解熱顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

翟巧利，麥格皮熱提·阿不力米提，李 媛，劉 娟，范 偉，時(shí)扣榮△

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院，上海 200137；2.新疆維吾爾自治區(qū)莎車縣維吾爾醫(yī)醫(yī)院，新疆 喀什 844700）

解熱方為上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院老中醫(yī)唐英的臨床經(jīng)驗(yàn)方，以疏風(fēng)清熱解毒為法遣藥組方，由鴨跖草、大青葉、四季青、荊芥、紫蘇葉5味中藥材組方。方中，鴨跖草為君藥，味甘，性寒，有清熱解毒、利水消腫的功效。大青葉為臣藥，味苦，性寒，有清熱解毒、涼血消斑的功效。四季青味苦，性涼，有清熱解毒、消腫祛瘀的功效；荊芥性平溫，有疏風(fēng)解表、透疹消瘡的功效，共為佐藥。紫蘇葉為使藥，味辛，性溫，有解表、散寒、行氣、和胃的功效。諸藥合用，共奏疏風(fēng)解表、清熱解毒功效，用于治療屬外感風(fēng)熱表證的上呼吸道感染。全方組方嚴(yán)密，君臣佐使配伍合理，藥味簡練，功效專著，臨床療效明顯。解熱方的臨床使用劑型為湯劑，存在口感欠佳、保質(zhì)期短、不便貯存和運(yùn)輸?shù)热秉c(diǎn)。應(yīng)用現(xiàn)代化技術(shù)將湯劑優(yōu)化為顆粒劑，可更好地發(fā)揮療效，方便患者服用及攜帶。本研究中建立了解熱顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，采用薄層色譜（TLC）法對(duì)制劑中大青葉和四季青進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測定制劑中長梗冬青苷的含量。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），配有蒸發(fā)光散射檢測器；BSA124S型電子天平（德國賽多利斯公司，精度為萬分之一）；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為50 kHz）；聚酰胺薄膜（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；硅膠G板（青島海洋化工廠分廠）；DHG-9055A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國宇儀器制造有限公司）。

1.2 試藥

長梗冬青苷對(duì)照品（批號(hào)為111868-201202），靛藍(lán)對(duì)照品（批號(hào)為110716-201612），靛玉紅對(duì)照品（批號(hào)為110717-200204），均購于中國食品藥品檢定研究院，含量均不低于98%；解熱顆粒（醫(yī)院制劑，滬藥制備字Z20210046000，批號(hào)分別為201001，201002，201003）；缺大青葉、四季青陰性樣品均由上海萬仕誠藥業(yè)有限公司制劑室自制；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水；鴨跖草（批號(hào)為20200526-1），大青葉（批號(hào)為20200710-1），四季青（批號(hào)為191123-1），荊芥（批號(hào)為20200714-1），紫蘇葉（批號(hào)為20200804-1），均購于上海萬仕誠藥業(yè)有限公司，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院藥學(xué)部副主任中藥師公丕君鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

大青葉［1-3］：取樣品適量，研細(xì)，取5 g，加三氯甲烷20 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液。另取靛藍(lán)對(duì)照品和靛玉紅對(duì)照品，加三氯甲烷制成每1 mL各含1 mg的混合對(duì)照品溶液。按解熱顆粒制備工藝制備不含大青葉的陰性樣品，依法制備缺大青葉的陰性對(duì)照品溶液。照2020年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC法試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-三氯甲烷-丙酮（5∶4∶2，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干。供試品溶液色譜中，在與靛藍(lán)和靛玉紅混合對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置分別顯相同的藍(lán)色斑點(diǎn)和淺紫紅色斑點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰，分離效果較好，且陰性對(duì)照無干擾。色譜圖見圖1 A。

四季青［4］：取樣品適量，研細(xì)，取5 g，加乙酸乙酯20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取長梗冬青苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的對(duì)照品溶液。按解熱顆粒制備工藝制備不含四季青的陰性樣品，依法制備缺四季青的陰性對(duì)照品溶液。照2020年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC法試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各4μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（7∶1∶0.2，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與長梗冬青苷對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰，分離效果較好，且陰性對(duì)照無干擾。色譜圖見圖1 B。

1.陰性對(duì)照品溶液（缺大青葉、四季青）2.對(duì)照品溶液（靛藍(lán)和靛玉紅、長梗冬青苷）3-5.供試品溶液（批號(hào)分別為201001，201002，201003）A.大青葉B.四季青圖1薄層色譜圖1.Negative reference solution（lacking Isatidis Folium and Ilicis Chinensis Folium，respectively）2.Reference solution（indigo and indirubin，pedunculoside，respectively）3-5.Test solution（batch number：201001，201002 and 201003）A.Isatidis Folium B.Ilicis Chinensis FoliumFig.1 TLC chromatograms

2.2 含量測定［4-5］

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：10%異丙醇甲醇（A）-10%異丙醇水溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL和20 μL（對(duì)照品溶液），10 μL（供試品溶液）。理論板數(shù)按長梗冬青苷峰計(jì)不得低于2 000。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序（%）Tab.1 Program of gradient elution of mobile phase（%）

2.2.2 溶液制備

取長梗冬青苷對(duì)照品適量，精密稱定，加80%甲醇制成每1 mL含0.3 μg的對(duì)照品溶液。取樣品適量，研細(xì)，取1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為300 W，頻率為40 kHz）30 min，取出，放冷，再次稱定質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得試品溶液。按解熱顆粒處方和制備工藝制備缺四季青的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備缺四季青的陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別吸取2.2.2項(xiàng)下3種溶液各適量，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果陰性對(duì)照品溶液色譜圖中，在與長梗冬青苷對(duì)照品溶液相同保留時(shí)間處無干擾峰，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖2。

1.長梗冬青苷A.供試品溶液B，B'.對(duì)照品溶液（進(jìn)樣量分別為10 μL和20 μL）C.陰性對(duì)照品溶液圖2高效液相色譜圖1.PedunculosideA.Test solution B，B'.Reference solution（injection volumes of 10 μL and 20 μL，respectively）C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：分別精密量取2.2.2項(xiàng)下長梗冬青苷對(duì)照品溶液4，8，12，16，20μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以長梗冬青苷對(duì)照品進(jìn)樣量（X，μL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程logY=1.582 7 logX+2.149 4（r=0.999 7，n=5）。結(jié)果表明，長梗冬青苷的進(jìn)樣量在0.715 4～3.557 5 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取2.2.2項(xiàng)下長梗冬青苷對(duì)照品溶液適量，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果長梗冬青苷平均峰面積為337.40，RSD為1.40%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2.2項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，12，24，48 h時(shí)按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果放置0，12，24，48 h時(shí)長梗冬青苷的含量分別為0.901 1%，0.913 2%，0.919 5%，0.905 2%，放置12，24，48 h時(shí)的RSD分別為0.90%，1.40%，0.30%，表明供試品溶液在室溫放置48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為201001）樣品適量，精密稱定，共6份，依法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果樣品中長梗冬青苷的平均含量為9.01 mg/g，RSD為1.40%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為201001）樣品適量，精密稱定，共6份，精密加入質(zhì)量濃度為0.181 1 mg/mL的長梗冬青苷對(duì)照品溶液15 mL，揮干溶劑，依法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.2.4 樣品含量測定

取3批（批號(hào)分別為201001，201002，201003）樣品各適量，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定2次，記錄峰面積，并計(jì)算樣品含量。結(jié)果3批樣品中長梗冬青苷的含量分別為7.90，7.60，7.40 mg/g。

3 討論

3.1 TLC鑒別

本研究中參考2020年版《中國藥典（四部）》［4］和文獻(xiàn)［1-3］，采用TLC法對(duì)制劑中大青葉和四季青進(jìn)行定性鑒別，分別選用有效成分靛藍(lán)和靛玉紅、長梗冬青苷作為對(duì)照。結(jié)果顯示，大青葉和四季青的TLC分離效果較好，斑點(diǎn)顯色清晰，可有效進(jìn)行鑒別。同時(shí)，參考文獻(xiàn)［6-8］對(duì)方中鴨跖草、荊芥和紫蘇葉進(jìn)行了TLC鑒別，發(fā)現(xiàn)這3味中藥材的分離效果較差，且斑點(diǎn)不清晰，故暫未列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有待進(jìn)一步研究。

3.2 含量測定

長梗冬青苷是四季青的主要有效成分，屬五環(huán)三萜類化合物［9］，是四季青的指標(biāo)性成分［4］。本研究中建立了測定解熱顆粒中長梗冬青苷含量的HPLC法，并進(jìn)行了方法學(xué)考察。結(jié)果顯示，長梗冬青苷色譜峰的峰形良好，且分離度佳，各組分互不干擾，表明含量測定方法簡便，結(jié)果可靠。同時(shí)，對(duì)方中君藥鴨跖草和臣藥大青葉也進(jìn)行了含量測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)峰形不佳，且分離效果較差，故暫未列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有待進(jìn)一步研究。

3.3 方法評(píng)價(jià)

所建立的方法操作簡便、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，可用于解熱顆粒的質(zhì)量控制。