0.5 g及0.75 g作為3份樣品，以供試品溶液制備方法為依據(jù)進行制備，對峰面積進行測定、計算，結(jié)果顯示，于低、中及高濃度下，腺嘌呤、尿苷、腺苷及鳥苷含量的平均值（n=3）分別為87 μg/g、151 μg/g、270 μg/g及 187 μg/g；RSD 分 別<2.7%、1.4%、2.1%及4.5%。

2.4 考察加樣回收率

對已知含量的當(dāng)歸粉末進行精密稱取，共稱取3份樣品，每份劑量約為0.25 g，以原藥材中各成分的含有量作為依據(jù)，分別稱取等量的對照品并加入，按供試品溶液制備方法為依據(jù)進行制備，測定加樣回收率，結(jié)果顯示，腺嘌呤、尿苷、腺苷及鳥苷的平均加樣回收率（n=3）分別為103.4%、98.3%、97.2%及97.9%；RSD分別為1.7%、0.6%、1.8%及0.8%。

2.5 樣品測定結(jié)果

各樣品粉末均精密稱取劑量為0.5 g，制備后將各樣品均平行制備2份，以外標法測定腺嘌呤、尿苷、腺苷及鳥苷含量，見表2。

表2 不同補益中藥中腺嘌呤、尿苷、腺苷及鳥苷含量分析

3 討論

隨著臨床醫(yī)學(xué)不斷發(fā)展，中藥逐漸受到重視，并被廣泛應(yīng)用于多種疾病治療中，可取得良好效果。為實現(xiàn)中藥現(xiàn)代化，核心就在于質(zhì)量控制，其中含量測定為關(guān)鍵部分，不僅可用于考察藥物內(nèi)在質(zhì)量，還能考察藥品穩(wěn)定性，以確保中藥制劑的質(zhì)量，進而決定中藥功效[3-5]。中藥多數(shù)是來自于植物、礦物及動物的非人工制品，且以植物來源最為常見，其化學(xué)成分較為復(fù)雜，目前多采用色譜法、光譜法測定含量，以HPLC法最為常用[6-8]。HPLC法具有高壓、高速、高效、消耗樣品少、高靈敏度及易回收等優(yōu)勢，可對藥物各成分含量進行精準測定[9]。近年研究發(fā)現(xiàn)，在多種補益中藥中，核苷類物質(zhì)均發(fā)揮著重要作用[10]。本研究采用HPLC法對不同補益中藥中腺嘌呤、尿苷、腺苷及鳥苷含量進行測定，可取得精準結(jié)果，結(jié)果顯示在0.30~77.32 μg/mL、0.35~90.73 μg/mL、0.23~58.29 μg/mL 及0.61~157.07 μg/mL范圍內(nèi)，腺嘌呤、尿苷、腺苷及鳥苷的線性關(guān)系均良好；加樣回收率分別為103.4%（RSD=1.7%）、98.3%（RSD=0.6%）、97.2%（RSD=1.8%）及97.9%（RSD=0.8%）；當(dāng)歸、人參、熟地黃、肉蓯蓉、黃芪及麥冬中均含有核苷類成分，其中黃芪、人參及當(dāng)歸中均含有腺嘌呤、尿苷、腺苷及鳥苷成分，且具有較高含量。張文萌等[11]采用高效液相色譜法同時測定熟地黃中尿苷、腺苷、鳥苷及腺嘌呤等成分含量，結(jié)果顯示，次黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷濃度分別在1.0~16.0 μg/mL(r=0.9999)、5.0~80.0 μ g/mL(r=0.9999)、1.0~16.0 μ g/mL(r=0.9997)、1.25~20.0 μg/mL(r=0.9999)、1.0~16.0 μg/(r=0.9999)范圍內(nèi)線性良好。加樣回收率為98.1%～101.0%，與本研究結(jié)果一致。分析HPLC法測定補益中藥含量的優(yōu)勢如下。①優(yōu)化提取方法：用水煎煮是以往中藥最為常見的使用方法，本次研究中的提取方法也選用了水加熱法。在此基礎(chǔ)上，首先對提取時間進行考察，分別對當(dāng)歸樣品中提取30 min、60 min、90 min及120 min后，計算出各個待測成分的峰面積，并將其進行比較可知，在90 min后各個待測成分的峰面積均未呈顯著增加趨勢，由此本實驗選取90 min作為提取時間。對于溶劑使用量地選取，分別對10倍藥材重量、20倍藥材重量、30倍藥材重量及40倍藥材重量體積的溶劑進行考察，發(fā)現(xiàn)在待測成分中30倍體積的提取效率最高，由此在樣本提取中，選取30倍體積作為溶劑量。②優(yōu)化色譜條件：研究發(fā)現(xiàn)，堿基類化合物具有較大極性，而核苷類化合物與其類似，極性較大[12-13]。因此，在本研究中的色譜分離步驟中，選取Zorbax SB-Aq分析柱，優(yōu)勢在于該種分析柱以純水作為流動相；同時，比較不同流動相發(fā)現(xiàn)，分析物峰形最好的情況是將乙腈-甲酸水溶液作為流動相[14-16]。

對于核苷與補益中藥的關(guān)系，本研究選取補血藥物當(dāng)歸、熟地黃，補氣藥物黃芪、人參，補陽藥物肉蓯蓉及補陰藥物麥冬作為研究對象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在以上補益中藥中，核苷類化合物均大量存在，其中核苷類成分含量最高的藥物包括當(dāng)歸、黃芪和人參。參照物選取冬蟲夏草，以本研究測定結(jié)果為依據(jù)，結(jié)合相關(guān)藥典中對于各味藥材的用量進行計算可見，與冬蟲夏草相比較來說，在藥典用量下本研究所選取的補益中藥所含有的尿苷總量均更高，黃芪中腺嘌呤、鳥苷含量均更高，當(dāng)歸中腺苷含量更高，且在同等用藥量情況下，人參中所含腺苷、鳥苷成分均更高[17-18]。

綜上所述，核苷類成分屬于重要生命物質(zhì)的一種，具有免疫調(diào)節(jié)作用，藥理、生理活性較強，是多種補益中藥中含量較高的活性成分，在其他補益中藥如三七、人參、黃芪及當(dāng)歸中也發(fā)揮著重要作用，其與補益藥物的關(guān)系有待進一步研究。