一起牦牛呼吸道疾病的病原學(xué)診斷

蔣嬌嬌，岳 華，湯 承

（西南民族大學(xué)，四川成都 610041）

牦牛是青藏高原特有的牛種，為牧民們提供了重要的生產(chǎn)生活資料。我國牦牛主要分布在西藏、青海、四川、甘肅、云南等地，飼養(yǎng)數(shù)量超過1 500 萬頭，是世界上擁有牦牛數(shù)量最多的國家，占世界牦牛總數(shù)的95%以上[1]。牛呼吸道綜合征（bovine respiratory disease complex，BRDC）是嚴(yán)重危害養(yǎng)牛業(yè)的一類疾病，除發(fā)熱外，主要表現(xiàn)咳嗽、流鼻涕及呼吸困難等呼吸道癥狀，發(fā)病率和死亡率都較高[2]。病毒、細(xì)菌和支原體等都可引起B(yǎng)RDC，其中病毒包括牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhoea virus，BVDV）、牛副流感病毒3 型（bovine parainfluenza virus type 3，BPIV-3）、牛傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）、牛冠狀病毒（bovine coronavirus，BCoV）、牛呼吸道合胞體病毒（bovine respiratory syncytial virus，BRSV）和牛腺病毒3型（bovine adenovirus type 3，BAdV-3）等，常見細(xì)菌和支原體包括多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）、溶血性曼氏桿菌（Mannheimia haemolytica，Mh）和牛支原體（Mycoplasma bovis，Mb）等[3]。一般認(rèn)為病毒常作為原發(fā)性病原可侵害牛呼吸道黏膜并使機(jī)體抵抗力下降，引起條件性致病菌的繼發(fā)感染，從而加重病牛的臨床癥狀[4]。引起B(yǎng)RDC 的病因復(fù)雜，且常為多病原混合感染，而各種病原引起的臨床癥狀相似，往往需要實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)來確定病原。盡管牦牛群中暴發(fā)BRDC 的報(bào)告很多，但多數(shù)報(bào)道是針對(duì)細(xì)菌進(jìn)行的檢測(cè)[5-7]，而對(duì)BRDC 樣本進(jìn)行病毒檢測(cè)和分離的報(bào)告很少，這在一定程度上制約了牦牛BRDC 的防控。

2022 年2 月，川西北高原某地牦牛暴發(fā)以發(fā)熱、流涕、呼吸困難、個(gè)別母畜流產(chǎn)為特征的疾病。該地養(yǎng)殖牦牛16 000 余頭，至5 月底約3 000 頭發(fā)病，發(fā)病率約為18.8%，1 600 余頭死亡，死亡率約為10.0%。本研究旨在通過對(duì)該地發(fā)病牦牛進(jìn)行病原學(xué)診斷，確定引起B(yǎng)RDC 的病原，為該地牦牛呼吸道疾病防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2022 年5 月，當(dāng)?shù)孬F醫(yī)部門送檢13 頭發(fā)病牦牛（編號(hào)1～13）的20 份樣本，包括8 份鼻拭子樣本、4 份全血樣本、2 份流產(chǎn)中陰道拭子樣本（以下簡(jiǎn)稱流產(chǎn)拭子）、5 份肺臟樣本和1 份胎盤組織樣本（表1）；BCoV、BVDV、IBRV、BAdV-3、BPIV-3、BRSV、Mb、Pm 及Mh 等病原陽性核酸，由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

表1 20 份不同組織樣本來源 單位：份

1.2 主要試劑及儀器

TrizolTMReagent、Prime ScriptTMRT、DL 2 000 DNA Marker 等，購于南京諾唯贊生物公司；TaKaRa T3 Super PCR Mix，購自擎科生物；Life ECO 基因擴(kuò)增儀，購于杭州博日科技有限公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)、核酸蛋白電泳儀，購于Bio-Rad 公司產(chǎn)品；高速離心機(jī)，購于Eppendorf 公司。

1.3 樣品處理和核酸提取

在鼻拭子、流產(chǎn)拭子、全血樣本以及搗碎的胎盤和肺臟組織樣本中，分別加入5 mL PBS 溶液吹打混勻，渦旋3 min，10 000 r/min 離心3 min后取上清液備用。

用酚-氯仿抽提法提取樣本DNA，用Trizol法提取樣本RNA，再反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系：DEPC-treated Water 8 μL，5×Reaction Mix 4 μL，Supreme Enzyme Mix 3 μL，RNA 5 μL；反應(yīng)條件：25 ℃ 10 min，55 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min。

1.4 病原檢測(cè)

參照文獻(xiàn)報(bào)道的PCR 方法，分別對(duì)20 份樣品進(jìn)行BVDV、BPIV-3、IBRV、BCoV、BRSV、BAdV-3、Pm、Mh 和Mb 等9 種BRDC 相關(guān)病原檢測(cè)，引物信息見表2。陽性樣品的PCR 產(chǎn)物，送往生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，以驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表2 PCR 檢測(cè)引物信息

1.5 IBRV 分型鑒定

參照文獻(xiàn)[16]報(bào)道的方法擴(kuò)增IBRV 完整gC基因序列，根據(jù)gC編碼的氨基酸序列[17]建立進(jìn)化樹確定IBRV 基因型。

1.6 Pm 分型鑒定

參照文獻(xiàn)[18]報(bào)道的方法進(jìn)行A、B 和D 型莢膜抗原分型，參照文獻(xiàn)[19]報(bào)道的方法進(jìn)行E和F 型莢膜抗原分型。

2 結(jié)果

2.1 PCR 檢測(cè)

相關(guān)病原的PCR 檢測(cè)結(jié)果（表3）顯示：在20 份樣本中共檢測(cè)出IBRV、BAdV-3 和Pm 3 種病原，其他病原未檢出；4 份全血樣本中檢測(cè)出3 份IBRV、1 份BAdV-3 陽性，1 份胎盤組織樣本中檢出IBRV 陽性，8 份鼻拭子樣本中檢出3 份IBRV、5 份BAdV-3 陽性，2 份流產(chǎn)拭子中檢出2 份BAdV-3 陽性，5 份肺臟組織樣本中檢出4 份Pm陽性；IBRV+BAdV-3 混合感染率為23.1%（3/13），IBRV+Pm 混合感染率為15.4%（2/13），BAdV-3+Pm 混合感染率為15.4%（2/13），IBRV+BAdV-3+Pm 混合感染率為15.4%（2/13）。陽性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過測(cè)序均為特異性擴(kuò)增，進(jìn)一步證實(shí)該地牦牛暴發(fā)的呼吸道疾病由IBRV、BAdV-3 和Pm 3 種病原感染引起。

表3 3 種病原陽性樣本的來源牦牛分布

2.2 IBRV 分型

成功獲取了7 份陽性樣本中的完整gC基因?；诎被徇M(jìn)化樹的分析結(jié)果（圖1）顯示：本研究檢出的IBRV 陽性樣品與1.2 型毒株聚為一大支，故可判斷引起該地牦牛呼吸道疾病暴發(fā)的是1.2 型IBRV。

圖1 IBRV gC 基因氨基酸進(jìn)化樹

2.3 Pm 分型

對(duì)4 份Pm 陽性樣本進(jìn)行莢膜抗原分型鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4 份樣本均為A 型（圖2）。

圖2 Pm 陽性樣本莢膜抗原分型結(jié)果

3 討論

本研究對(duì)川西北某地牦牛暴發(fā)的以發(fā)熱、流涕、呼吸困難、個(gè)別母畜流產(chǎn)為特征的疫病進(jìn)行了9 種主要呼吸道病原檢測(cè)，綜合病原檢測(cè)結(jié)果和臨床資料分析，確定該起病情是由1.2 型IBRV、BAdV-3 和A 型Pm 感染引起的。由于存在多病原混合感染，加之當(dāng)?shù)仃笈ｏ曫B(yǎng)管理粗放，基層獸醫(yī)力量薄弱，早春牧草匱乏導(dǎo)致營養(yǎng)攝入不足，高原天氣較為寒冷等因素，加重了此次病情，以至牦牛發(fā)病率和死亡率均較高。

巴氏桿菌病是由Pm 引起的一種牛急性敗血性傳染病，在青藏高原牦牛中多呈散發(fā)或地方流行，一年四季均可發(fā)生。近年來，關(guān)于牦牛巴氏桿菌病的報(bào)道較多，在青海、甘肅等地均有該病發(fā)生[20-21]，給牦牛養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。Pm 血清型Cater 分型法根據(jù)不同的莢膜抗原將Pm分為5 個(gè)血清型[19]。過去在牦牛群中流行的Pm 主要為B 型[22-24]，而本研究檢出的為A 型，證實(shí)了A 型Pm 在川西北地區(qū)的存在和流行；近年在西藏牦牛中也分離出了A 型Pm[25-26]，因此有必要進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)牦牛A 型Pm 流行情況的調(diào)查。A、B 型Pm 的交叉保護(hù)效果不好[27]，此次發(fā)病牦牛接種過B型Pm疫苗，因而未能防御A型Pm對(duì)牦牛的感染。

IBRV 主要導(dǎo)致牛呼吸系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)疾病，根據(jù)其gC基因編碼的氨基酸差異可以將其劃分為1.1 型與1.2 型，兩者的抗原性有差異。有資料[17]顯示，1.1 型IBRV 易引起呼吸道疾病，而1.2 型易引起生殖疾病。IBRV 在西藏、青海、四川等牦牛主產(chǎn)區(qū)廣泛流行，但還未見對(duì)牦牛源IBRV 進(jìn)行分型的報(bào)道[28-32]。本研究檢出的7 份IBRV 陽性樣品均為1.2 型，發(fā)病牛主要表現(xiàn)為呼吸道癥狀，也有部分牛表現(xiàn)為流產(chǎn)，并且在流產(chǎn)胎盤中也檢出了1.2 型IBRV，這也證實(shí)了1.2 型IBRV 在該地牦牛中的存在和流行，而且引起的臨床癥狀也發(fā)生了變化，因此有必要進(jìn)一步研究1.2 型IBRV 對(duì)牦牛的致病性及其在牦牛中的流行情況，

BAdV-3 也是引起B(yǎng)RDC 的病原體之一，可引起支氣管炎和支氣管肺炎[33]。BAdV-3 在我國牛群中廣泛存在和流行[34-35]，但是還未見關(guān)于BAdV-3感染牦牛的報(bào)道。本研究在發(fā)病牦牛的鼻拭子、血液、流產(chǎn)拭子中均檢出了BAdV-3，表明該病毒可以引起牦牛的全身感染，并證實(shí)BAdV-3 在該地牦牛群中的存在和流行，因而豐富了牦牛BRDC 的病原譜，為牦牛BRDC 的防控提供了參考。

4 小結(jié)

本研究通過對(duì)發(fā)病牦牛進(jìn)行相關(guān)病原PCR 檢測(cè)及分型鑒定，確診該起牦牛BRDC 的暴發(fā)由1.2型IBRV、BAdV-3 和A 型Pm 感染引起，證實(shí)了BAdV-3 與1.2 型IBRV 在該地牦牛中的存在和流行，提示有必要加強(qiáng)這3 種病原的監(jiān)測(cè)和研究。