高效液相色譜法測定依法韋侖異構(gòu)體含量*

張穩(wěn)穩(wěn)，譚黎君，劉小東，鄭曦孜

（1.重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)院，重慶 401331；2.重慶希韋醫(yī)藥科技有限公司，重慶 400714；3.重慶市長壽區(qū)中醫(yī)院，重慶 401220）

依法韋侖化學(xué)名為（4S）-6-氯-4-（環(huán)丙乙炔）-4-三氟甲基-苯并-1，4-二氫噁唑-2-酮［1］，是由美國Merck公司開發(fā)的非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，主要用于首次治療人體免疫缺陷病毒1亞型（HIV-1）患者［2-5］，于1999年2月被美國食品藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)上市，商品名為Sustiva＆reg或Stocrin＆reg?，F(xiàn)有技術(shù)通常以對氯苯胺為起始原料，發(fā)生酰氯化反應(yīng)，后保護(hù)氨基，得N-2，2-二甲基丙酰基對氯苯胺，所得產(chǎn)物與三氟乙酸乙酯反應(yīng)后脫保護(hù)，與環(huán)丙乙炔、格林尼亞試劑反應(yīng)，經(jīng)手性誘導(dǎo)、2，3-二氯-5，6-二氫基苯醌（DDQ）環(huán)化、脫保護(hù)等步驟，最后環(huán)合得目標(biāo)產(chǎn)物依法韋侖［6-16］。雖然工藝較詳細(xì)，但合成過程中產(chǎn)生的對映異構(gòu)體［（4R）-6-氯-4-（環(huán)丙乙炔）-4-三氟甲基-苯并-1，4-二氫噁唑-2-酮］不易分離，極大地影響了依法韋侖成品的質(zhì)量。目前，尚未檢索到依法韋侖異構(gòu)體含量測定方法研究。本研究中建立了測定依法韋侖異構(gòu)體含量的高效液相色譜法，方法學(xué)考察參考文獻(xiàn)［17-18］，為準(zhǔn)確測定依法韋侖異構(gòu)體的含量提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BT125D型電子分析天平（北京賽多利斯公司，精度為十萬分之一）；LC-20A型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；UV-2600型紫外可見分光光度計（日本島津公司）。

1.2 試藥

依法韋侖對照品（批號為R038UO，含量為99.7%），依法韋侖異構(gòu)體對照品（批號為R061SO，含量為99.7%），均購于United States Pharmacopoeia；依法韋侖樣品（重慶希韋醫(yī)藥科技有限公司，批號分別為Y01，Y02，Y03）；正己烷、異丙醇、乙醇（色譜純，德國默克公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Agilent Zorbax SB-Phenyl苯基柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Chiralpak OD-H手性柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：正己烷-乙醇（97∶3，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：250 nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：20 μL；運(yùn)行時間：40 min。分別取依法韋侖對照品100 mg和依法韋侖異構(gòu)體對照品25 mg，置同一100 mL容量瓶中，加流動相溶解并定容，作為混合對照品溶液，在此色譜條件下分別進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。依法韋侖及其異構(gòu)體在此色譜條件下的分離度為1.5，依法韋侖色譜峰理論板數(shù)為15 728，拖尾因子為1.01。色譜圖見圖1。

1.依法韋侖異構(gòu)體2.依法韋侖圖1高效液相色譜圖1.Isomer of efavirenz 2.EfavirenzFig.1 HPLC chromatograms

2.2 溶液制備

取依法韋侖異構(gòu)體對照品25 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加流動相溶解并定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL的對照品溶液。取依法韋侖樣品100 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加流動相溶解并定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取依法韋侖異構(gòu)體對照品10.29 mg，精密稱定，加流動相溶解并稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.05，1.03，8.21，10.26，15.39，20.52 μg/mL的系列溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=15 064X+4 692.9（r=0.999 7，n=6）。結(jié)果表明，依法韋侖異構(gòu)體質(zhì)量濃度在0.05～20.52μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

定量限與檢測限確定：精密吸取線性關(guān)系考察項(xiàng)下溶液（質(zhì)量濃度為0.05 μg/mL）作為定量限檢測溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，計算其色譜峰峰高與噪聲的比值信噪比（S/N），以S/N為10∶1時的響應(yīng)濃度為定量限，并將定量限檢測溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果定量限為0.050 μg/mL。另取線性關(guān)系考察項(xiàng)下溶液（質(zhì)量濃度為0.05 μg/mL）3 mL，置10 mL容量瓶中，加流動相稀釋并定容，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以S/N為3∶1時的響應(yīng)濃度為檢測限，結(jié)果檢測限為0.015μg/mL。

中間精密度試驗(yàn)與重復(fù)性試驗(yàn)：取依法韋侖異構(gòu)體對照品和樣品（批號為Y01）各適量，精密稱定，共6份，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測定；次日另換1人另取6份該批樣品，同法配置并測定。結(jié)果中間精密度試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均為5.22%（n=6），表明儀器精密度良好，方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品（批號為Y01）100 mg，精密稱定，共9份，分別置100 mL容量瓶中，加入80%，100%，120%濃度的2.2項(xiàng)下對照品溶液（質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL），各3份，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

耐用性試驗(yàn)：分別考察不同流速（0.8，1.2 mL/min）和不同柱溫（30，40℃）對檢測結(jié)果的影響。結(jié)果分離度均大于1.5，依法韋侖異構(gòu)體含量不低于0.11%，表明方法耐用性好。

2.4 依法韋侖異構(gòu)體含量測定

取3批（批號分別為Y01，Y02，Y03）樣品，各100 mg，精密稱定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，并計算依法韋侖異構(gòu)體的含量。結(jié)果含量分別為0.11%，0.12%，0.11%，平均為0.11%。

3 討論

3.1 色譜柱選擇

考察了手性多聚物型、Daicel Chiralpak?IC鍵合型、纖維素-三［3，5-二甲苯基氨基甲酸酯］衍生物的Chiralpak OD-H柱等手性色譜柱，結(jié)果前兩類色譜柱的分離度、理論板數(shù)、分離因子等參數(shù)存在缺陷，分離效果差，后者能有效分離依法韋侖及其異構(gòu)體，分離度大于1.5，依法韋侖色譜峰理論板數(shù)為15 728，拖尾因子為1.01。故最終選擇該型苯基柱聯(lián)用手性色譜柱。

3.2 檢測波長選擇

分別取依法韋侖及其異構(gòu)體對照品各適量，采用紫外可見-分光光度計分別于200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果顯示依法韋侖及其異構(gòu)體均在250 nm波長處有較大紫外吸收。故最終選擇檢測波長為250 nm。

3.3 流動相選擇

考察了正己烷-異丙醇（90∶10，V/V）和正己烷-乙醇（90∶10，97∶3，V/V）流動相系統(tǒng)。流動相系統(tǒng)為正己烷-異丙醇時，依法韋侖異構(gòu)體色譜峰峰形差，分離效果不佳；流動相系統(tǒng)為正己烷-乙醇（90∶10，V/V）時，分離度小于1.5；為正己烷-乙醇（97∶3，V/V）時，分離度為1.5，色譜峰峰形好。故最終選擇流動相為正己烷-乙醇（97∶3，V/V）。

3.4 方法評價

該方法專屬性強(qiáng)、精密度高、準(zhǔn)確度好，可有效控制依法韋侖異構(gòu)體的含量，滿足對其手性異構(gòu)體的質(zhì)量控制要求。