腸神經(jīng)膠質(zhì)細胞在帕金森病中的作用研究進展

趙孟琪 綜述，董 莉 審校

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010050

帕金森病(PD)是一種黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元退行性變性、死亡，以殘存神經(jīng)元細胞質(zhì)內(nèi)α-突觸核蛋白(α-syn)聚集形成路易小體為主要病理改變的運動障礙性疾病[1]。目前PD尚無有效的治療方法，隨著其發(fā)病率的逐年上升，社會負擔也逐漸加重，成為當今社會面臨的重大挑戰(zhàn)之一。造成這種局面的原因是PD病因及發(fā)病機制不明。雖然研究表明PD特征性α-syn病理沉積物首先出現(xiàn)在腸神經(jīng)系統(tǒng)(ENS)[2]，與腸道微生物群引起的腸道局部炎癥有關(guān)，但其中具體的細胞及分子機制尚不清楚。腸神經(jīng)膠質(zhì)細胞(EGC)作為ENS數(shù)量最多的細胞，與腸道微生物群聯(lián)系緊密。研究發(fā)現(xiàn)，魚藤酮誘導的PD小鼠模型中存在腸道微生物群失調(diào)、腸道局部免疫性炎癥、EGC病理性激活[3]。此外，來自PD患者的結(jié)腸活檢標本顯示,存在以膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達上調(diào)但磷酸化降低為特征的EGC[4]。這表明EGC病理性激活及其誘導的腸道局部免疫性炎癥在PD中發(fā)揮著重要的作用。因此，本文對EGC的概述、EGC在PD患者腸道免疫性炎癥中的作用及EGC對PD診斷和治療的啟示進行闡述。

1 EGC概述

1.1EGC的起源及異質(zhì)性 EGC起源于神經(jīng)嵴衍生細胞，在小鼠胚胎第9.0天至第13.5天，迷走神經(jīng)嵴及骶嵴衍生細胞遷移、定植于發(fā)育中的腸道后分化為EGC及腸神經(jīng)元，共同構(gòu)成ENS；而人類EGC在胚胎 8～11周時逐漸從腸壁肌間神經(jīng)叢、黏膜下神經(jīng)叢遷移至腸黏膜中，最后分布于所有類型神經(jīng)元周圍[5-6]。根據(jù)EGC在消化道中的位置和形態(tài)，可分為4種主要類型：Ⅰ型“原生質(zhì)”EGC(位于神經(jīng)節(jié)中)、Ⅱ型“纖維狀”EGC(位于神經(jīng)節(jié)結(jié)締組織)、Ⅲ型“黏膜”EGC(位于黏膜下)、Ⅳ型“肌內(nèi)”EGC(位于肌間)[7]?；贓GC在位置和形態(tài)上存在差異，BOESMANS等[8]研究發(fā)現(xiàn)大部分Ⅰ型EGC共同表達GFAP、S100鈣結(jié)合蛋白B(S100B)和轉(zhuǎn)錄因子(Sox10)，Ⅱ型和Ⅲ型EGC只有少數(shù)會表達GFAP，而Ⅳ型EGC幾乎不表達GFAP，表明其在表型上可能也存在不同。與此同時，BOESMANS等[8]進一步通過檢測單個EGC在三磷酸腺苷(ATP)刺激下細胞內(nèi)Ca2+濃度的變化作為EGC激活的替代標記探討各種類型EGC的功能，結(jié)果顯示，與Ⅱ型和Ⅲ型相比，Ⅰ型EGC具有更高的鈣反應率，表明不同形態(tài)和定位的膠質(zhì)亞群也表現(xiàn)出不同的活性。由此可以推測，EGC具有位置、形態(tài)、表型、功能上的異質(zhì)性，這種異質(zhì)性可能促使其在腸道中發(fā)揮多種功能。

1.2EGC的生理功能 EGC被認為是一種細胞網(wǎng)絡(luò)，不僅為腸神經(jīng)元提供結(jié)構(gòu)支持和營養(yǎng)支持，還與腸道微生物群、腸上皮細胞、腸內(nèi)分泌細胞、腸道免疫細胞相互作用，在ENS內(nèi)建立穩(wěn)態(tài)環(huán)境。其生理功能有：(1)EGC可表達多種模式識別受體(PRR)，例如Toll樣受體(TLR)、炎癥小體、晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)等。TLR通過富含亮氨酸的細胞外結(jié)構(gòu)域識別病原體相關(guān)分子模式(PAMP)和損傷相關(guān)分子模式并形成受體復合物，引起Toll/白細胞介素(IL)-1受體結(jié)構(gòu)域響應并募集下游銜接分子，促進細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導并激活核因子-κB/p38蛋白激酶(NF-κB/p38MAPK)、Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子等，導致炎癥因子的表達、釋放增加，EGC可表達TLR3、TLR4、TLR7[9]；核苷酸結(jié)合域樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，NLRP3可以識別不同的刺激而被激活，隨之吸引凋亡相關(guān)微粒蛋白和富含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶(caspase-1)組裝成炎性體，觸發(fā)caspase-1激活和caspase-1介導的IL-18和IL-1β的釋放，從而引發(fā)細胞凋亡[10]；RAGE是一種新的PRR，其可以結(jié)合胞外蛋白，例如S100B，引起細胞內(nèi)促炎信號通路激活，最終導致促炎性細胞因子表達增加[11]。(2)生理情況下，EGC還表達釋放GFAP、S100B、Sox8/9/10、蛋白脂蛋白1、43半通道蛋白(Cx43)等多種標志性蛋白及膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、亞硝基谷胱甘肽等膠質(zhì)衍生物質(zhì)[6]，參與腸道多種病理生理過程。

2 EGC在PD腸道免疫性炎癥中的作用

2.1EGC響應微生物的侵襲而在PD中發(fā)揮作用 自從BRAAK等[12]發(fā)現(xiàn)PD的特征性α-syn病理沉積物分布在PD患者疾病進展各個階段的黏膜下和肌間神經(jīng)節(jié)之后，提出了一種假說：胃腸道的假定致病性損傷可能導致腸神經(jīng)元內(nèi)α-syn錯誤折疊，然后通過迷走神經(jīng)傳輸?shù)街袠猩窠?jīng)系統(tǒng)(CNS)。雖然多項嚙齒類動物研究通過將α-syn注入腸壁，發(fā)現(xiàn)α-syn可從胃腸道傳輸?shù)酱竽X[13]，但卻無法得出具體的致病因素。這種致病因素最有可能是腸道微生物，PD動物模型及臨床試驗也都發(fā)現(xiàn)腸道微生物的變化。而腸道微生物通過何種機制在PD的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用仍處于正在探索的階段。EGC特別是黏膜EGC因其位置特殊，可與腸道微生物群密切接觸，并對微生物的侵襲作出反應。現(xiàn)發(fā)現(xiàn)，EGC在面對微生物的侵襲時表現(xiàn)為促炎及抗炎的兩面性：其不僅可以響應病原微生物的侵襲而發(fā)生病理性激活，誘導腸道針對病原微生物的免疫炎性反應，目的是清除微生物；還可以通過釋放膠質(zhì)衍生物而抑制腸道免疫性炎癥，保護腸道屏障(IEB)，這可能是其在PD中發(fā)揮作用的基礎(chǔ)，具體機制如下。

2.1.1EGC促進腸道免疫性炎癥 (1)EGC可通過PRR識別PAMP而觸發(fā)細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)細菌脂多糖(LPS)、IL-6可通過與EGC細胞膜上PRR的結(jié)合，激活EGC，觸發(fā)TLR4/NF-κB等促炎信號通路及NLRP3炎性體的形成，促進腸道免疫性炎癥以清除病原體[9,14]。有研究表明，PD患者體內(nèi)產(chǎn)生LPS的革蘭陰性菌增多，并且可以誘導腸道炎癥，其是TLR4的一種主要配體[15]。最近，CHOI等[16]通過向小鼠直腸內(nèi)注射奇異變形桿菌衍生的LPS，發(fā)現(xiàn)其可增加腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平，并在治療16 d后導致結(jié)腸中TLR4過度表達。這些效應擴展到大腦可引起黑質(zhì)紋狀體區(qū)域的小膠質(zhì)細胞激活及中樞和腸道神經(jīng)元中的α-Syn聚集。因此，過度的TLR4信號傳導可能導致PD中腸道免疫性炎癥而促進PD相關(guān)病理成分形成及疾病進展。緊接著GORECKI等[17]通過飲用水對小鼠模型長期、低劑量施用LPS，發(fā)現(xiàn)這會加劇α-syn過表達小鼠的PD病理學表現(xiàn)，進一步支持TLR4介導的腸道炎癥在疾病進展中的作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在PD小鼠模型中存在EGC病理性激活，并且TLR4表達增加和腸道炎癥并存[18]，提示EGC上的TLR4信號通路可能積極參與PD的腸道炎癥。(2)EGC可響應微生物的侵襲而表達和分泌促炎介質(zhì)。研究者從暴露于細菌LPS的人腸肌間叢EGC的原代培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，在LPS的刺激下，EGC上調(diào)了多種促炎介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄物，例如促炎性細胞因子(IL-6、IL-8、IL-33、TNF-α)、趨化因子(CCL2、CCL3、CCL12)、S100B[19]。促炎性細胞因子和趨化因子具有特殊的作用，因為它們可以進一步募集中性粒細胞、巨噬細胞及肥大細胞直接促進針對病原體的免疫性炎癥。而S100B可通過多種方式促進腸道免疫炎癥。有研究表明，腸道感染期間EGC釋放S100B增加，S100B不僅可以與EGC表面的TLR4受體結(jié)合，通過激活下游NF-κB通路，促進黏膜一氧化氮(NO)的產(chǎn)生和釋放[20]；還可以通過自分泌的方式與EGC表面的RAGE受體結(jié)合，引起細胞內(nèi)信號通路S100B/RAGE/PI3K/NF-κB激活，進一步促進促炎性細胞因子(TNF-α、IL-6)、趨化因子表達、釋放增加及保護性因子IL-22表達、釋放減少[11]，最終促進腸道免疫性炎癥。對于EGC病理性激活后釋放的炎癥介質(zhì)在PD中均發(fā)現(xiàn)表達升高，雖然細胞因子并非EGC特異性的，但不可否認其可能參與PD的腸道免疫性炎癥。有研究發(fā)現(xiàn)，PD患者的血腦屏障(BBB)受損，外周細胞因子可以通過受損的BBB而進入CNS[21]，提示上述細胞因子可能通過受損的BBB進入腦內(nèi)而參與PD的發(fā)生、發(fā)展，這還需要進一步研究證實。S100B是一種鈣結(jié)合蛋白，在大腦中主要由星形膠質(zhì)細胞表達、釋放，有研究表明，S100B可以與小膠質(zhì)細胞上的RAGE受體結(jié)合，引起小膠質(zhì)細胞活化和遷移，隨后小膠質(zhì)細胞進一步釋放釋放CCL3、CCL5和CXCL12等趨化因子促進腦內(nèi)神經(jīng)炎癥[22]。在PD動物模型中，S100B已被證明對神經(jīng)退行性變有顯著貢獻，特別是1-甲基-4苯基-1，2，3，6四氫吡啶(MPTP)誘導的PD小鼠模型中的多巴胺能神經(jīng)元變性在S100B靶向消除后被部分抑制[23]。目前研究主要集中在星形膠質(zhì)細胞釋放的S100B在PD中的作用，鑒于越來越多的證據(jù)表明EGC在PD發(fā)病機制中起著至關(guān)重要的作用，對于EGC釋放的S100B在PD中的作用有待進一步研究。(3)EGC可對細菌成分進行抗原提呈。EGC在接觸細菌或寄生蟲后，可表達主要組織相容性復合體-Ⅱ類分子而充當抗原提呈細胞，將LPS等呈遞給CD4+T細胞，從而誘導CD4+T細胞活化并分化為輔助性T細胞(Th)17和調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)[24]，引發(fā)針對病原體的免疫反應，并且最終引起促炎性細胞因子釋放而促進腸道免疫性炎癥。Th17是腸道黏膜免疫的主要適應性免疫細胞，而Treg是一種免疫抑制細胞，可抑制Th17功能，二者之間處于動態(tài)平衡，從而保證機體的免疫耐受[25]。大量研究表明，PD患者外周血存在Th17/Treg平衡失調(diào)，并且Th17和Treg均有機會進入CNS，PD尸檢及動物模型研究也發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)Th17水平增加而Treg水平減少[25-26]。相關(guān)研究還發(fā)現(xiàn)Th17及其特征性IL-17對多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)毒性作用，而Treg發(fā)揮神經(jīng)保護作用[26]。因此，EGC與適應性免疫細胞之間的作用可能是其參與PD的一種機制。

2.1.2EGC抑制腸道免疫性炎癥 除了促炎作用外，EGC還具有免疫抑制和抗炎作用。這些抗炎作用部分是通過釋放膠質(zhì)衍生物質(zhì)來控制的。具體包括GDNF、BDNF等，這些膠質(zhì)衍生物質(zhì)可作用于自身及周圍的免疫細胞而有益于減弱腸上皮通透性、抗炎作用和促進神經(jīng)元存活。GDNF是腸道感染期間最有代表性的保護性因子，其可以通過與其他細胞上的酪氨酸激酶受體(RET)結(jié)合而減少促炎性細胞因子的產(chǎn)生并有助于維持腸上皮屏障功能。研究表明，GDNF釋放后可與3型淋巴細胞(ILC3)上的RET結(jié)合，從而激活I(lǐng)LC3并促進抗炎因子IL-22的釋放和腸道上皮細胞中修復基因的表達增加，保護結(jié)腸炎癥上皮[27]；釋放的BDNF則通過下調(diào)EGC上的TLR4受體而降低LPS誘導的小鼠一氧化氮合酶及促癥因子IL-6的表達[28]，減輕腸道炎癥?，F(xiàn)有證據(jù)表明，GDNF不僅能通過抑制腸道炎癥而改善結(jié)腸炎上皮細胞功能，還能通過改善腸上皮細胞中的緊密連接而改善IEB功能及減輕由橋粒芯糖蛋白2損失引起的IEB功能損害[29-30]。CHEN等[31]的研究發(fā)現(xiàn)，便秘的PD患者血清GDNF水平較低，提出假設(shè)：低GDNF水平更容易導致腸黏膜屏障功能受損，腸道通透性改變，ENS更容易受到腸道菌群的影響，從而導致PD患者的便秘癥狀。由此，EGC源性GDNF可能在PD中發(fā)揮保護作用。綜上所述，EGC既可以響應微生物的侵襲而被激活并釋放促炎介質(zhì)擴大腸道免疫性炎癥，同時釋放的促炎介質(zhì)又可以進一步作用于EGC，形成類似于正反饋的閉環(huán)系統(tǒng)，級聯(lián)放大腸道免疫性炎癥；相反，其釋放保護性因子可以減輕腸道炎癥而保護IEB功能，從而對抗微生物的侵襲。因此，EGC具有兩面性效應，這可能源于其是一種異質(zhì)性細胞群體。對于EGC病理性激活后啟動的促炎信號通路及其釋放的炎癥介質(zhì)均可能在PD的進展中發(fā)揮某些促進或者保護作用，除此之外其與適應性免疫細胞之間的相互作用可能促進CD4+T細胞向腦內(nèi)聚集并與腦內(nèi)先天性免疫細胞相互作用而促進PD的發(fā)生、發(fā)展。然而，對于EGC在PD中的確切作用還需要更多的臨床前及基礎(chǔ)實驗來進一步探討。

2.2EGC與PD中的α-syn聚集 研究表明，PD中存在EGC的病理性激活[32]。DEVOS等[33]通過在結(jié)腸活檢中使用聚合酶鏈反應，發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比，PD結(jié)腸活檢中編碼4種促炎性細胞因子和3種神經(jīng)膠質(zhì)標志物的mRNA轉(zhuǎn)錄物增加，表明PD中存在腸道炎癥，并可能與EGC的病理性激活密切相關(guān)；除此之外，PEREZ-PARDO等[18]的小鼠實驗發(fā)現(xiàn)，口服魚藤酮的小鼠結(jié)腸黏膜呈現(xiàn)促炎狀態(tài)，存在結(jié)腸肌間神經(jīng)叢EGC病理性激活、結(jié)腸α-syn聚集和多巴胺能神經(jīng)元丟失，而免受魚藤酮誘導的小鼠則表現(xiàn)為更少的肌間神經(jīng)叢EGC激活、結(jié)腸α-syn聚集和多巴胺能細胞丟失，PEREZ-PARDO等[32]的最新研究通過對死亡小鼠結(jié)腸的固定切片進行免疫熒光染色，也發(fā)現(xiàn)EGC源性GFAP與α-syn的表達同步升高，推測EGC可能在腸道α-syn病理形成中也發(fā)揮著作用；除此之外，有研究表明，α-syn可通過腸神經(jīng)膠質(zhì)Cx43半通道(通過Cx43半通道連接的神經(jīng)膠質(zhì)-神經(jīng)膠質(zhì)合胞體是胃腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間細胞間通信的途徑)或迷走神經(jīng)上升到中樞神經(jīng)系統(tǒng)[34]，進一步發(fā)現(xiàn)EGC在α-syn上升到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的過程中也發(fā)揮作用。目前在CNS中發(fā)現(xiàn)細胞外α-syn可以刺激小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生促炎分子和氧化應激效應物質(zhì)，神經(jīng)炎癥和氧化應激可以促進并加劇神經(jīng)退行性過程[35]，提示作為星形膠質(zhì)細胞消化系統(tǒng)等效物的EGC也可能受到ENS中α-syn的刺激而激活從而加劇PD中腸道炎癥。綜上所述，PD中的EGC可能發(fā)生病理性激活，可能通過參與腸道免疫性炎癥而促進ENS中α-syn錯誤折疊，并且有助于α-syn向大腦傳播，反過來α-syn也可能作為一種效應分子進一步促進EGC病理性激活，未來應具體探索它們之間的復雜串擾。

3 EGC對PD診斷和治療的啟示

3.1EGC對于PD診斷的啟示 PD患者結(jié)腸組織中發(fā)現(xiàn)EGC反應性增生及其特異性的膠質(zhì)標志物陽性，并且在PD早期就出現(xiàn)，因此通過胃腸黏膜活檢獲取EGC并進行分析可能優(yōu)于α-syn對早期PD進行預測。傳統(tǒng)的對于細胞類型的分析主要通過分選技術(shù)，如熒光活化細胞分選(FACS)，用于從特定細胞類型生成數(shù)據(jù)并更深入地了解這些細胞，然而這種方法需要大量的細胞制備或熒光報告信號，試驗過程復雜，任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都會影響試驗結(jié)果的準確性，從而使FACS復雜化，并且它對于組織中的EGC并不是很適用[36]。另一種可行的方法是通過單細胞RNA測序分析細胞特異性轉(zhuǎn)錄組，它能夠提示單個細胞的基因結(jié)構(gòu)和基因表達狀態(tài)，反映細胞間的異質(zhì)性，目前已經(jīng)應用于腫瘤學、神經(jīng)科學等多個領(lǐng)域。近期SMAJI等[37]通過對6例特發(fā)性PD患者和5例年齡性別匹配的健康人死后中腦的41 000個單核轉(zhuǎn)錄組進行分析，可以區(qū)分出少突膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞等多種細胞類型，并且發(fā)現(xiàn)這些細胞在PD中都存在明顯的基因表達差異，最后得出小膠質(zhì)細胞是與特發(fā)性PD風險基因相關(guān)的細胞類型。DROKHLYANSKY等[38]將單細胞測序用于人和小鼠ENS分析，發(fā)現(xiàn)肌間和黏膜EGC的表達基因存在明顯不同，并且發(fā)現(xiàn)多個PD風險基因在ENS中富集，其中NRXN1、ANK2富集在EGC中，表明EGC的功能障礙可能會加劇CNS的疾病。以上結(jié)果說明了單細胞測序技術(shù)可達到對細胞類型的精準分析。EGC是一種異質(zhì)性細胞群體，未來應利用單細胞測序技術(shù)的優(yōu)勢深入探索EGC的異質(zhì)性在PD及其他胃腸道疾病中的作用。

3.2EGC對于PD治療的啟示 對于EGC相關(guān)信號通路、標志性蛋白的研究，可以發(fā)現(xiàn)潛在的治療靶點，并可設(shè)計治療策略來防止多巴胺能神經(jīng)元進行性退化。主要作用靶點有：(1)靶向TLR4信號通路。減輕TLR信號傳導可促進免疫平衡，迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了6種水平的負調(diào)控[39]。①TLR蛋白的降解；②TLR及相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄機制的下調(diào)；③微小RNA的轉(zhuǎn)錄后抑制；④釋放作為可溶性誘餌的可溶性TLR；⑤細胞內(nèi)抑制劑；⑥TLR與其配體結(jié)合后，TLR信號通路的膜結(jié)合阻滯劑。研究發(fā)現(xiàn)，敲除EGC上TLR4基因的小鼠可免受魚藤酮誘導引起腸道炎癥，這種小鼠表現(xiàn)為PD癥狀減輕[18]。(2)靶向S100B/RAGE/NF-κB信號通路。研究發(fā)現(xiàn)，噴他脒阻斷S100B/RAGE/NF-κB通路可防止EGC激活、腸道炎癥、神經(jīng)元丟失[11]。(3)靶向GDNF。研究發(fā)現(xiàn)，5羥色胺受體激動劑可增加EGC源性GDNF，減輕腸道炎癥并保護ENS中的神經(jīng)元損傷[40]。雖然上述靶向治療減弱了EGC激活、改善了腸道炎癥，但EGC是一種功能異質(zhì)性細胞，在PD中還未進行針對異質(zhì)性EGC的精準治療，未來可探索靶向異質(zhì)性EGC實現(xiàn)疾病精準治療的技術(shù)和方法。

4 展 望

隨著PD腸道發(fā)病機制探索的不斷深入，EGC在PD發(fā)生、發(fā)展中的作用日益顯現(xiàn)，本文綜述了EGC對微生物的侵襲作出反應的某些機制，希望可以對PD早期診斷及干預提供新的思路。EGC是一種異質(zhì)性細胞群體，未來應利用單細胞測序技術(shù)的優(yōu)勢深入探索EGC的異質(zhì)性在PD及其他胃腸道疾病中的作用，并進一步研發(fā)靶向異質(zhì)性EGC實現(xiàn)疾病精準治療的技術(shù)和方法。