89株蠟樣芽孢桿菌食品分離株攜帶毒力基因情況及PFGE分型研究*

盧曉蕓，施怡茹，吳麗珠，高紅梅，郁 晞，莊 源，張紅芝，徐秋芳△

1.上海市青浦區(qū)疾病預(yù)防控制中心，上海 201799；2.上海市疾病預(yù)防控制中心，上海 200336

蠟樣芽孢桿菌為兼性厭氧的革蘭陽性芽孢桿菌，是重要的食源性條件致病菌[1-3]，能引起腹瀉、嘔吐、眼部疾病、敗血癥等疾病，甚至導(dǎo)致患者死亡[4-5]。其常污染米面制品、肉制品、蔬菜等，尤其是富含蛋白質(zhì)、碳水化合物的食物。國家食源性疾病監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，該菌引起的相關(guān)食源性疾病仍存在未被報(bào)告或被誤診的情況(蠟樣芽孢桿菌嘔吐型和腹瀉型的癥狀類似于金黃色葡萄球菌或產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的食物中毒)[6]，導(dǎo)致其相關(guān)食源性疾病事件統(tǒng)計(jì)數(shù)低于實(shí)際事件數(shù)。毒力基因和脈沖場凝膠電泳(PFGE)技術(shù)能在食源性疾病暴發(fā)調(diào)查中對致病菌進(jìn)行分子分型和毒力基因鑒定。

本研究建立上海市青浦區(qū)蠟樣芽孢桿菌毒力基因檢測方法和PFGE分型檢測方法，并對2016-2020年729份樣品進(jìn)行檢測，了解青浦區(qū)蠟樣芽孢桿菌毒力基因和PFGE分型，結(jié)合污染情況對蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評估，減少因蠟樣芽孢桿菌引起的食品安全問題。

1 材料與方法

1.1菌株和樣品來源 對2016-2020年729份樣品(包含熟制米面制品208份、學(xué)生午餐260份、熟肉制品84份、醬料78份、蔬菜99份)進(jìn)行蠟樣芽孢桿菌檢測，分離得到89株蠟樣芽孢桿菌。樣品采樣分別涉及餐飲服務(wù)環(huán)節(jié)(70份)、學(xué)生餐配送公司環(huán)節(jié)(260份)、流通環(huán)節(jié)(399份)3個環(huán)節(jié)。本研究使用蠟樣芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CICC23828作為陽性對照菌株和PFGE實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化的質(zhì)控菌株。

1.2儀器與試劑 主要儀器包括PCR擴(kuò)增儀(ABI,美國)，以及普通電泳儀、PFGE儀、凝膠成像系統(tǒng)等(Bio-Rad，美國)。主要試劑包括甘露醇卵黃多黏菌素(MYP)瓊脂、血平板等(上?？片敿紊锟萍加邢薰荆袊?。PCR反應(yīng)體系2×Taq PCR Master mix(BBI，美國)、PCR引物及DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(50～1 200 kb，上海生工生物，中國)。限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和NotⅠ、蛋白酶K(Takara，日本)、Seakem Gold瓊脂糖(Lonza，瑞士)。

1.3方法

1.3.1檢定 按照國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)(GB4789.14-2014現(xiàn)行有效標(biāo)準(zhǔn))，使用MYP瓊脂分離樣品中的可疑菌落，使用血平板劃線分離單個純菌落，進(jìn)行常規(guī)生化試驗(yàn)和確證試驗(yàn)，同時使用全自動微生物生化系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。對菌株進(jìn)行生化分型試驗(yàn)[過氧化氫酶試驗(yàn)、動力試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、酪蛋白分解試驗(yàn)、溶菌酶耐性試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、葡萄糖利用(厭氧)試驗(yàn)、根狀生長試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)、蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗(yàn)]。

1.3.2毒力基因檢測 普通PCR電泳法檢測蠟樣芽孢桿菌腹瀉毒素毒力基因片段、嘔吐毒素毒力基因片段(溶血性基因hblA、hblC、hblD，非溶血性基因nheA、nheB、nheC，腸毒素基因entFM、bceT，細(xì)胞毒素基因cytK，嘔吐毒素基因ces)[3]。PCR條件：預(yù)變性94 ℃ 4 min，變性94 ℃ 30 s，退火54 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，40個循環(huán)；最后延伸72 ℃ 10 min[7]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳：產(chǎn)物5 μL，120 V電泳30 min。同時設(shè)蠟樣芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CICC23828作為陽性對照菌株。所用引物序列及PCR產(chǎn)物大小[1，8-9]見表1。

表1 蠟樣芽孢桿菌毒力基因引物序列和產(chǎn)物大小

1.3.3PFGE分型試驗(yàn) 參考黃銘珊[1]及張慧娟等[10]的研究，PFGE方案如下：(1)小膠塊。取新鮮菌落用TE制備5.0麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙骸Ｈ?00 μL菌懸液加入8 μL溶菌酶(100 μg/μL，下文水平相同)，37 ℃水浴20 min。加入20 μL蛋白酶K(20 μg/μL)和400 μL 1% Seakem Gold瓊脂糖(TE和SeaKem Gold agarose制備，54 ℃水浴30 min以上)輕柔混勻后，加入模具，4 ℃凝固5 min。(2)裂解細(xì)胞。使用TE和溶菌酶處理小膠塊(每管5 mL TE和25 μL 溶菌酶，37 ℃水浴，170 r/min振蕩搖晃4～6 h)。(3)消化蛋白。取出充分裂解的小膠塊，使用細(xì)胞裂解液CLB和蛋白酶K處理小膠塊(每管5 mL CLB和25 μL蛋白酶K，54 ℃水浴,170 r/min振蕩搖晃18 h)。(4)洗膠塊。使用純水和TE分別54 ℃水浴后170 r/min振蕩搖晃洗滌15 min(先純水洗2次，后TE洗4次)。(5)酶切。選擇NotⅠ酶切實(shí)驗(yàn)菌株小膠條，20 U NotⅠ在37 ℃酶切4 h。沙門菌H9812小膠塊用50 U XbaⅠ在37 ℃酶切2 h。(6)電泳。0.5×TBE電泳液2 000 mL，初始轉(zhuǎn)換時間5 s，最終轉(zhuǎn)換時間80 s，電壓為6.0 V/cm，脈沖夾角為120°，電泳時間為18 h。(7)圖像獲取。電泳完成后將凝膠用GelRed溶液染色30 min，純水脫色20 min，使用Bio-Rad成像系統(tǒng)成像。圖譜使用BioNumerics5.10軟件處理。聚類圖結(jié)果根據(jù)非加權(quán)配對算術(shù)平均法(UPGMA)構(gòu)建，條帶的位置差異容許度設(shè)置為1.0%，電泳條帶相似性系數(shù)以Dice系數(shù)表示。

2 結(jié) 果

2.1蠟樣芽孢桿菌的來源分析 89株蠟樣芽孢桿菌檢出情況：熟制米面制品中檢出35株，學(xué)生午餐中檢出29株，熟肉制品中檢出13株，醬料中檢出5株，蔬菜中檢出7株，檢出率分別為16.83%(35/208)、11.15%(29/260)、15.48%(13/84)、6.41%(5/78)、7.07%(7/99)。各類型食品檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.13，P=0.038)。樣品采樣涉及餐飲服務(wù)環(huán)節(jié)、學(xué)生餐配送公司環(huán)節(jié)、流通環(huán)節(jié)，各環(huán)節(jié)檢出率分別為35.71%(25/70)、11.15%(29/260)、8.77%(35/399)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=40.75，P<0.01)。

2.2蠟樣芽孢桿菌的鑒定結(jié)果 89株菌株確證試驗(yàn)均符合蠟樣芽孢桿菌生化特征，定量結(jié)果均小于105CFU/g，后續(xù)進(jìn)行生化分型試驗(yàn)(以2型為主)，結(jié)果見表2。確證試驗(yàn)和生化分型試驗(yàn)全部完成所需時長為6 d。

表2 89株蠟樣芽孢桿菌的生化分型結(jié)果(n)

2.3蠟樣芽孢桿菌的毒力基因檢測結(jié)果 89株蠟樣芽孢桿菌中，hblA、hblC、hblD基因都攜帶的蠟樣芽孢桿菌有38株(42.70%)，均不攜帶27株(30.34%)，剩余24株菌株(26.96%)均攜帶hblA、hblC、hblD中的1～2種，攜帶hblC基因的菌株最多(60.67%)。nheA、nheB、nheC基因都攜帶的菌株有50株(56.18%)，39株均攜帶nheA、nheB、nheC基因中至少一種(43.82%)，攜帶nheB基因的菌株最多(88.76%)。entFM、bceT、cytK、ces這4種基因攜帶情況分別為71.91%、38.20%、41.57%、15.73%。各類型毒力基因(hblA、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC、entFM、bceT、cytK、ces)攜帶情況不同。有9株菌株為腹瀉強(qiáng)毒株(僅不攜帶ces基因)，15株同時攜帶腸毒素基因entFM、bceT和細(xì)胞毒素基因cytK，有14株攜帶嘔吐毒素基因ces，該38株菌株均來自熟制米面制品、學(xué)生午餐、熟肉制品。

2.4蠟樣芽孢桿菌的PFGE分型結(jié)果 對89株蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行PFGE和聚類分析，可分為85個帶型，見圖1。NotⅠ酶切可得5～12條DNA片段。編號為QPBC16005和QPBC16006的菌株、QPBC17028和QPBC17029的菌株,圖譜相似度為100%，QPBC18002、QPBC18003和QPBC18004 3株菌株圖譜相似度為100%，為3種帶型，且均分別源自同時間同一采樣地點(diǎn)的不同樣本，其余82株帶型之間均存在不同程度差異。

注：A為QPBC17028和QPBC17029的PFGE圖譜；B為QPBC16005和QPBC16006的PFGE圖譜；C為QPBC18002、QPBC18003和QPBC18004的PFGE圖譜。

3 討 論

本研究對上海市青浦區(qū)2016-2020年5類729份食品進(jìn)行檢測，共檢出蠟樣芽孢桿菌89株，檢出率為12.21%，且菌含量低于國家致病菌限量(105CFU/g),低于我國39個城市的蠟樣芽孢桿菌的總檢出率(35.00%[11])，以及吉林市的32.90%[12]、寶雞市的17.65%[13]，提示本地區(qū)蠟樣芽孢桿菌污染具有地區(qū)和食品種類特色。受污染樣品來源以餐飲服務(wù)環(huán)節(jié)為主，提示應(yīng)加強(qiáng)餐飲服務(wù)環(huán)節(jié)的菌株污染監(jiān)測。本地區(qū)食品檢出蠟樣芽孢桿菌以熟制米面制品、學(xué)生午餐、熟肉制品為主，與王煒等[14]、HUSSEIN等[15]研究蠟樣芽孢桿菌主要污染對象的結(jié)論一致，這些食品類別作為即食性食品引起食源性疾病風(fēng)險(xiǎn)較高，提示青浦區(qū)需要關(guān)注即食性食品在餐飲服務(wù)環(huán)節(jié)被污染。

本研究確證試驗(yàn)和生化分型試驗(yàn)結(jié)果證明，青浦區(qū)流行生化株為蠟樣芽孢桿菌2型，提示應(yīng)對該流行生化分型多加關(guān)注。本研究發(fā)現(xiàn)生化分型數(shù)據(jù)有助于菌株來源分析，但操作復(fù)雜、試劑繁多、所需時間長，且存在不能分型的菌株，后續(xù)通過毒力基因PCR(小于24 h)和PFGE(小于60 h)對此加以補(bǔ)充，探討快速確定菌株型別、加快事件分析速度的試驗(yàn)選擇，提升檢測效率。

本地區(qū)毒力基因攜帶情況呈多樣化：89株蠟樣芽孢桿菌中nheA、nheB、nheC任意一種基因攜帶率高達(dá)100.00%，與KONG等[16]、YU等[17]研究中nhe基因的攜帶情況高度一致；腹瀉相關(guān)基因hblA、hblC、hblD 3種基因均攜帶率和nheA、nheB、nheC 3種基因均攜帶率分別為42.70%、56.18%，其產(chǎn)生的溶血素和非溶血素會導(dǎo)致強(qiáng)烈腹瀉；張紅芝等[4]的研究提示攜帶ces嘔吐毒素基因簇的菌株是引起嘔吐型食源性疾病的潛在因子，而本研究中蠟樣芽孢桿菌攜帶嘔吐毒素基因ces高達(dá)14株且均污染即食性食品(熟制米面制品、學(xué)生午餐、熟肉制品)，增加了發(fā)生食源性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。以上提示本區(qū)域應(yīng)加強(qiáng)食品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測和食品安全管理，并應(yīng)對區(qū)域內(nèi)腹瀉和嘔吐事件多加關(guān)注。

PFGE結(jié)果顯示，青浦區(qū)蠟樣芽孢桿菌分子分型呈現(xiàn)多態(tài)性。同時，蠟樣芽孢桿菌菌株編號為QPBC16005和QPBC16006兩株、QPBC17028和QPBC17029兩株、QPBC18002、QPBC18003和QPBC18004 3株的PFGE圖譜相似度為100%，分別為3種帶型，均分別源自同時間同一采樣地點(diǎn)不同樣本，均污染即食性食品，是食品操作環(huán)節(jié)不當(dāng)導(dǎo)致的交叉污染(受到相同菌株污染)，提示PFGE分型可以實(shí)現(xiàn)食品污染的有效溯源，且本區(qū)域需提高食品操作環(huán)節(jié)衛(wèi)生要求。剩余82株蠟樣芽孢桿菌的條帶類型分布表明菌株之間無明顯聚集性，說明青浦區(qū)蠟樣芽孢桿菌在遺傳特征上目前仍呈高度多樣性。

綜上所述，本研究分析了蠟樣芽孢桿菌在青浦區(qū)的污染情況、生化分型、嘔吐和腹瀉相關(guān)的毒力基因攜帶情況、PFGE分型結(jié)果，分析污染食品的潛在風(fēng)險(xiǎn)，探討快速確定菌株型別檢測方法的選擇，為評估青浦區(qū)食品中蠟樣芽孢桿菌污染危害提供重要數(shù)據(jù)支持。