凡納濱對(duì)蝦感染W(wǎng)SSV后的熒光定量分析

鐘新英,蘇曉茹,張藝娜,張美芳,史曉麗

（寧德師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，福建 寧德 352100）

對(duì)蝦白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是對(duì)蝦養(yǎng)殖中毒害最大的病毒之一，其所導(dǎo)致的對(duì)蝦白斑綜合癥傳播速度快、破壞性強(qiáng)、防治困難，給我國(guó)乃至全球的對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了極大的危害，制約了對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[1].據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年因此造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)到數(shù)千萬(wàn)元[2].為了降低該病毒的危害，在過(guò)去的數(shù)十年里，學(xué)者們開(kāi)展了大量的研究工作，如控制水質(zhì)量、切斷傳播途徑、提高對(duì)蝦抵抗力等，但是效果并不顯著[3-6].

在WSSV 的侵染過(guò)程中，檢測(cè)感染對(duì)蝦的病毒含量是了解病毒侵染過(guò)程最重要方法之一.宿主的抗性也會(huì)影響疾病的暴發(fā)[7]，宿主中的病毒含量可以反應(yīng)出它們對(duì)疾病的抵抗力及感染時(shí)期[8-9]，故病毒含量檢測(cè)尤為重要.目前已有多種檢測(cè)WSSV含量的方法，如原位雜交、免疫組化、一步法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)、多重PCR 和real-time PCR 等[10-11].在諸多方法中，real-time PCR 因其檢測(cè)快速、靈敏度高，常被用于實(shí)時(shí)檢測(cè)感染對(duì)蝦病毒含量，目前已被應(yīng)用于斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)、中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)、日本對(duì)蝦(Penaeus japonicus)等對(duì)蝦的病毒含量檢測(cè)[12-13].已有研究表明，在對(duì)蝦養(yǎng)殖過(guò)程中，處于低濃度感染時(shí)，對(duì)蝦不一定會(huì)暴發(fā)性死亡，攜帶少量病毒的對(duì)蝦可以繼續(xù)生存，如細(xì)角瀕對(duì)蝦(Litopenaeus stylirostris)體內(nèi)病毒含量雖已達(dá)到2.1×103～2.72×105copies·ng-1，但其還可以繼續(xù)生長(zhǎng)且沒(méi)有表現(xiàn)出任何臨床癥狀[15].只有當(dāng)對(duì)蝦體內(nèi)的病毒含量達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，如凡納濱對(duì)蝦（Litope?naeus vannamei）為1.6×106copies·ng-1、細(xì)角濱對(duì)蝦為4.3×105～3.0×106copies·ng-1、斑節(jié)對(duì)蝦為2.1×106copies·ng-1時(shí)，對(duì)蝦才會(huì)死亡[14].孟憲紅[16]在中國(guó)對(duì)蝦的研究中發(fā)現(xiàn)，不同感染時(shí)期（感染初期、高峰期和后期）對(duì)蝦死亡個(gè)體的WSSV 含量分別為8.8×104～1.5×105、4.4×105～1.2×106、8.5×105～4.6×106copies·ng-1，死亡個(gè)體的平均WSSV 含量為9.5×106copies·ng-1，這也表明，WSSV 的感染程度和對(duì)蝦死亡之間存在一定的關(guān)聯(lián).此外，不同對(duì)蝦品種之間的差異也較大，如孫成波等[17]對(duì)凡納濱對(duì)蝦和斑節(jié)對(duì)蝦致死量的研究發(fā)現(xiàn)，不同感染時(shí)間（感染后24、48 h 和瀕死個(gè)體）2 種對(duì)蝦攜帶病毒數(shù)量的范圍為1.6×105～4.3×105copies·g-1，這也為實(shí)踐中進(jìn)一步優(yōu)化對(duì)蝦養(yǎng)殖條件、減少和控制WSSV暴發(fā)提供了理論基礎(chǔ).

凡納濱對(duì)蝦又稱南美白對(duì)蝦，具有抗逆力強(qiáng)、生長(zhǎng)快、繁殖期長(zhǎng)、耐低鹽養(yǎng)殖等優(yōu)點(diǎn),是世界對(duì)蝦養(yǎng)殖的三大品種之一，也是我國(guó)極為重要的養(yǎng)殖對(duì)蝦[18]，但其養(yǎng)殖長(zhǎng)期受到WSSV 病害的困擾.因此，本研究通過(guò)對(duì)凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行WSSV人工投喂感染，采用real-time PCR 技術(shù)，對(duì)不同感染時(shí)期的凡納濱對(duì)蝦組織樣品進(jìn)行病毒含量檢測(cè)，觀察感染W(wǎng)SSV后對(duì)蝦體內(nèi)病毒含量的增殖變化，以期為凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖過(guò)程中WSSV的防治及抗WSSV育種提供參考.

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試對(duì)蝦購(gòu)買自寧德對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)，購(gòu)買后運(yùn)輸至寧德師范學(xué)院國(guó)家海洋局海西海洋生物種質(zhì)資源及生物制品開(kāi)放利用公共服務(wù)平臺(tái)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行暫養(yǎng).暫養(yǎng)期間，每日投喂3 次配合餌料（日投喂量占對(duì)蝦總體質(zhì)量的3%～5%），每日換水，換水量根據(jù)攝食情況調(diào)整，溫度在26～28 ℃之間，鹽度27‰.對(duì)蝦體長(zhǎng)5～8 cm，體質(zhì)量1.5～2.8 g，約500 尾.WSSV 人工感染實(shí)驗(yàn)前，隨機(jī)選取5 尾對(duì)蝦進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，確認(rèn)對(duì)蝦體內(nèi)WSSV含量為陰性后再進(jìn)行后續(xù)感染.

1.2 WSSV人工感染

采用單尾、口飼法對(duì)凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行WSSV人工感染.感染所用毒餌為中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所對(duì)蝦遺傳育種實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)，病毒含量為107copies·ng-1，加入可食用紅色色素混合均勻后即可進(jìn)行下一步感染，感染之前毒餌暫存于-80 ℃冰箱.感染之前，對(duì)蝦先饑餓處理12 h，保證其腸胃排空.之后將對(duì)蝦撈至單獨(dú)容器中，用鑷子夾取約10 mg毒餌送至對(duì)蝦口器處，待對(duì)蝦飽食后即可在胃部觀察到明顯的紅色，然后將其放回至養(yǎng)殖桶.所有對(duì)蝦飼喂完成后，正常養(yǎng)殖，并觀察對(duì)蝦死亡情況，及時(shí)撈出死亡個(gè)體.

1.3 樣品采集及處理

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，從出現(xiàn)第一尾死亡對(duì)蝦開(kāi)始，每隔2 h撈取死亡對(duì)蝦，記錄其死亡時(shí)間、體重及水溫，并取其肌肉組織保存于-20 ℃冰箱中，用于后續(xù)病毒含量的檢測(cè).

1.4 病毒含量測(cè)定

使用TIANGEN 基因組DNA 提取試劑盒對(duì)對(duì)蝦肌肉組織的DNA 進(jìn)行提取，DNA 提取結(jié)束后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度.采用SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit II 對(duì)病毒的絕對(duì)含量進(jìn)行測(cè)定（艾科瑞，湖南），引物由上海生工生物工程公司合成.熒光定量PCR 反應(yīng)體系參考說(shuō)明書(shū)，具體如下：2×SYBR Green Pro Taq HS Premix II 10 μL，模板2 μL，引物各0.8 μL (10 μmol·L-1)，ROX 0.4 μL (4 μmol·L-1)，加無(wú)菌水補(bǔ)至20 μL.PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40 個(gè)循環(huán).實(shí)驗(yàn)所用引物見(jiàn)表1；實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)品為自行合成的含有目標(biāo)片段的重組pMD-T∕WSSV69 質(zhì)粒，質(zhì)粒濃度為5.0×108copies·μL-1，將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10 倍梯度稀釋并對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，采用滅過(guò)菌的雙蒸水作為陰性對(duì)照，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)平行.每個(gè)DNA樣品平行檢測(cè)2次，取其平均值作為該樣品的病毒含量值.

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物序列

1.5 數(shù)據(jù)處理分析

采用SPSS 22.0的單因素方差分析（One-way ANOVA）對(duì)對(duì)蝦體內(nèi)的病毒含量進(jìn)行分析，顯著性水平為0.05.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 人工感染W(wǎng)SSV結(jié)果

對(duì)蝦感染W(wǎng)SSV后的死亡情況見(jiàn)圖1，感染34 h以后，開(kāi)始出現(xiàn)死亡對(duì)蝦，感染150 h為死亡高峰期，高峰期死亡85 尾，最后沒(méi)有對(duì)蝦存活，對(duì)蝦最長(zhǎng)存活時(shí)間為285 h，累計(jì)出池對(duì)蝦487 尾，對(duì)蝦平均體重（4.34±0.47）g.結(jié)合對(duì)蝦死亡情況，我們把感染后的40～60 h定為死亡初期，感染140～170 h定為死亡高峰期，感染230～250 h定為死亡后期.每個(gè)時(shí)期選取20尾對(duì)蝦進(jìn)行基因組DNA的提取，統(tǒng)計(jì)分析病毒含量.

圖1 凡納濱對(duì)蝦感染W(wǎng)SSV后的死亡情況

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備結(jié)果

以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的Log值為橫坐標(biāo)，以測(cè)得的Ct值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2=0.998 2，且所有的陰性對(duì)照均沒(méi)有擴(kuò)增信號(hào).

圖2 質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 對(duì)蝦體內(nèi)病毒含量分析

不同時(shí)期的死亡對(duì)蝦體內(nèi)的病毒含量結(jié)果見(jiàn)表2.隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，死亡對(duì)蝦體內(nèi)的病毒含量在逐漸升高.感染初期、高峰期和后期，死亡對(duì)蝦體內(nèi)的病毒含量分別為1.37×105～4.47×106、1.92×106～1.30×107、3.75×106～1.90×107copies·ng-1，各感染時(shí)期的平均病毒含量分別為1.56×106、7.56×106、1.02×107copies·ng-1.應(yīng)用獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)分析各期對(duì)蝦體內(nèi)的病毒含量，感染初期和后期對(duì)蝦體內(nèi)WSSV 含量差異顯著(P=0.023).

表2 死亡對(duì)蝦體內(nèi)WSSV含量

3 討論

人工感染W(wǎng)SSV的方法包括飼喂、注射、浸泡等，其中，注射方法見(jiàn)效快，對(duì)蝦死亡較快，但容易給對(duì)蝦造成機(jī)械損傷；浸泡方法不會(huì)產(chǎn)生機(jī)械損傷，但WSSV 一旦游離在海水中4 h就會(huì)失去感染活性[19]，故其浸泡效果不是很好.通常對(duì)蝦主要是通過(guò)攝食攜帶WSSV的對(duì)蝦或者鹵蟲(chóng)導(dǎo)致病毒感染，所以本實(shí)驗(yàn)采用口飼的方法對(duì)對(duì)蝦進(jìn)行感染，符合自然狀態(tài)下養(yǎng)殖對(duì)蝦感染W(wǎng)SSV 的情況，這與逄錦菲[20]報(bào)道的研究方法類似，并且在感染過(guò)程中，隨時(shí)撈出死亡對(duì)蝦，有效防止了對(duì)蝦殘食帶來(lái)的重復(fù)感染，確保了結(jié)果的準(zhǔn)確性.

WSSV 在養(yǎng)殖池塘中一旦爆發(fā)，造成的死亡率可以達(dá)到100%、，但是不同的對(duì)蝦種類、感染方式和感染劑量會(huì)影響對(duì)蝦最終的死亡時(shí)間[19].如孫成波等[17]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)注射的方式感染凡納濱對(duì)蝦和斑節(jié)對(duì)蝦后，在低劑量感染的時(shí)候，凡納濱對(duì)蝦表現(xiàn)出了更明顯的抗性，而在WSSV 劑量為6×104copies時(shí)，凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)的WSSV 含量在感染后的48 h，便達(dá)到了107copies·g-1，對(duì)蝦的平均存活時(shí)間為79.5 h，而斑節(jié)對(duì)蝦的平均存活時(shí)間僅為65.7 h.Durand 等[21]也研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用104copies 的WSSV 對(duì)對(duì)蝦進(jìn)行注射后，所有對(duì)蝦在4 d 內(nèi)全部死亡.逄錦菲[20]通過(guò)對(duì)中國(guó)對(duì)蝦“黃海2 號(hào)”進(jìn)行大規(guī)模的口飼WSSV 感染，發(fā)現(xiàn)感染后期死亡對(duì)蝦體內(nèi)的平均病毒含量為8.71×105copies·ng-1，對(duì)蝦最長(zhǎng)存活時(shí)間達(dá)到了602 h.本實(shí)驗(yàn)通過(guò)口飼法感染凡納濱對(duì)蝦，每尾對(duì)蝦攝食的餌料中的病毒粒子達(dá)到了109copies，超過(guò)了很多學(xué)者通過(guò)注射或者浸泡測(cè)試對(duì)蝦抗WSSV的劑量，最長(zhǎng)的存活時(shí)間為285 h，說(shuō)明了凡納濱對(duì)蝦對(duì)WSSV具有較強(qiáng)的耐受力.

已有研究發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過(guò)WSSV感染存活的中國(guó)對(duì)蝦個(gè)體內(nèi)，病毒含量出現(xiàn)了兩級(jí)分化的現(xiàn)象，有的對(duì)蝦體內(nèi)病毒含量很低（＜100 copies·ng-1），有的對(duì)蝦體內(nèi)病毒含量很高（＞106copies·ng-1）[20].孟憲紅[16]也發(fā)現(xiàn)，在中國(guó)對(duì)蝦大規(guī)模的WSSV感染中，最終存活的個(gè)體中有一半對(duì)蝦體內(nèi)的病毒含量小于100 copies·ng-1.Huang等[14]在凡納濱對(duì)蝦的研究中也發(fā)現(xiàn)，高抗家系存活對(duì)蝦的WSSV 含量(23.84±2.56)×106copies·g-1顯著低于其他家系，這就說(shuō)明有的對(duì)蝦是可以阻止WSSV 在體內(nèi)復(fù)制的，而有的對(duì)蝦可以耐受更高水平的WSSV 劑量，那些高抗性的對(duì)蝦一方面可以阻止病毒的復(fù)制，另一方面還可以耐受一定的高水平的WSSV 劑量.本實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)存活對(duì)蝦，感染后期死亡對(duì)蝦個(gè)體中的平均WSSV 含量在107copies·ng-1，最小和最大WSSV含量值僅差了10倍，差異不顯著，沒(méi)有出現(xiàn)兩極分化的現(xiàn)象.但是在病毒含量的檢測(cè)中，我們發(fā)現(xiàn)，早期死亡的對(duì)蝦個(gè)體內(nèi)的最小病毒含量?jī)H為1.37×105copies·ng-1，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，死亡對(duì)蝦體內(nèi)的最小病毒含量達(dá)到了106copies·ng-1，說(shuō)明在感染后期死亡的對(duì)蝦對(duì)WSSV的耐受力更強(qiáng)，感染實(shí)驗(yàn)中存活時(shí)間久的對(duì)蝦對(duì)WSSV的抵抗力顯著強(qiáng)于存活時(shí)間短的對(duì)蝦，這就為進(jìn)一步開(kāi)展抗WSSV相關(guān)的分子生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ).

本研究以商品化的凡納濱對(duì)蝦為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)口飼的方法進(jìn)行WSSV 感染，分析了感染后的WSSV含量變化，為解決凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖過(guò)程中的WSSV病害防治提供了理論參考價(jià)值.