噬菌體防治副溶血弧菌感染研究進展

李文馨，許 華，黎睿君，董 宣，黃 倢

（1.大連海洋大學(xué)，遼寧大連 116023；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室，青島市海水養(yǎng)殖流行病學(xué)與生物安保重點實驗室，山東青島 266071）

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，在養(yǎng)殖產(chǎn)量提高的同時，病害頻發(fā)和抗生素濫用等相關(guān)問題也逐漸暴露出來，制約了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的綠色高質(zhì)量發(fā)展。細菌性疾病是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中流行較為廣泛且危害嚴重的疾病。副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是常見致病菌之一，廣泛分布于水生環(huán)境中，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了損失，也是引發(fā)食源性疾病的重要致病菌，給人類健康帶來威脅。副溶血弧菌是一種革蘭氏陰性嗜鹽致病菌，廣泛存在于海水及魚、蝦、貝類等水產(chǎn)養(yǎng)殖動物中，并引起水生動物感染發(fā)病，如可引起對蝦急性肝胰腺壞死?。ˋHPND）[1]、凡納對蝦“玻璃苗”[2-4]等。

目前，無論在水產(chǎn)養(yǎng)殖中還是臨床醫(yī)學(xué)上，抗生素已成為防治副溶血弧菌相關(guān)疾病的主要手段之一，而抗生素的誤用和濫用導(dǎo)致細菌耐藥性增強的問題日趨嚴重[5]。張寶存等[6]從患病凡納對蝦中分離到一株高毒力且對多種抗生素都耐藥的副溶血弧菌，后被證明是AHPND 的致病菌[7]。Jiang等[8]從海產(chǎn)品中分離出90 株副溶血弧菌，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)分離株對氨芐青霉素（86/90）和頭孢唑啉（75/90）表現(xiàn)出耐藥性，其中40 株對至少3 種抗生素具有耐藥性。據(jù)中國疾病預(yù)防控制中心[9]報道，2016—2020 年我國臨床分離出的副溶血弧菌對頭孢唑啉和氨芐青霉素的耐藥率較高，分別為94%和37%。為遏制抗生素濫用問題，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部實施了《全國遏制動物源細菌耐藥行動計劃（2017—2020 年）》，通過“禁抗、減抗、限抗”的努力，動物用藥中抗生素的科學(xué)使用已獲得了初步成效，提前2 年完成了動物用抗菌藥使用“零增長”目標[10]。2022 年初，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部又頒布了《2022 年動物源細菌耐藥性監(jiān)測計劃》，以進一步遏制抗生素濫用問題[11]。

近年來，噬菌體（bacteriophage）作為一種治療細菌性疾病的新型抗生素替代品被廣泛關(guān)注。本文就噬菌體在副溶血弧菌感染防治方面的應(yīng)用和噬菌體生物工程研究現(xiàn)狀，以及副溶血弧菌噬菌體現(xiàn)存問題及對策進行概述，旨在表明噬菌體制劑在治療細菌性疾病方面具有廣闊的應(yīng)用前景，對在當前形勢下尋找有效、綠色、健康發(fā)展的水生動物細菌性疾病新型治療方式具有重要意義。

1 噬菌體優(yōu)勢及其在副溶血弧菌感染防治方面的研究

1.1 噬菌體優(yōu)勢

噬菌體是一種能夠感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒總稱，可以特異性侵染宿主菌，引起宿主菌死亡[12]。噬菌體治療相對于抗生素治療具有其潛在的優(yōu)勢：首先，噬菌體只針對相應(yīng)的病原菌，具有高度的宿主特異性，主要通過受體結(jié)合蛋白（RBPs）與細菌表面受體特異性結(jié)合來完成吸附這一過程，隨后通過抑制宿主細胞細胞壁的合成或通過溶解酶破壞宿主細胞壁來靶向殺滅特定的菌株，這種特異性大大降低了其對環(huán)境和動物體中其他菌群的威脅，且治療效果不受細菌耐藥性影響[12-14]。從噬菌體特性來看，它可以隨宿主菌的增殖而指數(shù)增殖，并在細菌感染的整個過程發(fā)揮作用，這是一個重要優(yōu)勢[14-16]。其次，噬菌體具有宿主菌依賴性，只在細菌感染部位發(fā)生作用，裂解目標菌后會被降解或快速代謝掉[17]。最后，噬菌體來源非常豐富，易從宿主細菌棲息環(huán)境中發(fā)現(xiàn)并分離，常見于污水、土壤、廢液等容易滋生細菌的環(huán)境中[18]。從應(yīng)用方面來看，噬菌體制劑既可以潑灑，也可制成飼料，易于給藥。

1.2 副溶血弧菌噬菌體應(yīng)用

目前已有大量副溶血弧菌噬菌體被分離并報道。Guo 等[19]分離出一株新的ssDNA 噬菌體vB_VpaM_PG19，為致病性副溶血弧菌的潛在生物防治劑提供候選物。Tian 等[20]分離出一株副溶血弧菌特異性噬菌體vB_VpS_PG28，通過基因組注釋分析未發(fā)現(xiàn)任何與抗性或毒力因子相關(guān)的基因。Matamp 等[21]分離出一株副溶血弧菌噬菌體φVP-1，其可感染多重耐藥副溶血弧菌和溶藻弧菌菌株，而且具有進行基因組工程改造的可能性。

1.2.1 利用噬菌體檢測 噬菌體對宿主的敏感性和特異性在檢測方面具有重要的應(yīng)用前景。使用噬菌體檢測副溶血弧菌需提前篩選出裂解譜不同、裂解力強且穩(wěn)定的噬菌體株，并基于還原型輔酶I（NADH）作為指示劑，結(jié)合噬菌體的特異性和NADH的普遍性來實現(xiàn)對副溶血弧菌的定量檢測。該方法靈敏度高且用時短，操作簡便適用于現(xiàn)代快速檢測。但由于噬菌體的特異性識別不能感染所有的副溶血弧菌，因此應(yīng)用受到極大限制，但可以通過噬菌體雞尾酒療法進行優(yōu)化，從而有效克服這一缺點[22-23]。

1.2.2 利用噬菌體防治副溶血弧菌感染

1.2.2.1 軟體動物防治 副溶血弧菌在我國沿海水域、海產(chǎn)品中的檢出率較高，可引起多種養(yǎng)殖貝類大量死亡，是養(yǎng)殖貝類的主要病原菌之一，某些致病性副溶血弧菌也能污染貝類產(chǎn)品從而對人類健康構(gòu)成風(fēng)險[24-25]。而使用噬菌體來處理副溶血弧菌污染過的軟體動物，可有效控制養(yǎng)殖動物體內(nèi)及養(yǎng)殖環(huán)境中副溶血弧菌數(shù)量[26]。Jun 等[27-28]發(fā)現(xiàn)一株寬裂解譜噬菌體pVp-1 對27 株具有多重耐藥性的副溶血弧菌中的20 株具有良好的溶菌作用，并在此基礎(chǔ)上進行了生物防治試驗，結(jié)果采用藥浴或表面給藥均可使牡蠣感染得到有效控制。有研究人員考察了噬菌體制劑不同時間內(nèi)對牡蠣的保護作用，分別于感染后48 h 和72 h 處理人工污染的牡蠣，結(jié)果顯示牡蠣表面的副溶血弧菌滅活率分別為90%和99%[29]。

1.2.2.2 甲殼類動物防治 副溶血弧菌可引起對蝦多種疾病。目前已成功分離出諸多不同的副溶血弧菌噬菌體，并將其應(yīng)用于生物防治。Dubey 等[30]分離出一株絲狀副溶血弧菌特異性噬菌體V5，并測試噬菌體V5 控制對蝦副溶血弧菌感染的效力，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用噬菌體1 h 內(nèi)細菌數(shù)量減少了78.1%。Lomelí-Ortega 等[31]測試由vB_Vc_SrVc2 和vB_Vc_SrVc9 組成的噬菌體混合物對凡納對蝦仔蝦的保護作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：兩種噬菌體在體內(nèi)和體外條件下均具有抑制致病性弧菌生長的能力，噬菌體雞尾酒療法能夠選擇性有效減少弧菌數(shù)量（溶藻弧菌和副溶血弧菌）；同時組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，經(jīng)噬菌體處理的對蝦，其肝胰腺損傷減弱。Jun 等[32]使用噬菌體pVp-1 對22 個從不同區(qū)域分離出的致AHPND 副溶血弧菌菌株（VpAHPND，5 株亞洲型和17 株墨西哥型）進行了感染試驗，發(fā)現(xiàn)該噬菌體能夠感染其中20 株菌株，并對3 株已知的高致病性菌株（13-028/A3 來自越南，13-511/A1 和13-306D/4 來自墨西哥）表現(xiàn)出顯著的溶菌活性，表明噬菌體pVp-1在防控AHPND方面具有巨大潛力。2018 年為了評估噬菌體對AHPND 的有效性，Jun等[33]利用凡納對蝦進行了一系列生物測定，并對其死亡率及組織學(xué)變化進行了監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)使用口服方式多次投喂pVp-1 噬菌體進行預(yù)防和治療可以使對蝦在致命菌株攻擊中存活，且組織損傷明顯減弱。2022 年，González-Gómez 等[34]從墨西哥錫那羅亞州的河口水中分離出兩株噬菌體（vB_VpaP_AL-1和vB_VpaS_AL-2），發(fā)現(xiàn)其可以感染墨西哥分離的VpAHPND，通過基因組測序沒有發(fā)現(xiàn)與毒力、溶原性或抗生素抗性相關(guān)基因。因此，噬菌體作為特異性病原體的防治手段，在防治甲殼類動物副溶血弧菌感染方面具有巨大潛力。Li 等[35]還分離到對坎貝氏弧菌（V.campbellii）具有強烈裂解能力的弧菌噬菌體vB_VcaS_HC。由于坎貝氏弧菌可與副溶血弧菌發(fā)生質(zhì)粒轉(zhuǎn)移而獲得致AHPND 的毒力，因此使用坎貝氏弧菌噬菌體來殺滅坎貝氏弧菌，可以降解由于致病性副溶血弧菌與其他弧菌發(fā)生結(jié)合轉(zhuǎn)移對甲殼動物造成的傷害[36-37]。

1.2.2.3 魚類防治 副溶血弧菌同樣可引起魚類發(fā)病，在對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失的同時，也同樣導(dǎo)致食品安全風(fēng)險。Lal 等[38]分離出一株可以抑制副溶血弧菌的噬菌體VpKK5，可以裂解對魚類致病的副溶血弧菌菌株。研究發(fā)現(xiàn)：噬菌體即使在生魚片等復(fù)雜的食物基質(zhì)中也能感染和破壞病原體，顯著降低生魚片中的副溶血弧菌含量；噬菌體濃度越高，殺菌效果越明顯，結(jié)合低溫處理，對樣品中副溶血弧菌的控制效果更好。因此，噬菌體具有防治副溶血弧菌感染和作為生物殺菌劑的應(yīng)用潛力[39-40]。

1.3 噬菌體生物工程改造

隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，通過對現(xiàn)有噬菌體進行人工修飾，擴大噬菌體宿主范圍，彌補噬菌體治療中的一些缺陷，從而解決當前噬菌體在防治副溶血弧菌感染中的一些問題。

1.3.1 改變噬菌體宿主范圍 Hoshiga 等[41]使用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對T2 噬菌體基因組進行編輯，將T2 噬菌體的長尾纖維和短尾纖維的末端替換為PP01 噬菌體的對應(yīng)基因，發(fā)現(xiàn)成功改造后的噬菌體對大腸桿菌O157:H7 顯示出與PP01 相當?shù)奈侥芰Γ斯U大了大腸桿菌O157:H7 特異性噬菌體范圍。李艷秀等[42]將兩株T4 噬菌體的宿主決定區(qū)基因片段進行了同源重組，使獲得的嵌合噬菌體具備相對較寬的宿主譜，且可以穩(wěn)定遺傳，從而為快速構(gòu)建針對特定病原菌的噬菌體奠定了基礎(chǔ)。

1.3.2 改變噬菌體對特定宿主菌的裂解能力 內(nèi)溶素（endolysin）是來自噬菌體的肽聚糖水解酶。利用基因工程克隆和重組內(nèi)溶素可有助于解決使用噬菌體控制副溶血弧菌的不足。Xia 等[43]分離了一株副溶血弧菌特異性噬菌體F23s1，隨后將其內(nèi)溶素基因克隆并在大腸桿菌中成功表達，研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)溶素LysF23s1 對耐藥的副溶血弧菌（23/23）和沙門氏菌（12/13）具有裂解活性，并顯示出比完整噬菌體（13/37）更寬的裂解譜。Ning 等[44]基于來自副溶血弧菌噬菌體的內(nèi)溶素Lysqdvp001 設(shè)計了3 種陽離子肽修飾內(nèi)溶素（Lysqdvp001-5aa、Lysqdvp001-10aa 和Lysqdvp001-15aa），發(fā)現(xiàn)這些重組內(nèi)溶素顯示出與Lysqdvp001 相當?shù)碾木厶撬饣钚?，能夠從外部裂解細菌；在使用最低殺菌濃度時，Lysqdvp001-15aa 根除了約50%的副溶血弧菌生物膜，并抑制了90%以上的細菌生物膜形成。

2 副溶血弧菌噬菌體現(xiàn)存問題及對策

噬菌體特異性普遍較強，宿主范圍一般較窄。而海洋動物的生存環(huán)境復(fù)雜，細菌病的暴發(fā)往往不是單種細菌引起的，因此單一的噬菌體很難起到很好的防治效果。利用噬菌體來控制水產(chǎn)養(yǎng)殖中的弧菌雖然是有利的，但有報道[45]認為，在單一噬菌體治療弧菌病的情況下，弧菌能產(chǎn)生一定的抗性進而降低防治效果，而使用噬菌體混合物（V1G、V1P1 和V1P2）明顯延緩了細菌抗性的演化，使噬菌體可以持續(xù)侵染細菌，這說明在防治疾病過程中，多個噬菌體的聯(lián)合使用是控制弧菌病的重要策略。Mateus 等[46]評估了多株副溶血弧菌噬菌體混合物（VP-1、VP-2 和VP-3）在水產(chǎn)養(yǎng)殖中控制弧菌的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與單獨使用VP-1、VP-2噬菌體相比，混合使用2 株或3 株噬菌體防治效果和效率均有不同程度的提高，且延遲了細菌抗性發(fā)展。因此可以考慮循環(huán)使用不同的裂解性噬菌體來避免細菌抗性的產(chǎn)生，并且使用噬菌體雞尾酒療法，將不同裂解譜的噬菌體結(jié)合起來，對受感染的動物進行治療，從而獲得更為全面的治療效果[47]。噬菌體雞尾酒療法還可與其他療法聯(lián)合使用，例如“噬菌體-抗生素聯(lián)合療法”和“噬菌體-益生菌聯(lián)合療法”。2021 年Engeman 等[48]使用5 株銅綠假單胞菌噬菌體與4 種抗生素聯(lián)合治療，發(fā)現(xiàn)在噬菌體存在的情況下，對這些抗生素敏感的銅綠假單胞菌菌株數(shù)分別有不同程度的增加。2014 年，Surekhamol 等[49]評估了噬菌體對蝦生產(chǎn)系統(tǒng)中有益微生物群的侵染情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中使用的硝化細菌和蠟狀芽孢桿菌、節(jié)桿菌等益生菌對添加的病原菌噬菌體均不敏感，表明在對蝦生產(chǎn)系統(tǒng)中噬菌體與益生菌療法相結(jié)合有一定的可行性。

值得注意的是，噬菌體的安全風(fēng)險仍需進一步評估。目前已發(fā)現(xiàn)某些噬菌體在致病菌毒力或抗生素抗性演化中發(fā)揮重要作用[50]，如霍亂弧菌、鏈球菌等都存在噬菌體介導(dǎo)的毒力基因轉(zhuǎn)移[51-52]。副溶血弧菌O3:K6 血清型含有質(zhì)粒pO3K6，其被證明是來自絲狀噬菌體f237基因組，其編碼的ORF8 可能與副溶血弧菌所致的食源性腹瀉大流行相關(guān)[53]。由于副溶血弧菌在海水養(yǎng)殖環(huán)境中普遍存在，早期對副溶血弧菌致AHPND 的機制研究上，曾懷疑副溶血弧菌獲得的致病性是由溶源性噬菌體帶來的[54]。但經(jīng)過對多株VpAHPND的溶源性噬菌體分析，未觀察到溶源性噬菌體與副溶血弧菌的致病性存在某種關(guān)聯(lián)，否定了這一猜測[55]。最近的研究[7，37，56-58]證明，VpAHPND的毒力質(zhì)粒是通過接合轉(zhuǎn)移或者自然轉(zhuǎn)化在弧菌間傳遞。這些研究可消除人們對應(yīng)用噬菌體可能會增強AHPND 相關(guān)副溶血弧菌致病性的擔(dān)憂。

3 展望

世界衛(wèi)生組織（WHO）在2015年通過了《Global Action Plan on Antimicrobial Resistance》（https://www.who.int/publications/i/item/9789241509763），世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）全球大會也在同年5 月通過了《Resolution No.26: Combating Antimicrobial Resistance and Promoting the Prudent Use of Antimicrobial Agents in Animals》，并在《水生動物衛(wèi)生法典》對水生動物中抗生素使用問題做了嚴格規(guī)定，以限制抗生素濫用。《中華人民共和國生物安全法》也將微生物耐藥作為一個重要的生物安全問題考慮。噬菌體是破解抗生素濫用所導(dǎo)致的微生物耐藥難題的新型生物制劑，其宿主特異性和對特定病原菌的高效裂解能力賦予了這一技術(shù)領(lǐng)域廣闊的應(yīng)用前景。但是，在噬菌體走向?qū)嶋H應(yīng)用市場的過程中，除了在科學(xué)技術(shù)方面需要取得突破以外，還需要滿足批量化生產(chǎn)的條件和獸藥生物制劑相關(guān)法律的規(guī)定。按照《獸藥管理條例》等法規(guī)的相關(guān)規(guī)定，須進行臨床前研究審核和臨床試驗。近年來，我國在動物藥劑行業(yè)已有企業(yè)投入了噬菌體產(chǎn)品的商業(yè)開發(fā)[59]。目前，噬菌體在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的研究還處在初級階段，深入研究噬菌體的結(jié)構(gòu)與功能，揭示噬菌體與宿主之間相互作用關(guān)系，是推動噬菌體應(yīng)用于生產(chǎn)實踐的重要基礎(chǔ)。優(yōu)化噬菌體的雞尾酒療法、噬菌體基因編輯等，將成為噬菌體治療研究領(lǐng)域的重要方向。相信隨著國內(nèi)外噬菌體領(lǐng)域研究的不斷深入，噬菌體將逐步成為水產(chǎn)養(yǎng)殖綠色發(fā)展和生物安保的重要工具。