崗梅根總皂苷提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究*

蔡杰慧，黃瑞鴻，賴詩婷，莫土香，李致寶，鄭燕菲△

（1.廣西民族師范學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 崇左 532200；2.廣西壯族自治區(qū)崇左市動物疫病預(yù)防控制中心·廣西壯族自治區(qū)崇左市水產(chǎn)畜牧產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心，廣西 崇左 532200）

崗梅根為梅葉冬青Ilex asprella（Hook.etArn）Champ.ex Benth.的根，別名為槽樓星、金包銀、點(diǎn)稱根、白點(diǎn)稱、天星根、上梅根、烏皮柴、七星蔃等，味苦、甘，性涼，有清熱解毒、通龍路功效［1］。作為涼茶的主要原料，廣泛應(yīng)用于單方或復(fù)方等多種中藥制劑的制備［2-3］，主治咽痛、痧病、頭痛、胃痛、眩暈、百日咳、肺痢、跌打損傷等［1-2］。崗梅根藥用成分主要有三萜及其苷類、多糖類、生物堿類和香豆素類成分，具有抗炎［4-5］、鎮(zhèn)痛［6］、鎮(zhèn)咳［7］、抗菌［8-9］、抗病毒［10］、抗腫瘤［11］、免疫調(diào)節(jié)［12］、調(diào)節(jié)心血管［13］、干預(yù)脂肪肝［14-15］等藥理活性。本研究中以廣西貴港野生崗梅根為原料，通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)優(yōu)化崗梅根總皂苷的回流提取工藝，采用以香草醛-高氯酸為顯色劑的比色法［16］，以齊墩果酸為對照品測定崗梅根中總皂苷的含量，以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯對粗提液進(jìn)行萃取純化，與維生素C比較對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）和·OH的清除能力，評價崗梅根總皂苷粗提液和純化液的抗氧化活性?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

SF20B型高速粉碎機(jī)組（長沙步源制藥機(jī)械設(shè)備有限公司）；A360型紫外可見分光光度計(jì)（翱藝儀器上海有限公司）；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）；SY2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；DZF-6050型真空干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；FA2014型電子天平（舜宇恒平儀器廠，精度為0.000 1 g）。

1.2 試藥

崗梅根于2021年7月采摘于廣西貴港市平南縣，經(jīng)廣西民族師范學(xué)院黃秋嬋教授鑒定為正品；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號為C12464953，含量為97%）；DPPH（上海麥克林生化科技有限公司，批號為C11362868，含量為96%）；30%過氧化氫（GA），水楊酸，抗壞血酸（批號為1.14245.010，含量為99.7%），二氯甲烷，無水乙醇，乙酸乙酯，均為分析純，購于成都市科隆化學(xué)品有限公司；石油醚、七水硫酸亞鐵、高氯酸、香蘭素、冰乙酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取純化

崗梅根總皂苷的提取純化路線見圖1。

圖1 崗梅根總皂苷的提取純化路線Fig.1 Extraction and purification routes of total saponins from Ilicis Asprellae Radix

2.2 提取率測定

取齊墩果酸0.010 5 g，精密稱定，加無水乙醇溶解完全，定容至10 mL容量瓶中，得質(zhì)量濃度為1.05 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，置比色管中，水浴加熱至溶劑揮發(fā)完全，依次加入0.2 mL 5%香蘭素-冰乙酸和0.8 mL高氯酸，充分搖勻，密封，75℃水浴15 min，冰浴5 min，加5 mL冰乙酸，于548 nm波長處測定吸光度，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、吸光度為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=0.045 5X+0.112 5（R2=0.999 1，n=8）。

顯色后，同時測定崗梅根皂苷提取液和純化液在548 nm波長處的吸光度。通過回歸方程計(jì)算總皂苷濃度，根據(jù)公式（1）計(jì)算崗梅根總皂苷的得率［17］。

式中，C為被測液中崗梅總皂苷質(zhì)量濃度（mg/mL）；n為稀釋倍數(shù)；m為提取所用崗梅質(zhì)量（g）；V為取樣體積（mL）。

2.3 單因素試驗(yàn)

乙醇體積分?jǐn)?shù)：考察25%，50%，70%，75%，85%，95%乙醇苯積分?jǐn)?shù)時崗梅根的總皂苷得率。乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，崗梅根總皂苷得率也緩慢增大。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%時，粗提液中總皂苷得率達(dá)4.38%；乙醇體積分?jǐn)?shù)大于75%后，溶劑極性降低，與皂苷類成分極性相差較大，不利于極性大的皂苷類成分的溶出，但有利于親脂性雜質(zhì)和醇溶物溶出。故將正交試驗(yàn)中乙醇體積分?jǐn)?shù)影響因素的水平確定為70%，75%，85%。詳見圖2 A。

料液比：考察1∶10，1∶15，1∶20，1∶30，1∶40（g∶mL）料液比時崗梅根的總皂苷得率。料液比為1∶10，1∶15，1∶20，1∶30（g∶mL）時崗梅根總皂苷得率隨料液比的增大而增大，料液比為1∶30（g∶mL）時粗提液中總皂苷得率達(dá)4.57%，料液比大于1∶30（g∶mL）時崗梅根總皂苷得率呈下降趨勢。料液比較低時，乙醇含量較低，不利于皂苷類物質(zhì)溶解導(dǎo)致得率降低；料液比過高時，乙醇含量增多致醇溶性雜質(zhì)溶出量增多，導(dǎo)致皂苷類物質(zhì)得率降低，且不利于后續(xù)溶劑濃縮。故將正交試驗(yàn)中料液比影響因素的水平確定為1∶20，1∶30，1∶40（g∶mL）。詳見圖2 B。

回流提取時間：考察0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h回流提取時間時崗梅根的總皂苷得率。崗梅根總皂苷得率隨回流提取時間的增加先升高后降低，回流提取時間為2.0 h時粗提液中總皂苷得率達(dá)4.65%，繼續(xù)增加回流提取時間，部分含羥基的皂苷被氧化耗損或含羧基的皂苷被分解，結(jié)構(gòu)被破壞，皂苷得率下降。故將正交試驗(yàn)中回流提取時間影響因素的水平確定為1.0，1.5，2.0 h。詳見圖2 C。

回流提取溫度：考察60，70，80，90，95℃回流提取溫度時崗梅根的總皂苷得率。崗梅根總皂苷得率隨回流溫度的增加先升高后降低，回流溫度為90℃時粗提液中總皂苷得率達(dá)4.70%。低溫時不利于皂苷類物質(zhì)的溶出，高溫時部分含羥基的皂苷被氧化耗損或含羧基的皂苷被分解，結(jié)構(gòu)被破壞。故將正交試驗(yàn)中回流提取溫度影響因素的水平確定為80，90，95℃。詳見圖2 D。

2.4 正交試驗(yàn)

2.4.1 因素與水平

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以崗梅根粗提液中總皂苷得率為評價指標(biāo)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（因素A）、料液比（因素B）、回流提取時間（因素C）、回流提取溫度（因素D）為考察因素，各考察因素選取3個水平，以L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化崗梅根總皂苷的提取工藝。因素與水平見表1。

表1 因素與水平Tab.1 Factors and their levels

2.4.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果見表2。可知，影響崗梅根總皂苷得率的因素從大到小依次為B（料液比）＞D（回流提取溫度）＞A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）＞C（回流提取時間）。最佳提取工藝為A1B3C1D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶40（g∶mL）、回流提取1.0 h、提取溫度95℃，在此條件下粗提液中總皂苷得率為5.99%。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of the L9（34）orthogonal test

2.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

依據(jù)正交試驗(yàn)最優(yōu)工藝組合A1B3C1D3，重復(fù)3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到崗梅根總皂苷得率分別為5.98%，5.99%，6.01%，平均5.99%，RSD為0.25%（n=3）。表明優(yōu)選工藝穩(wěn)定，重復(fù)性較好。同時，采用主觀分析法分析影響崗梅根總皂苷得率的因素順序及最優(yōu)工藝條件。

2.5 崗梅根總皂苷對DPPH·和·OH清除的特性研究

對DPPH·的清除能力：配制0.1 mmol/L DPPH·乙醇溶液，取4 mL DPPH·乙醇溶液分別加入2 mL一定濃度粗提液、乙酸乙酯層或萃取后水層中，混勻，避光反應(yīng)30 min。采用紫外分光光度計(jì)于517 nm波長處測試吸光度值（A1）；使用2 mL 70%乙醇代替崗梅根粗提液、乙酸乙酯層或萃取后水層，測試吸光度值（A0）；使用2 mL 70%乙醇代替DPPH·乙醇溶液，測試吸光度值（A2）。以抗壞血酸溶液作陽性對照，按公式（2）計(jì)算DPPH·清除率。結(jié)果見圖3 A。

A.乙醇體積分?jǐn)?shù)B.料液比C.回流提取時間D.回流提取溫度圖2單因素試驗(yàn)優(yōu)化崗梅根總皂苷提取工藝A.Volume fraction of ethanol B.Ratio of solid to liquid C.Reflux-extraction time D.Reflux-extration temperatureFig.2 Optimization of the extraction process of total saponins from Ilicis Asprellae Radix by the single factor test

可知，崗梅根粗提液、乙酸乙酯層、萃取后水層對DPPH·均有一定清除能力，在5～60μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，清除率隨3種溶液質(zhì)量濃度的增加均升高，當(dāng)質(zhì)量濃度上升到一定程度，清除率趨向飽和。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，萃取后水層對DPPH·的清除率高于乙酸乙酯層，主要原因?yàn)閸徝犯傇碥蘸辛u基、羧基等極性基團(tuán)，易溶于水，不易溶于乙酸乙酯，故萃取后水層清除DPPH·的效果較好。乙酸乙酯層對DPPH·的清除率高于崗梅根粗提液，主要原因?yàn)榈蜆O性的皂苷易溶于乙酸乙酯，崗梅根粗提液的雜質(zhì)較多，對DPPH·的清除有消除作用，故乙酸乙酯層清除DPPH·的效果好。低濃度時，崗梅根粗提液、乙酸乙酯層、萃取后水層對DPPH·均有一定的清除效果，但其清除能力弱于相同濃度的抗壞血酸；質(zhì)量濃度為50μg/mL時，乙酸乙酯層、萃取后水層對DPPH·的清除效果與同質(zhì)量濃度的抗壞血酸的效果相當(dāng)。

對·OH的清除能力：采用水楊酸法測定，配制一系列濃度的粗提液、乙酸乙酯層或萃取后水層，依次加入2 mL 6 mmol/L硫酸亞鐵及2 mL 6 mmol/L過氧化氫，混勻，避光反應(yīng)10 min，再加入2 mL 6 mmol/L水楊酸溶液，混勻，避光反應(yīng)30 min，采用紫外分光光度計(jì)于510 nm波長處測試吸光度值（A1）；使用蒸餾水代替崗梅根粗提液和純化液，測試吸光度值（A0）；使用等體積的70%乙醇溶液替代體系中雙氧水溶液，測試吸光度值（A2）。以抗壞血酸溶液作陽性對照，按公式（2）計(jì)算·OH清除率。結(jié)果見圖3 B?？芍?，崗梅根粗提液、乙酸乙酯層、萃取后水層對·OH均有一定的清除能力，在10～70μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，清除率隨崗梅根粗提液、乙酸乙酯層、萃取后水層中質(zhì)量濃度的增加均升高，當(dāng)質(zhì)量濃度上升到一定程度，清除率趨向飽和。試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，萃取后水層對·OH的清除率高于乙酸乙酯層，主要原因?yàn)閸徝犯傇碥蘸蟹恿u基、羧基等極性基團(tuán)，易溶于水，不易溶于乙酸乙酯，且酚羥基上H質(zhì)子與·OH反應(yīng)形成水分子，故萃取后水層清除·OH的效果較好。低質(zhì)量濃度崗梅粗提液對·OH的清除率高于乙酸乙酯層，高質(zhì)量濃度乙酸乙酯層對·OH的清除率高于崗梅根粗提液，主要原因?yàn)榈唾|(zhì)量濃度崗梅根粗提液雜質(zhì)的協(xié)同作用致崗梅根粗提液清除·OH的效果好，隨著樣品溶液質(zhì)量濃度的增加，低極性的皂苷易溶于乙酸乙酯溶液，增強(qiáng)對DPPH·的清除作用，故乙酸乙酯層清除·OH的效果好。低濃度時，崗梅根粗提液、乙酸乙酯層、萃取后水層對·OH均有一定的清除效果，但清除能力均弱于同質(zhì)量濃度的抗壞血酸；高質(zhì)量濃度時，乙酸乙酯層、萃取后水層對·OH的清除效果與同質(zhì)量濃度抗壞血酸的效果接近。

A.DPPH·B.·OH圖3崗梅根總皂苷對DPPH·和·OH的清除作用A.DPPH·B.·OHFig.3 Scavenging effects of total saponins from Ilicis Asprellae Radix on DPPH·and·OH

3 討論

本研究中，經(jīng)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化崗梅根總皂苷回流提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶40（g∶mL）、回流提取時間1.0 h、回流提取溫度95℃，對應(yīng)崗梅根總皂苷得率為5.99%。使用等體積的石油醚、二氯甲烷除去親脂性雜質(zhì)，乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯層和純化后水層，萃取后水層、乙酸乙酯層、崗梅根粗提液對DPPH·和·OH的清除能力由強(qiáng)到弱依次為萃取后水層＞乙酸乙酯層＞崗梅根粗提液，且上述溶液中皂苷的質(zhì)量濃度越大，清除DPPH·和·OH的效果越顯著，清除能力與皂苷的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)的量效關(guān)系。崗梅根總皂苷具有良好的抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑應(yīng)用于食品、藥品等領(lǐng)域。后續(xù)研究中可采用大孔吸附樹脂對崗梅根總皂苷物質(zhì)做進(jìn)一步的分離純化，并深入探討崗梅根總皂苷的抗氧化活性與各有效成分間的量效關(guān)系，為其合理開發(fā)和深加工提供參考。