酒花內(nèi)生菌轉(zhuǎn)化β-月桂烯合成芳樟醇和香葉醇

張逸凡，付冬梅，薛兆茹，王越

（大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

β-月桂烯是一種重要的功能性單萜，在合成香料及其它功能性物質(zhì)方面有很大的經(jīng)濟(jì)潛力[1-2]，是香料產(chǎn)業(yè)中具有價(jià)值的可再生化學(xué)品的原料和中間體[3-4]。在自然界中，β-月桂烯主要存在于酒花雌花果、月桂葉、馬鞭草和柚子皮等，在酒花雌花果中，β-月桂烯含量豐富，最高可達(dá)70%[5]，在其它的植物中含量較少，在柚子皮中含量?jī)H為20.7%[6]。

β-月桂烯分子內(nèi)有兩個(gè)共軛雙鍵和一個(gè)單一雙鍵，容易發(fā)生氧化、聚合、異構(gòu)、重排等化學(xué)反應(yīng)，如化學(xué)合成薄荷、檸檬醛、香茅醇、香葉醇、橙花醇和芳樟醇，這些含氧衍生物更具商業(yè)價(jià)值。與化學(xué)方法相比，微生物也能夠進(jìn)行氧化、還原、水解反應(yīng)、脫水以及形成C-C鍵和幾種降解反應(yīng)[7]，并且反應(yīng)條件溫和、區(qū)域和立體選擇性好、環(huán)境友好且獲得的產(chǎn)品為“天然”產(chǎn)品[8-9]。因此近年來(lái)，研究者一直嘗試對(duì)β-月桂烯進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化。

然而由于β-月桂烯及其含氧衍生物對(duì)細(xì)胞的毒性較高[10]，因此對(duì)β-月桂烯生物轉(zhuǎn)化的微生物報(bào)道較少，只有黑曲霉（Aspergillus niger）[11]、假單胞菌（Pseudomonas）[12-13]、紅球菌（Rhododicus）[5]和德式梭菌（Alcaligenes defragrans）[14]對(duì)β-月桂烯生物轉(zhuǎn)化的報(bào)道。Yamazaki等[11]利用 Aspergillus niger轉(zhuǎn)化 β-月桂烯，主要產(chǎn)物為2-甲基-6-乙烯-7-辛烯-2，3-二醇、6-甲基-2-乙烯基-S-庚烯-1，2-二醇和7-甲基-3-亞甲基-6-辛烯-1，2-二醇。Esmasili等[12-13]用 Pseudomonas putida PTCC 1694轉(zhuǎn)化β-月桂烯，主要產(chǎn)物為二氫芳樟醇（4.1%）、順式β-二氫松油醇（67.6%）和芳樟醇（25.8%）。用Pseudomonas aeruginosa轉(zhuǎn)化30 mmol/L β-月桂烯 36 h，生成了二氫芳樟醇（79.5%）與 2，6-二甲基辛烷（9.3%），總轉(zhuǎn)化率為88.8%。Thompson等[5]將來(lái)源于酒花的Rhododicus erythropolis MLT1對(duì)β-月桂烯進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生了50 μmol/L的香葉醇，底物轉(zhuǎn)化率為2%。這些好氧菌通過(guò)引入分子氧，使單萜烯發(fā)生了β-氧化反應(yīng)[14-15]。另外有研究者報(bào)道厭氧菌也可以轉(zhuǎn)化β-月桂烯為含氧衍生物。Brodkorb等[16]利用Alcaligenes defragrans對(duì)β-月桂烯進(jìn)行水合反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為0.22 mmol/L芳樟醇和0.20 mmol/L香葉醇等含氧衍生物，分離提取出芳樟醇水合-異構(gòu)酶，該酶可以在厭氧環(huán)境中將β-月桂烯轉(zhuǎn)化為芳樟醇和香葉醇，酶活性為9.228 nKat/mg。

在以β-月桂烯為底物進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化的幾種氧化物中，芳樟醇是一種廣泛用于香料和食品行業(yè)的單萜醇，是目前全球應(yīng)用量最大的香料[17]。雖然可以從天然產(chǎn)物中提取，但提取率低、價(jià)格高[18]，所以其主要來(lái)源為基于天然衍生的α-蒎烯的工業(yè)化學(xué)合成[19]。如果通過(guò)微生物對(duì)酒花中β-月桂烯選擇性羥基化直接生成芳樟醇，將來(lái)源豐富的可再生原料轉(zhuǎn)化成高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的香料將是非常理想的。

本文從新鮮的酒花雌花果中篩選能夠以β-月桂烯為碳源的內(nèi)生菌，研究其對(duì)β-月桂烯轉(zhuǎn)化產(chǎn)物組成和直接生成芳樟醇條件；以β-月桂烯含量豐富的酒花油為原料生物轉(zhuǎn)化合成芳樟醇，以期提高酒花的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生鮮啤酒花雌花果：采自秦皇島，采集時(shí)間為2019年10月，花序成熟。β-月桂烯（90%β-月桂烯、8%檸檬烯、1%β-蒎烯）：潤(rùn)友化學(xué)有限公司；濃縮酒花油：河南省帕洛丁貿(mào)易有限公司。初篩培養(yǎng)基：β-月桂烯4.08 g/L、硝酸鈉8.5 g/L、瓊脂粉20 g/L；葡萄糖蛋白胨酵母麥芽粉（glucosepeotoneyeastandmalt，GPYM）培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L、蛋白胨5 g/L、麥芽浸粉3 g/L、酵母浸粉 3 g/L、pH5；營(yíng)養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、氯化鈉5 g/L；溶菌肉湯（luria-bertani，LB）固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化鈉10 g/L、瓊脂20 g/L。其他所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜儀（福立GC9790Plus）：浙江福立分析儀器股份有限公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent7890A/5975C）：美國(guó) Agilent公司；毛細(xì)管色譜柱（DB-FFAP，30 m×0.25 mm，膜厚 0.25 μm）：中科院大連化物所；SPME專用磁力加熱攪拌器（PC-620D）、固相微萃取手柄（SPME-GC PK1）：北京康林科技有限責(zé)任公司；固相微萃取萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）：美國(guó)Supelco公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酒花內(nèi)生菌的篩選

1.3.1.1 雌花果的表面滅菌

將新鮮雌花果超聲洗滌，25℃風(fēng)干，用75%乙醇浸泡10 min，無(wú)菌水沖洗3次，用4%次氯酸鈉浸泡干酒花10 min，無(wú)菌水沖洗3次。將最后一次沖洗的無(wú)菌水涂布至LB固體培養(yǎng)基，30℃下培養(yǎng)24 h，若LB培養(yǎng)基上無(wú)菌落出現(xiàn)，則可以開始篩選內(nèi)生菌[20]。

1.3.1.2 內(nèi)生菌的初篩

將表面滅菌的干酒花在無(wú)菌條件下用研缽碾碎，加入10 mL無(wú)菌水，繼續(xù)研磨出浸出液，將浸出液倒入LB液體培養(yǎng)基中，30℃下200 r/min富集培養(yǎng)24 h。吸取200 μL菌液涂布至初篩培養(yǎng)基上。挑出生長(zhǎng)菌株，在LB固體培養(yǎng)基劃線純化單菌落，接種至試管斜面保藏。

1.3.1.3 內(nèi)生菌的復(fù)篩

挑出初篩保藏的菌株，接入至100 mL復(fù)篩培養(yǎng)基中，30℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)18 h后，每天加入0.15 g β-月桂烯，連續(xù)培養(yǎng)5 d。利用固相微萃取-色譜-質(zhì)譜（solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometer，SPME-GC-MS）檢測(cè)發(fā)酵液中揮發(fā)物質(zhì)。

1.3.1.4 菌株鑒定

提取篩選菌株的DNA，利用1492R和27F通用引物進(jìn)行16S rDNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。由吉林省庫(kù)美生物技術(shù)有限公司測(cè)序，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行基本局部比對(duì)，采用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2 內(nèi)生菌株轉(zhuǎn)化β-月桂烯

將篩選的菌株接種至GPYM培養(yǎng)基中，加入10 g/L β-月桂烯。在30℃、200 r/min條件下培養(yǎng)6 d，取發(fā)酵液，8 000 r/min離心20 min后取上清液。通過(guò)SPMEGC-MS檢測(cè)上清液中β-月桂烯轉(zhuǎn)化產(chǎn)物[12]。

1.3.3 細(xì)胞破碎轉(zhuǎn)化

將1.3.2離心沉淀菌體用無(wú)菌生理鹽水沖洗3次后，加入 2 mmol/L 二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）后，600 W超聲5 s，停留3 s，再超聲20 min進(jìn)行細(xì)胞破碎。取上清液30 mL，加入10 g/L β-月桂烯。30℃、200 r/min振蕩反應(yīng)3 h，檢測(cè)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化物質(zhì)。

1.3.4 好氧與厭氧轉(zhuǎn)化

按照方法“1.3.2”將篩選所得菌株接入GPYM培養(yǎng)基中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，厭氧培養(yǎng)時(shí)在具塞250 mL三角瓶中通入0.05 MPa 99.99%氮?dú)? min，排出瓶中空氣。在30℃、200 r/min條件下培養(yǎng)6 d，8 000 r/min離心20 min，取上清液。通過(guò)SPME-GC-MS檢測(cè)上清液中轉(zhuǎn)化物質(zhì)。

1.3.5 酒花油的生物轉(zhuǎn)化

將篩選的菌株接種至GPYM培養(yǎng)基中，加入0.2g/L～17.6g/L商品酒花油。在30℃、200r/min條件下培養(yǎng)6 d，取發(fā)酵液，8 000 r/min離心20 min，取上清液。通過(guò)SPME-GC檢測(cè)上清液中酒花油轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。β-月桂烯的轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式如下。

式中：W為β-月桂烯的轉(zhuǎn)化率，%；C產(chǎn)物為生成芳樟醇或香葉醇的濃度，g/L；C月為投入β-月桂烯的濃度，g/L。

1.3.6 SPME-GC-MS分析方法

將發(fā)酵液在4℃、8 000 r/min條件下離心10 min。吸取5 mL上清液，移入固相萃取樣品瓶中，加入2 g NaCl促進(jìn)樣品揮發(fā)。將樣品瓶放在固相萃取儀上，溫度為60℃，轉(zhuǎn)速為170 r/min。推出50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭吸附30 min后，插入GC進(jìn)樣口解吸5 min[21]。

GC條件：色譜柱為DB-FFAP毛細(xì)管色譜柱（30m×0.25 mm×0.5 μm），載氣為氮?dú)猓贿M(jìn)樣口溫度 240℃，柱箱初溫50℃，以10℃/min升至80℃，1.5℃/min升至147℃，15℃/min升至205℃，保持10 min，分流比為10∶1。

MS條件：離子源溫度220℃，電離方式為電子轟擊（electron impact，EI），電子能量 70 eV，離子源溫度230℃；掃描范圍m/z 100～420。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)重復(fù)3次，使用Execl軟件處理數(shù)據(jù)，SPSS 25軟件分析誤差，MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒花內(nèi)生菌篩選

研究表明，可轉(zhuǎn)化β-月桂烯的菌株為黑曲霉、銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌、德式梭菌[5，11-14]等，其中好氧菌Pseudomonas putida PTCC 1694對(duì)β-月桂烯生成芳樟醇的轉(zhuǎn)化率為25.8%，而厭氧菌Alcaligenes defragrans的轉(zhuǎn)化率為0.7%，研究結(jié)果顯示，好氧菌的轉(zhuǎn)化效率高于厭氧菌?？紤]到后期產(chǎn)物的制備，好氧條件易于控制，因此篩選菌株時(shí)采用好氧條件。

按照方法“1.3.1”對(duì)新鮮啤酒花雌花果內(nèi)生菌進(jìn)行初篩。由于初篩培養(yǎng)基以β-月桂烯為碳源，菌株生長(zhǎng)少，且菌落非常小，因此只挑選出4株，分別命名為Z1、Z2、Z3和Z4。將4株菌進(jìn)行復(fù)篩，通過(guò)SPME-GC-MS檢測(cè)發(fā)酵液中單萜氧化物含量，結(jié)果見表1。

表1 篩選4株菌轉(zhuǎn)化β-月桂烯生成單萜氧化物Table 1 Biotransformation of β-myrcene to monoterpene oxides by four strains

從表1可看出，篩選出的Z1、Z2、Z3和Z4菌株，均可將β-月桂烯轉(zhuǎn)化成單萜氧化物。只有Z1將β-月桂烯轉(zhuǎn)化生成了0.37 mg/L芳樟醇和0.21 mg/L香葉醇，這兩種物質(zhì)是食品和醫(yī)藥行業(yè)中應(yīng)用量最大的香料[17]。同時(shí)這種菌株還將β-月桂烯樣品中少量的檸檬烯（含量8%）和β-蒎烯（含量1%）轉(zhuǎn)化成紫蘇醇、紫蘇醛、金合歡醇和橙花醇等香氣優(yōu)秀的氧化物（未顯示）。因此選擇Z1作為轉(zhuǎn)化β-月桂烯的菌株。

2.2 菌株的鑒定

根據(jù)NCBI的對(duì)比結(jié)果，Z1菌16S rDNA（序列號(hào)：ON502447）和Pantoea ananatis的同源性為98.2%，Z1菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。Z1菌株16S rDNA序列與Pantoea ananatis更接近，屬于泛菌屬。Z1菌株的菌落形態(tài)和生理生化結(jié)果分別見圖2和表2。

表2 Z1菌株生理生化鑒定Table 2 Physiological and biochemical identification of strains Z1

圖1 Z1菌株基于16S rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain Z1 and related type species based on the 16S rDNA gene sequences

圖2 Z1菌株的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of strain Z1

由圖2可知，Z1菌株菌落在GPYM固體培養(yǎng)基上平坦，不透明，表面濕潤(rùn)、生長(zhǎng)較快，為革蘭氏陽(yáng)性菌，從形態(tài)學(xué)上符合Pantoea ananatis菌落特征。從表2可以看出，Z1菌株的生理生化特征符合Pantoea ananatis，結(jié)合圖1中16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹，將Z1命名為Pantoea ananatis Z1。

2.3 P.ananatis Z1對(duì)β-月桂烯的轉(zhuǎn)化條件

由于從啤酒花雌花果中篩選的內(nèi)生菌P.ananatis Z1屬于兼性厭氧細(xì)菌[23]，因此考察Z1菌在有氧和厭氧兩種環(huán)境下對(duì)β-月桂烯的轉(zhuǎn)化。按照方法“1.3.4”將Z1菌接入GPYM培養(yǎng)基中進(jìn)行厭氧培養(yǎng)轉(zhuǎn)化。細(xì)胞破碎方法參照“1.3.3”，利用SPME-GC-MS檢測(cè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，結(jié)果見表3。

表3 P.ananatis Z1菌株轉(zhuǎn)化條件Table 3 Biotransformation conditions of strains P.ananatis Z1

由表3可知，有氧條件下，P.ananatis Z1菌株在胞外將β-月桂烯轉(zhuǎn)化生成了芳樟醇、二氫芳樟醇和香葉醇等單萜氧化物；胞內(nèi)酶對(duì)β-月桂烯轉(zhuǎn)化產(chǎn)物種類很少，只有少量二氫芳樟醇和順式氧化芳樟醇。在厭氧條件下，P.ananatis Z1可以生長(zhǎng)，但對(duì)β-月桂烯沒(méi)有轉(zhuǎn)化活性。

β-月桂烯及其含氧衍生物對(duì)細(xì)胞的毒性較高[10]，能轉(zhuǎn)化利用β-月桂烯的微生物很少。目前報(bào)道能將β-月桂烯生物合成芳樟醇或香葉醇的微生物只有假單胞菌（Pseudomonas putida PTCC 1694）[12-13]、紅球菌（Rhododicus erythropolis）[5]和德式梭菌（Alcaligenes defragrans）[14]，但這3株菌的轉(zhuǎn)化條件和途徑不同。P.putida PTCC 1694和R.erythropolis需在有氧條件下，通過(guò)引入分子氧，使單萜烯發(fā)生β-氧化反應(yīng)[5]。研究表明，Rhododicus erythropolis轉(zhuǎn)化β-月桂烯的關(guān)鍵酶是?；o酶A脫氫酶（acyl-CoA dehydrogenase）[5]。而Alcaligenes defragrans是在厭氧環(huán)境下生成芳樟醇脫水酶-異構(gòu)酶（linalool dehydratase-isomerase），在該雙功能酶的催化下，β-月桂烯水合生成芳樟醇和香葉醇，同時(shí)香葉醇和芳樟醇互相異構(gòu)化[14，24]。

表3結(jié)果表明，P.ananatis Z1是在有氧條件下將β-月桂烯合成芳樟醇和香葉醇，推測(cè)其轉(zhuǎn)化途徑可能和R.erythropolis類似，其中催化的關(guān)鍵酶還需要進(jìn)一步分離純化鑒定。

2.4 β-月桂烯濃度對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

有研究表明，高濃度的β-月桂烯對(duì)微生物細(xì)胞有毒害作用[25]，影響微生物轉(zhuǎn)化能力并抑制其生長(zhǎng)[26]，這也是微生物轉(zhuǎn)化單萜生成單萜醇的難點(diǎn)之一。為了考察β-月桂烯濃度對(duì)P.ananatis Z1菌株轉(zhuǎn)化影響，在GPYM培養(yǎng)基中加入不同濃度的β-月桂烯，按照方法“1.3.2”轉(zhuǎn)化β-月桂烯，結(jié)果如圖3所示。

圖3 β-月桂烯濃度對(duì)單萜醇生成量的影響Fig.3 Effects of β-myrcene concentrations on the production of monoterpene alcohols

由圖3可知，在一定范圍內(nèi)，隨著β-月桂烯濃度的升高，P.ananatis Z1轉(zhuǎn)化β-月桂烯生成單萜醇的濃度增加，當(dāng)β-月桂烯濃度為14.1 g/L時(shí)，單萜醇的生成量最高，主要是二氫芳樟醇，生成量為2.06 mg/L，而芳樟醇僅為0.89 mg/L，香葉醇為1.09 mg/L。β-月桂烯濃度超過(guò)14.1 g/L，生成的單萜醇濃度下降。結(jié)果表明，β-月桂烯濃度對(duì)P.ananatis Z1轉(zhuǎn)化有影響，超過(guò)14.1 g/L，會(huì)對(duì)菌株的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)化產(chǎn)生抑制。Esmaeili等[12]利用Pseudomonas putida PTCC 1694轉(zhuǎn)化4.62 g/L β-月桂烯，芳樟醇產(chǎn)量為1.05 g/L，轉(zhuǎn)化率為22.73%。與此相比，P.ananatis Z1對(duì)β-月桂烯生成芳樟醇和香葉醇的轉(zhuǎn)化率僅為0.007%和0.016%，轉(zhuǎn)化效果并不理想。初步分析原因，可能是β-月桂烯不溶于轉(zhuǎn)化體系，與細(xì)胞接觸少，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率低。

為了提高β-月桂烯在轉(zhuǎn)化體系中的溶解度，通常會(huì)在反應(yīng)體系中加入共溶劑[12]。在P.ananatis Z1的轉(zhuǎn)化體系中分別加入0.1g/L和1.0g/L甲醇、乙醇和丙二醇作為共溶劑，考察共溶劑對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見表4。

表4 不同濃度共溶劑對(duì)芳樟醇和香葉醇生成量的影響Table 4 Effects of different concentrations of cosolvent on the production of linalool and geraniol

由表4可知，改變共溶劑成分與增加共溶劑的濃度均不能提高芳樟醇和香葉醇的合成量，說(shuō)明P.ananatis Z1菌株對(duì)β-月桂烯的低轉(zhuǎn)化率并不是因底物溶解度低導(dǎo)致。

廉長(zhǎng)盛等[21]曾利用啤酒花內(nèi)生菌Pseudomonas oryzihabitans F0-1催化酒花油中檸檬烯，生成α-松油醇濃度為（97.54±3.34）mg/L，比轉(zhuǎn)化分析純檸檬烯提高了10.6倍。因此本文認(rèn)為酒花油中一些萜烯類物質(zhì)可起到促進(jìn)轉(zhuǎn)化作用。酒花油是啤酒花雌花果中腺體分泌的一種精油，質(zhì)量占1.5%～2.5%，β-月桂烯含量豐富，最高可達(dá)70%[5]。因此為了提高P.ananatis Z1菌對(duì)β-月桂烯的轉(zhuǎn)化率，繼續(xù)考察該菌株對(duì)酒花油中β-月桂烯的轉(zhuǎn)化。

2.5 P.ananatis Z1對(duì)酒花油β-月桂烯的轉(zhuǎn)化

啤酒花在中國(guó)種植廣泛，以酒花油中的β-月桂烯為原料對(duì)其進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，其來(lái)源廣泛且可再生，微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物被認(rèn)為是天然產(chǎn)物[3-4]。利用SPME-GC-MS方法檢測(cè)了商品酒花油成分，結(jié)果見表5。

表5 商品酒花油單萜物質(zhì)成分Table 5 Monoterpene constituents of commercial hops oil

由表5可知，一般提取酒花油中，芳樟醇占比不超過(guò)1%[27]，而商品酒花油中芳樟醇占3%，表明該酒花油經(jīng)過(guò)濃縮。將P.ananatis Z1菌株接入GPYM培養(yǎng)基中，加入不同濃度酒花油。酒花油中β-月桂烯濃度為61.86 g/L，丙二醇為900.50 g/L，若按照?qǐng)D3中β-月桂烯濃度加入酒花油，則轉(zhuǎn)化體系中丙二醇濃度為5.80 g/L～305.55 g/L。前期加入共溶劑試驗(yàn)結(jié)果顯示，丙二醇濃度超過(guò)10 g/L，對(duì)P.ananatis Z1菌生長(zhǎng)有明顯抑制作用。所以選擇添加酒花油濃度為0.4 g/L～17.6 g/L，使轉(zhuǎn)化體系中β-月桂烯濃度為0.02 g/L～1.08 g/L。按照方法“1.3.5”在30℃、200 r/min的條件下轉(zhuǎn)化24 h，測(cè)定芳樟醇和香葉醇的濃度。由于酒花油含有芳樟醇和香葉醇，將沒(méi)有接入P.ananatis Z1菌株的含有酒花油的GPYM培養(yǎng)基作為空白，結(jié)果見圖4。

圖4 P.ananatis Z1對(duì)酒花油β-月桂烯轉(zhuǎn)化Fig.4 Biotransformation of β-myrcene in hops oil by strains P.ananatis Z1

由圖4可知，當(dāng)酒花油中濃度低于0.9 g/L，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物主要為二氫芳樟醇0.05 g/L，酒花油中的芳樟醇和香葉醇濃度減少，表明香葉醇異構(gòu)化芳樟醇，再被還原成二氫芳樟醇[16]；當(dāng)酒花油濃度超過(guò)3.5 g/L，芳樟醇、香葉醇生成量開始增加；酒花油濃度為14.1 g/L時(shí)，轉(zhuǎn)化量最高，芳樟醇和香葉醇的濃度分別為0.52 g/L和0.09 g/L，酒花油β-月桂烯轉(zhuǎn)化率為60.8%和10.6%，二氫芳樟醇生成量為0，表明芳樟醇停止了還原轉(zhuǎn)化為二氫芳樟醇的途徑，轉(zhuǎn)而異構(gòu)化香葉醇。比較圖3和圖4可知，在底物僅為β-月桂烯時(shí)，芳樟醇生成量為0.89 mg/L，香葉醇生成量為1.09 mg/L，對(duì)β-月桂烯的轉(zhuǎn)化率為0.006%和0.007%，轉(zhuǎn)化率很低；當(dāng)?shù)孜餅楹笑?月桂烯的酒花油時(shí)，芳樟醇生成量為0.52 g/L，香葉醇生成量為0.09 g/L，和底物僅為β-月桂烯比較，芳樟醇和香葉醇的轉(zhuǎn)化率分別提高了10 248和1 483倍，比文獻(xiàn)[12]報(bào)道的Pseudomonas putida PTCC 1694的轉(zhuǎn)化率22.73%提高了2.67倍。

Z1菌對(duì)酒花油中β-月桂烯的轉(zhuǎn)化率大幅度提高的原因可能是酒花油中的一些主要成分對(duì)β-月桂烯的轉(zhuǎn)化起到關(guān)鍵促進(jìn)作用，打破了β-月桂烯、芳樟醇和香葉醇之間的反應(yīng)平衡，促使β-月桂烯大量轉(zhuǎn)化成芳樟醇和香葉醇。有文獻(xiàn)報(bào)道[28]，芳樟醇能破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性，增加細(xì)胞膜的通透性，胞內(nèi)物質(zhì)向外泄漏，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。同時(shí)芳樟醇還能抑制呼吸鏈脫氫酶活性，引起細(xì)胞呼吸代謝活力降低，從而導(dǎo)致胞內(nèi)代謝紊亂，抑制菌體生長(zhǎng)。酒花油中含有3%芳樟醇和0.1%香葉醇，可能是酒花油中的芳樟醇部分破壞了細(xì)胞膜磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，增加了細(xì)胞通透性和疏水性。由于β-月桂烯具有疏水性，誘導(dǎo)細(xì)胞生成轉(zhuǎn)化酶的機(jī)會(huì)增多。同時(shí)芳樟醇會(huì)促使細(xì)胞膜蛋白暴露在反應(yīng)體系溶液中，使β-月桂烯作為底物增加與酶的親和性。Thompson等[5]認(rèn)為β-月桂烯作為底物對(duì)紅球菌Rhodococcus erythropolis MLT1生成香葉醇有誘導(dǎo)作用，但是芳樟醇對(duì)P.ananatis Z1轉(zhuǎn)化β-月桂烯的作用以及代謝調(diào)控需要進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

從新鮮啤酒花雌花果中篩選到一株能夠轉(zhuǎn)化β-月桂烯生成芳樟醇和香葉醇的菌株，經(jīng)生理生化與分子學(xué)鑒定，將該菌株命名為Pantoea ananatis Z1。該菌可以在胞外有氧條件下將β-月桂烯轉(zhuǎn)化生成芳樟醇與香葉醇，推測(cè)其代謝途徑和Pseudomonas putida PTCC 1694的代謝途徑類似。當(dāng)β-月桂烯濃度為14.1 g/L時(shí)，生成芳樟醇為0.89 mg/L，香葉醇為1.09 mg/L，對(duì)β-月桂烯的轉(zhuǎn)化率為0.006%和0.007%。

利用P.ananatis Z1轉(zhuǎn)化酒花油中的β-月桂烯，芳樟醇和香葉醇生成量達(dá)0.52 g/L和0.09 g/L，轉(zhuǎn)化率為60.8%和10.6%，比轉(zhuǎn)化單一底物β-月桂烯的產(chǎn)量提高了579倍和84倍，芳樟醇和香葉醇的轉(zhuǎn)化率分別提高了10 248和1 483倍。初步認(rèn)為β-月桂烯和芳樟醇的共同存在促進(jìn)了P.ananatis Z1對(duì)β-月桂烯的轉(zhuǎn)化。針對(duì)β-月桂烯和芳樟醇協(xié)同作用對(duì)P.ananatis Z1轉(zhuǎn)化β-月桂烯途徑的影響，下一步將提取該菌代謝β-月桂烯的關(guān)鍵酶，研究β-月桂烯和芳樟醇對(duì)其性質(zhì)影響，以提出一種生物轉(zhuǎn)化的機(jī)制，并開發(fā)一種可規(guī)?；a(chǎn)芳樟醇和香葉醇的生物催化工藝。