農(nóng)桿菌介導(dǎo)細(xì)基江蘺繁枝變種轉(zhuǎn)化體系的建立

何藝賓，劉 杰，郝 華，彭 會(huì)*

（1.廈門海洋職業(yè)技術(shù)學(xué)院 海洋生物學(xué)院，福建 廈門 361100；2.廈門大學(xué)海洋生物制備技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361104）

江蘺（Gracilaria）是一種重要的大型海洋經(jīng)濟(jì)藻類，其富含藻膠,是瓊脂提取的主要原料[1-2].據(jù)報(bào)道，瓊脂提煉工廠每年大約消耗72 300 t（干重）富含藻膠的植物原料，生產(chǎn)9 600 t 瓊脂，能夠創(chuàng)造大約17 300萬美元的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[3].隨著經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，瓊脂的需求量逐年增加，天然產(chǎn)的江蘺已經(jīng)無法滿足人們的需求，亟需進(jìn)行大規(guī)模的江蘺人工養(yǎng)殖.但由于江蘺在人工養(yǎng)殖過程中容易出現(xiàn)藻種老化、藻體染病等問題，其人工大規(guī)模養(yǎng)殖受到嚴(yán)重阻礙[4].利用分子基因工程技術(shù)對(duì)江蘺藻種進(jìn)行品種改良是解決當(dāng)前江蘺人工養(yǎng)殖所產(chǎn)生問題的有效途徑之一.但目前江蘺基因工程的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他大型海洋經(jīng)濟(jì)藻類,如紫菜(Porphyra)等[5]，除Gan 等[6]利用基因槍在張氏江蘺（Gracilaria changii）中獲得lacZ基因的瞬時(shí)表達(dá)研究外，有關(guān)江蘺轉(zhuǎn)基因技術(shù)方法的報(bào)道也較為罕見.

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法具有操作簡(jiǎn)單、可轉(zhuǎn)移大片段DNA、插入基因整合拷貝數(shù)低、遺傳穩(wěn)定性好、重排少和可優(yōu)先整合到轉(zhuǎn)錄活性區(qū)等優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)前植物基因工程最常用的方法[7].楊澤熵等[8]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法在萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中表達(dá)外源酵母菌gpd1基因；覃曉云等[9]建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)地萊茵衣藻轉(zhuǎn)化體系.鑒于此，本研究以細(xì)基江蘺繁枝變種（Gracilaria tenuistipitatavar.liui Zhang et Xia）類愈傷組織為受體材料，采用桿菌介導(dǎo)的方法建立細(xì)基江蘺繁枝變種轉(zhuǎn)化體系，旨在為江蘺品種的遺傳改良提供參考.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試材料：細(xì)基江蘺繁枝變種，采集自福建東山島杏陳鎮(zhèn).

主要實(shí)驗(yàn)試劑：乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）、潮霉素B、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）、激動(dòng)素（kinetin，KT）、2,4二氯苯氧乙酸（2,4-D）均購自Sigma公司.

1.2 細(xì)基江蘺繁枝變種類愈傷組織的誘導(dǎo)

步驟1：用軟毛刷去除細(xì)基江蘺繁枝變種藻體表面的沙泥等雜物[10]，并用無菌海水清洗3遍，然后置于25‰無菌海水（含200 mg·L-1卡那霉素）中培養(yǎng)2 d，培養(yǎng)條件為25 ℃，120 μmol·photons·m-2·s-1，光照周期L∕D=12∕12.

步驟2：選取步驟1 中培養(yǎng)的健康生長(zhǎng)的藻體，摘取中間部位外植體4～5 cm（介于頂端和主干之間），用無菌海水清洗3 遍，將清洗后的外植體切成1～2 cm 大小，置于1.5%碘化鉀溶液中浸泡10 min，取出后用無菌海水清洗3遍，然后分別用含有不同激素組合的培養(yǎng)液暗培養(yǎng)21 d（培養(yǎng)溫度20 ℃）.暗培養(yǎng)結(jié)束后，分別觀察并統(tǒng)計(jì)不同實(shí)驗(yàn)組的類愈傷組織誘導(dǎo)率.具體的激素組合包括組合1（25‰MES 培養(yǎng)液添加20 μmol·L-1MeJA、0.5 mg·L-1KT、2.0 mg·L-12,4-D、200 mg·L-1卡那霉素）和組合2（25‰MES培養(yǎng)液添加20 μmol·L-1MeJA、0.5 mg·L-1KT、1.5 mg·L-12,4-D、200 mg·L-1卡那霉素）.

1.3 農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)外源gfp基因轉(zhuǎn)化類愈傷組織

用接種環(huán)挑取農(nóng)桿菌EHA105（攜帶植物雙元表達(dá)載體pMDC85-Gfp 質(zhì)粒DNA）單菌落，接種于5 mL 含50 mg·L-1卡那霉素、50 mg·L-1利福平的LB 液體培養(yǎng)基（25‰海水配制）中，置于28 ℃，200 r·min-1條件下培養(yǎng)過夜.隔天按1%～2%的比例將前一天培養(yǎng)的菌種接種到新鮮的LB 培養(yǎng)基（含50 mg·L-1卡那霉素、100 μ mol·L-1AS、25‰海水配制）中，振蕩培養(yǎng)，進(jìn)行二次活化.測(cè)定細(xì)菌培養(yǎng)液在600 nm 處的吸光值，當(dāng)OD600為0.4～0.5時(shí)，進(jìn)行6 500 r·min-1離心處理5 min，收集菌液于無菌離心管中，用等體積的25‰無菌海水（含50 mg·L-1卡那霉素、100 μmol·L-1AS）重懸.將方法1.2處理獲得的類愈傷組織接種到農(nóng)桿菌重懸菌液（含50 mg·L-1卡那霉素、100 μmol·L-1AS）中，抽真空15 min，25 ℃,避光培養(yǎng)48 h.

培養(yǎng)48 h 后，將類愈傷組織置于含500 mg·L-1羧芐青霉素、200 mg·L-1卡那霉素的25‰無菌海水中浸泡30 min，然后用25‰無菌海水清洗3遍，清洗后置于熒光顯微鏡（Axio Scope A1，德國ZEISS）下觀察類愈傷組織轉(zhuǎn)化子中綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)報(bào)告基因的表達(dá)情況.

1.4 轉(zhuǎn)化子PCR鑒定

分別選取GFP 綠色熒光檢測(cè)陽性的轉(zhuǎn)化子和野生型類愈傷組織（約10 mg），置于1.5 mL Eppendorf離心管中，用手持式勻漿研磨儀迅速將類愈傷組織研磨成勻漿，加入400 μL DNA 提取液（200 m mol·L-1Tris-HCL（pH 8.0）、250 mmol·L-1NaCL、25 m mol·L-1EDTA，0.5%SDS，高壓滅菌后使用），劇烈搖動(dòng)混勻后，12 000 r·min-1離心2 min，取上清液300 μL 加入到另一個(gè)1.5 mL Eppendorf 離心管中，加入等體積異丙醇，輕輕混勻后于室溫下靜置2 min，然后12 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，并室溫放置15 min，然后加入50 μL ddH2O 使沉淀完全溶解，即得到DNA 粗提液.分別取1 μL 基因組DNA 為模板，以引物GF:5′-GGA GAA GAA CTT TTC ACT GG-3′和引物GR：5′-GTT CAT CCA TGC CAT GTG TA-3′為擴(kuò)增引物，用東盛生物2×Hs Taq mix進(jìn)行PCR鑒定.

PCR 擴(kuò)增體系（25 μL）：1 μL 模板DNA,1 μL 引物GF（10 μ mol·L-1）,1 μL 引物GR（10 μmol·L-1）,12.5 μL 2×Hs Taq mix,9.5 μL ddH2O.PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃5 min，95 ℃1 min,55 ℃45 s,72 ℃1 min,72 ℃10 min,30個(gè)循環(huán).

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 細(xì)基江蘺繁枝變種類愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果

外植體分別在2 種不同植物激素組合的培養(yǎng)液中暗培養(yǎng)21 d 后，觀察發(fā)現(xiàn)，2 種不同植物激素組合的培養(yǎng)液均能誘導(dǎo)出透明的類愈傷組織，且組合1 的類愈傷組織誘導(dǎo)率好于組合2，組合1 的類愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)56.98%（表1），且其誘導(dǎo)出的類愈傷組織位于外植體頂端（圖1）.

圖1 組合1誘導(dǎo)獲得的細(xì)基江蘺繁枝變種類愈傷組織

表1 細(xì)基江蘺繁枝變種類愈傷組織的誘導(dǎo)率統(tǒng)計(jì)表

2.2 農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的外源gfp基因轉(zhuǎn)化類愈傷組織

由圖2 可知,類愈傷組織與農(nóng)桿菌EHA105 培養(yǎng)48 h 后在熒光顯微鏡中觀察發(fā)現(xiàn)：類愈傷組織轉(zhuǎn)化子表面可見數(shù)量不等的發(fā)綠色熒光的小斑點(diǎn)，即為表達(dá)gfp基因的轉(zhuǎn)基因組織，而對(duì)照組類愈傷組織中未能檢測(cè)到GFP 綠色熒光.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，農(nóng)桿菌EHA105 介導(dǎo)法可實(shí)現(xiàn)外源gfp基因在類愈傷組織中的表達(dá)，植物雙元表達(dá)載體pMDC85-Gfp質(zhì)粒DNA 表達(dá)框架如圖3所示.

圖2 轉(zhuǎn)基因類愈傷組織的GFP熒光檢測(cè)結(jié)果

圖3 植物雙元表達(dá)載體pMDC85-Gfp質(zhì)粒DNA表達(dá)框架

2.3 轉(zhuǎn)化子PCR鑒定結(jié)果

隨機(jī)選取2個(gè)GFP 綠色熒光檢測(cè)陽性的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR 鑒定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，外源gfp基因在農(nóng)桿菌EHA105的介導(dǎo)下成功地整合到細(xì)基江蘺繁枝變種類愈傷組織的基因組DNA中.如圖4所示，泳道1、2 為隨機(jī)選取的2 個(gè)轉(zhuǎn)化子基因組DNA PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果，2 個(gè)泳道中均出現(xiàn)單一的條帶，且條帶大小與gfp基因大小一致，而對(duì)照組野生型類愈傷組織基因DNA PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果中未見目的條帶.

圖4 轉(zhuǎn)化子PCR鑒定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

在高等植物的組織培養(yǎng)中，通常使用植物激素來誘導(dǎo)愈傷組織的形成并促進(jìn)其生長(zhǎng)與分化.通常只需單獨(dú)使用2,4-D就能成功地誘導(dǎo)出植物愈傷組織，其使用的工作濃度介于0.001～10 mg·L-1.然而在海藻組織培養(yǎng)中，植物激素是否能促進(jìn)其生長(zhǎng)，是長(zhǎng)期以來在藻類學(xué)界中有爭(zhēng)議的問題[11].迄今為止，植物激素對(duì)細(xì)基江蘺繁枝變種愈傷組織誘導(dǎo)的影響尚未見報(bào)道.課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，MeJA 對(duì)細(xì)基江蘺繁枝變種外植體的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，最佳使用濃度為20 μ mol·L-1.本研究中利用3種植物激素的不同組合，成功地誘導(dǎo)出了細(xì)基江蘺繁枝變種愈傷組織.由此可見，植物激素對(duì)江蘺類愈傷組織的誘導(dǎo)具有促進(jìn)作用.

本研究首次報(bào)道采用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)方法實(shí)現(xiàn)了外源gfp基因在江蘺類愈傷組織中的表達(dá).農(nóng)桿菌EHA105主要用于高等單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化，通過與愈傷組織共培養(yǎng)的方式侵染愈傷組織，從而實(shí)現(xiàn)外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化.因此，農(nóng)桿菌EHA105能否在海水培養(yǎng)基中生長(zhǎng)且具有侵染力是影響轉(zhuǎn)基因成敗的關(guān)鍵因素之一.

綜上，細(xì)基江蘺繁枝變種外植體的類愈傷組織可作為受體材料，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法可實(shí)現(xiàn)外源gfp基因在類愈傷組織中的表達(dá)，可為江蘺品種的遺傳改良提供參考.