基于Toll樣受體4/核因子κB信號通路探究苦參堿對類風濕關節(jié)炎風濕熱痹證的治療作用及機制

周婷婷，楊文廣，胡艷婷，馬俊福

(1.商丘市中醫(yī)院，河南 商丘 476000；2.河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450002)

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以滑膜炎為主要病理表現(xiàn)的慢性系統(tǒng)性疾病，特征為手、足關節(jié)的對稱性、侵襲性關節(jié)炎癥，最終可導致關節(jié)畸形及功能喪失[1]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)/核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路被認為與RA有關[2]，調控該信號通路可作為RA的潛在治療方向。RA屬中醫(yī)學痹證范圍，風濕熱痹證是其常見證候類型?？鄥A是從豆科植物苦參中提取的一種生物堿，具有抗病毒、抗炎和調節(jié)免疫等作用[3-4]。本研究擬通過建立RA風濕熱痹證大鼠模型，研究苦參堿對RA風濕熱痹證的治療作用及作用機制，為臨床治療RA風濕熱痹證提供參考。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物8周齡SPF級雄性SD大鼠60只，體質量180～200 g，購自北京科宇動物養(yǎng)殖中心，實驗動物合格證號為SCXK(京)-2018-0010。適應性喂養(yǎng)7 d后開始實驗。實驗方案通過醫(yī)院醫(yī)學動物實驗倫理委員會審查通過。

1.2 主要試劑牛Ⅱ型膠原(北京博蕾德生物科技有限公司)，弗氏完全佐劑(美國Sigma公司)，甲氨蝶呤(上海上藥信誼藥廠有限公司，每片2.5 mg)，苦參堿(純度≥98%，美國Sigma公司)，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA試劑盒、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)ELISA試劑盒(上海斯信生物科技有限公司)，HE染色液(北京索萊寶生物科技有限公司)，RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)，山羊抗兔二抗IgG(上海碧云天生物技術有限公司)，兔抗大鼠NF-κB p65抗體、兔抗大鼠磷酸化核因子κB p65(phosphorylated nuclear factor-κB p65，p-NF-κB p65)抗體、兔抗大鼠TLR4抗體、兔抗大鼠Cleaved Caspase-3抗體、兔抗大鼠β-actin抗體(美國Cell Signaling Technology公司)。

1.3 主要儀器YLS-7B型足趾容積測量儀(上海欣軟信息科技有限公司)，生物組織自動脫水機、包埋機、石蠟切片機(德國Leica公司)，722型可見分光光度計(上海第三分析儀器廠)，StepOnePlus實時定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)。

2 方 法

2.1 分組及造模將60只大鼠隨機分為6組，每組10只。通過牛Ⅱ型膠原誘導[5]結合人工氣候箱干預進行RA風濕熱痹證造模。將50 mg牛Ⅱ型膠原凍干粉溶于25 mL冰醋酸溶液(0.1 mol·L-1)中，再與25 mL弗氏完全佐劑混合，配制成膠原乳化液。模型組、甲氨蝶呤組及苦參堿低、中、高劑量組大鼠，按照牛Ⅱ型膠原誘導法在背部脊柱兩側和尾根部分別注射膠原乳化液0.1 mL；注射結束后當天開始，將大鼠置于人工氣候箱中進行干預，設置溫度36 ℃、濕度95%、風速5 m·s-1，每天1次，每次1 h，連續(xù)7 d；第8天，在模型組、甲氨蝶呤組及苦參堿低、中、高劑量組大鼠左后肢足趾皮下注射0.1 mL膠原乳化液加強免疫，然后再放入人工氣候箱繼續(xù)干預(人工氣候箱設置條件不變)，每天1次，每次1 h，連續(xù)7 d。正常組大鼠僅于相同時間點，在相同部位注射等量生理鹽水，常規(guī)環(huán)境飼養(yǎng)。

2.2 藥物干預自第2次人工氣候箱干預開始后第2天起進行藥物干預。甲氨蝶呤組大鼠按照1.0 mg·kg-1以甲氨蝶呤(蒸餾水配制)灌胃，苦參堿低、中、高劑量組大鼠分別按照30 mg·kg-1、60 mg·kg-1、120 mg·kg-1以苦參堿(蒸餾水配制)灌胃，正常組和模型組大鼠則以等體積蒸餾水灌胃。藥物干預均每周1次，共干預4次。

2.3 實驗指標檢測

2.3.1大鼠一般情況觀察 實驗期間，觀察大鼠與RA風濕熱痹證相關表現(xiàn)的變化情況，如毛發(fā)光澤、飲食、行為活動、足趾腫脹等情況。

2.3.2足趾腫脹度測定 分別于造模前和藥物干預結束后測定并計算大鼠的足趾腫脹度，具體方法如下：將大鼠左后足放入足趾容積測量儀，靜止3 s后讀數(shù)，測量3次取平均值，足趾腫脹度=(藥物干預結束后足趾體積-造模前足趾體積)/造模前足趾體積。

2.3.3關節(jié)炎指數(shù)評定 分別于造模前和藥物干預結束后，采用5級評分法[5]評定大鼠的關節(jié)炎指數(shù)：0分，正常；1分，足趾關節(jié)輕度發(fā)紅或腫脹；2分，足趾關節(jié)以下部位腫脹；3分，踝關節(jié)以下全部腫脹；4分，整個足部腫脹或關節(jié)嚴重變形。以每只大鼠雙后足評分之和作為最終評分。

2.3.4血清TNF-α、IL-1β含量測定 藥物干預結束后當天，以2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，自腹主動脈取血2 mL，在4 ℃以3000 r·min-1離心10 min(離心半徑8 cm)，收集上清液，于-80 ℃條件下保存。以ELISA法檢測血清TNF-α、IL-1β含量：包被抗體的聚苯乙烯酶標板經緩沖液清洗后，加入5%牛血清蛋白進行封閉；設置空白孔、標準孔和待測樣品孔，標準孔加入稀釋后的標準品50 μL、待測樣品孔加入稀釋液40 μL后再加入待測樣品10 μL；除空白孔外，其余孔加辣根過氧化物酶標記的檢測抗體100 μL，37 ℃ 孵育1 h；洗滌，加顯色劑A和B各50 μL，37 ℃ 孵育20 min后加終止液 50 μL，終止反應；在450 nm檢測吸光度值，根據標準品濃度和吸光度值繪制標準曲線，計算各組大鼠血清TNF-α、IL-1β含量。

2.3.5膝關節(jié)滑膜組織病理學觀察 腹主動脈取血后，脫頸處死大鼠，仰臥位固定，乙醇消毒后沿膝關節(jié)正中切開皮膚，暴露長3 cm、寬3 cm的區(qū)域，自髕骨上緣向下切開至股骨，再沿髕骨兩側向下分離至脛骨，剝離滑膜組織，部分在-80 ℃保存、部分置于4%多聚甲醛溶液中固定。將在4%多聚甲醛溶液中固定24 h的滑膜組織取出，經脫水和透明處理后，以石蠟包埋切片，厚度5 μm，HE染色后置于顯微鏡下觀察。

2.3.6膝關節(jié)滑膜組織Bax mRNA、Bcl-2 mRNA、TLR4 mRNA、NF-κB p65 mRNA表達量檢測 取部分于-80 ℃保存的大鼠膝關節(jié)滑膜組織，以實時定量PCR法測定滑膜組織Bax mRNA、Bcl-2 mRNA、TLR4 mRNA、NF-κB p65 mRNA的表達量：以RNA提取試劑盒提取滑膜組織中目標基因的RNA，通過逆轉錄酶逆轉錄得到cDNA，以β-actin作為內參。PCR擴增條件為：預變性溫度94 ℃、時間5 min，變性溫度94 ℃、時間30 s，退火溫度60 ℃、時間30 s，延伸溫度72 ℃、時間1 min，共40個循環(huán)。以2-ΔΔCt法計算目標基因mRNA表達量。引物序列見表1。

表1 實時定量PCR引物序列

2.3.7膝關節(jié)滑膜組織Cleaved caspase-3蛋白、TLR4蛋白、NF-κB p65蛋白、p-NF-κB p65蛋白表達量檢測 取部分于-80 ℃保存的大鼠膝關節(jié)滑膜組織，置于勻漿管中，加入RIPA裂解液裂解 20 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min(離心半徑 8 cm)，取上清液以BCA蛋白濃度測定試劑盒測定目標蛋白濃度。以Western Blot法測定Cleaved caspase-3、TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達量：按20 μg蛋白量上樣，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(80 V恒壓電泳20 min，100 V恒壓電泳90 min)，300 mA 恒流轉膜1 h，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，滴加NF-κB p65(1∶1000)、p-NF-κB p65(1∶1000)、TLR4(1∶1000)、Cleaved caspase-3(1∶1000)、β-actin(1∶3000)一抗，4 ℃孵育過夜。洗膜后滴加IgG二抗(1∶3000)，室溫孵育1 h，洗膜后電化學發(fā)光顯色，Image J軟件測定灰度值，以β-actin為內參計算目標蛋白相對表達量。

2.4 數(shù)據統(tǒng)計采用SPSS23.0軟件對數(shù)據進行統(tǒng)計分析。各組大鼠足趾腫脹度、關節(jié)炎指數(shù)、血清TNF-α含量、血清IL-1β含量及膝關節(jié)滑膜組織Bax mRNA表達量、Bcl-2 mRNA表達量、TLR4 mRNA表達量、NF-κB p65 mRNA表達量、Cleavedcaspase-3蛋白表達量、TLR4蛋白表達量、NF-κB p65與p-NF-κB p65蛋白表達量比值的組間總體比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較均采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

3 結 果

3.1 大鼠一般情況正常組大鼠毛發(fā)順滑有光澤，飲食、飲水正常，足趾無腫脹；造模后模型組、甲氨蝶呤組及苦參堿低、中、高劑量組大鼠均出現(xiàn)毛發(fā)干燥無光澤，攝水量增加，易激惹、攻擊性強，足趾腫脹、紅熱、蜷縮、僵硬等表現(xiàn)；與模型組相比，藥物干預后甲氨蝶呤組及苦參堿低、中、高劑量組大鼠毛發(fā)干燥無光澤、足趾腫脹等情況有所改善。

3.2 足趾腫脹度6組大鼠的足趾腫脹度比較，差異有統(tǒng)計學意義。模型組大鼠的足趾腫脹度高于其余5組(P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000)，苦參堿低劑量組大鼠的足趾腫脹度高于甲氨蝶呤組和苦參堿中、高劑量組(P=0.007；P=0.000；P=0.000)，苦參堿中劑量組大鼠的足趾腫脹度高于甲氨蝶呤組和苦參堿高劑量組(P=0.001；P=0.000)，甲氨蝶呤組和苦參堿高劑量組大鼠足趾腫脹度的差異無統(tǒng)計學意義(P=0.096)。見表2。

3.3 關節(jié)炎指數(shù)正常組大鼠足部未見異常，關節(jié)炎指數(shù)為0分；其余5組大鼠關節(jié)炎指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義。模型組大鼠的關節(jié)炎指數(shù)高于甲氨蝶呤組和苦參堿低、中、高劑量組(P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000)，苦參堿低劑量組大鼠的關節(jié)炎指數(shù)高于甲氨蝶呤組和苦參堿中、高劑量組(P=0.000；P=0.000；P=0.000)，苦參堿中劑量組大鼠的關節(jié)炎指數(shù)高于甲氨蝶呤組和苦參堿高劑量組(P=0.000；P=0.000)，甲氨蝶呤組和苦參堿高劑量組大鼠關節(jié)炎指數(shù)的差異無統(tǒng)計學意義(P=0.054)。見表2。

表2 6組大鼠的足趾腫脹度和關節(jié)炎指數(shù)

3.4 血清TNF-α、IL-1β含量6組大鼠的血清TNF-α、IL-1β含量比較，組間差異均有統(tǒng)計學意義。模型組大鼠的血清TNF-α、IL-1β含量均高于其余5組(P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000)，苦參堿低劑量組大鼠的血清TNF-α、IL-1β含量均高于甲氨蝶呤組和苦參堿中、高劑量組(P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000)，苦參堿中劑量組大鼠的血清TNF-α、IL-1β含量均高于甲氨蝶呤組和苦參堿高劑量組(P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000)，甲氨蝶呤組和苦參堿高劑量組大鼠血清 TNF-α、IL-1β含量的差異均無統(tǒng)計學意義(P=0.054；P=0.067)。見表3。

表3 6組大鼠的血清腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-1β含量

3.5 膝關節(jié)滑膜組織病理學觀察結果HE染色結果顯示，正常組大鼠膝關節(jié)滑膜組織結構完整，細胞排列整齊，無炎癥細胞浸潤；與正常組相比，模型組大鼠滑膜組織增生明顯，有大量炎癥細胞浸潤，滑膜細胞排列紊亂，邊界模糊不清；與模型組相比，甲氨蝶呤組和苦參堿低、中、高劑量組滑膜組織增生程度減輕，滑膜細胞排列較整齊，炎癥細胞浸潤情況均得到不同程度改善(圖1)。

圖1 6組大鼠膝關節(jié)滑膜組織HE染色圖(×200)

3.6 膝關節(jié)滑膜組織Bax mRNA、Bcl-2 mRNA、TLR4 mRNA、NF-κB p65 mRNA表達量6組大鼠膝關節(jié)滑膜組織Bax mRNA、Bcl-2 mRNA、TLR4 mRNA、NF-κB p65 mRNA表達量比較，組間差異均有統(tǒng)計學意義。模型組大鼠的膝關節(jié)滑膜組織Bax mRNA表達量低于其余5組(P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000)，Bcl-2 mRNA、TLR4 mRNA、NF-κB p65 mRNA表達量均高于其余5組(P=0.000，P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.019，P=0.000；P=0.000，P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000，P=0.000)；苦參堿低劑量組大鼠的膝關節(jié)滑膜組織Bax mRNA表達量低于甲氨蝶呤組和苦參堿中、高劑量組(P=0.000；P=0.000；P=0.000)，Bcl-2 mRNA、TLR4 mRNA、NF-κB p65 mRNA表達量均高于甲氨蝶呤組及苦參堿中、高劑量組(P=0.000，P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000，P=0.000)；苦參堿中劑量組大鼠的膝關節(jié)滑膜組織Bax mRNA表達量低于甲氨蝶呤組和苦參堿高劑量組(P=0.000；P=0.000)，Bcl-2 mRNA、TLR4 mRNA、NF-κB p65 mRNA表達量均高于甲氨蝶呤組和苦參堿高劑量組(P=0.000，P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000，P=0.001)；甲氨蝶呤組和苦參堿高劑量組大鼠膝關節(jié)滑膜組織Bax mRNA、Bcl-2 mRNA、TLR4 mRNA、NF-κB p65 mRNA表達量的組間差異均無統(tǒng)計學意義(P=0.755，P=0.074，P=0.096，P=0.096)。見表4。

表4 6組大鼠膝關節(jié)滑膜組織Bax mRNA、Bcl-2 mRNA、TLR4 mRNA、NF-κB p65 mRNA表達量

3.7 膝關節(jié)滑膜組織Cleaved caspase-3蛋白、TLR4蛋白、NF-κB p65蛋白、p-NF-κB p65蛋白表達量6組大鼠的Cleaved caspase-3蛋白、TLR4蛋白表達量及p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達量比值比較，組間差異均有統(tǒng)計學意義。模型組大鼠的Cleaved caspase-3蛋白表達量低于其余5組(P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000)，TLR4蛋白表達量及p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達量比值均高于其余5組(P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000)；苦參堿低劑量組大鼠的Cleaved caspase-3蛋白表達量低于甲氨蝶呤組和苦參堿中、高劑量組(P=0.000；P=0.001；P=0.000)，TLR4蛋白表達量及p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達量比值均高于甲氨蝶呤組和苦參堿中、高劑量組(P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000)；苦參堿中劑量組大鼠的Cleaved caspase-3蛋白表達量低于甲氨蝶呤組和苦參堿高劑量組(P=0.000；P=0.000)，TLR4蛋白表達量及p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達量比值均高于甲氨蝶呤組和苦參堿高劑量組(P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000)；甲氨蝶呤組和苦參堿高劑量組大鼠Cleaved caspase-3蛋白、TLR4蛋白表達量及p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達量比值的組間差異均無統(tǒng)計學意義(P=0.090，P=0.096，P=0.153)。見表5、圖2。

表5 各組大鼠膝關節(jié)滑膜組織Cleaved caspase-3蛋白、TLR4蛋白表達量及NF-κB p65蛋白/p-NF-κB p65蛋白表達量比值

p-NF-κB p65為磷酸化核因子κB p65；NF-κB p65為核因子κB p65；TLR4為Toll樣受體4；A為正常組；B為模型組；C為苦參堿低劑量組；D為苦參堿中劑量組；E為苦參堿高劑量組；F為甲氨蝶呤組。

4 討 論

風濕熱痹證是痹證的常見證候類型，其病邪性質為風、濕、熱三邪[6]?；顒悠赗A的證候以風濕熱痹證為主，患者多見關節(jié)紅腫、灼熱、疼痛、喜冷惡熱[7]。因此，治療應以清熱利濕，疏風止痛為主[8]?？鄥A具有清熱解燥、去濕排毒以及抗炎等功效。研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿能夠減輕RA患者的壓痛感，降低炎癥因子水平[9]。苦參堿具有多種藥理學活性，不僅可抑制宮頸鱗癌細胞增殖、遷移和侵襲，而且可減輕前列腺炎大鼠炎癥反應[10-11]。Niu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿可通過抑制NF-κB信號通路，調控RA中Th1/Th2細胞因子應答。還有研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿可通過抑制磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路，抑制膠原誘導的關節(jié)炎大鼠滑膜血管生成[13]。

本研究采用牛Ⅱ型膠原誘導聯(lián)合人工氣候箱干預，建立RA風濕熱痹證大鼠模型。研究結果顯示，模型組大鼠足趾腫脹度和關節(jié)炎指數(shù)較正常組明顯升高，且滑膜組織增生明顯，有大量炎癥細胞浸潤，滑膜細胞排列紊亂，滑膜邊界彌散不清，提示模型制備成功。經苦參堿干預后，RA大鼠足趾腫脹度和關節(jié)炎指數(shù)明顯降低，滑膜增生和炎癥浸潤情況得到改善，且改善效果存在劑量依賴性，但高劑量苦參堿的治療效果與甲氨蝶呤無差別，提示苦參堿對RA風濕熱痹證具有較好的治療作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清TNF-α和IL-1β含量較正常組升高，干預后RA大鼠血清TNF-α和IL-1β含量降低，提示苦參堿可通過減輕RA大鼠的炎癥反應改善其關節(jié)腫脹。

TLR4/NF-κB是免疫炎癥損傷的重要信號通路，參與RA的發(fā)生發(fā)展[14-15]。NF-κB的激活可誘導TNF-α、IL-1β等炎癥因子的釋放[16-17]。實時定量PCR和Western Blot結果顯示，模型組大鼠膝關節(jié)滑膜組織TLR4 mRNA、NF-κB p65 mRNA、TLR4蛋白表達量均較正常組升高；而與模型組相比，苦參堿各劑量組的上述指標均明顯降低。這表明TLR4/NF-κB信號通路參與了RA的發(fā)生發(fā)展，苦參堿可能通過調控TLR4/NF-κB信號通路緩解RA的癥狀和體征。這與曲道煒等[18]的研究結論一致。p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達量比值反映了NF-κB p65蛋白的活化情況，模型組大鼠滑膜組織中該比值較正常組升高，說明NF-κB p65蛋白異常活化，TLR4/NF-κB信號通路被激活；苦參堿各劑量組該比值較模型組降低，說明苦參堿可抑制TLR4/NF-κB信號通路。TLR4/NF-κB信號通路的活化不僅會加劇炎癥反應，還可促進滑膜細胞大量增殖，造成滑膜成纖維細胞凋亡不足[10,19]。Cleaved caspase-3是Caspase-3的活化形式，可誘導多種蛋白或酶類失活，改變細胞結構，加速細胞凋亡[11]。朱艷媚等[20]認為，可通過促進滑膜細胞凋亡減輕RA大鼠癥狀。本研究中，經苦參堿治療后，RA大鼠滑膜組織Bax mRNA和Cleaved caspase-3蛋白表達水平均明顯升高，Bcl-2 mRNA表達水平明顯降低，提示苦參堿可促進滑膜細胞凋亡。

本研究的結果提示，苦參堿可有效減輕RA風濕熱痹證大鼠的癥狀和體征，且療效存在劑量依賴性；其作用機制可能是通過抑制TLR4/NF-κB信號通路，減輕炎癥反應、促進滑膜細胞凋亡。