氣相色譜法測(cè)定胃蛋白酶中丙酮和異丙叉丙酮?dú)埩袅?

張德偉，袁林，李潔玉，冉麗娟，曾珍，郭婭Δ

（1.重慶市萬(wàn)州食品藥品檢驗(yàn)所，重慶 404000；2.重慶市三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶 404000）

胃蛋白酶又名胃液素，是胃液中主要的蛋白水解酶，能催化具有苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等的肽鍵斷裂，使大分子的蛋白質(zhì)分解為小分子多肽［1-2］。胃蛋白酶在消化道中具有非常重要的生理功能，其活性的大小與人體消化道疾病直接相關(guān)［3］。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)胃蛋白酶的研究主要集中在臨床療效、藥理學(xué)領(lǐng)域［4-10］，對(duì)其質(zhì)量的研究較少。生產(chǎn)胃蛋白酶的原料主要來(lái)源于脊椎動(dòng)物的胃黏膜，但胃黏膜主細(xì)胞分泌的是胃蛋白酶原，胃蛋白酶原在pH 2.0的酸性條件下，N端約有25個(gè)氨基酸殘基從肽鏈上水解下來(lái)，被激活后才能生成胃蛋白酶。胃蛋白酶的分離技術(shù)主要為有機(jī)溶劑提取法、鹽析法、底物親和法等，工業(yè)生產(chǎn)中的常用方法為有機(jī)溶劑提取法，利用胃蛋白酶在不同濃度有機(jī)溶劑中的溶解度實(shí)現(xiàn)分離，從而獲得混合的胃蛋白酶初品。工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中常用有機(jī)溶劑為工業(yè)丙酮，丙酮對(duì)胃蛋白酶的分辨力相對(duì)較高，獲得胃蛋白酶粗品的活性較強(qiáng)，且丙酮易被除去，可回收再利用，但反復(fù)萃取會(huì)增加溶劑的消耗量，同時(shí)會(huì)造成少部分酶失活，影響收率，甚至?xí)a(chǎn)生新的溶劑雜質(zhì)［11-15］。現(xiàn)有生產(chǎn)工藝還不能完全除去胃蛋白酶原料中殘留的有機(jī)溶劑，這是制約該產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個(gè)技術(shù)難題。田玉瓊等［16］采用單掃描極譜法測(cè)定胃蛋白酶中丙酮?dú)埩袅?，但該法?duì)除丙酮以外的其他有機(jī)溶劑分離度欠佳，且極譜分析儀普及率低?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)該品種殘留溶劑進(jìn)行全面檢測(cè)［17］。本研究中建立了同時(shí)測(cè)定胃蛋白酶中丙酮和異丙叉丙酮溶劑殘留的氣相色譜法?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

QUINTIX224-1CN型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，精度為萬(wàn)分之一）；SCI 20D型超純水機(jī)（重慶科潤(rùn)水處理設(shè)備有限公司）；G6500-CTC型自動(dòng)進(jìn)樣器、2010Plus型氣相色譜儀（日本島津科技有限公司）。

1.2 試藥

純化水（實(shí)驗(yàn)室自制）；丙酮（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；異丙叉丙酮（分析純，山東西亞化學(xué)科技有限公司）；胃蛋白酶樣品購(gòu)于西南地區(qū)的4個(gè)廠家（分別編號(hào)為A，B，C，D），各2個(gè)批次，隨機(jī)采樣。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［18-20］

頂空進(jìn)樣瓶：汽化室溫度85℃，汽化時(shí)間30 min；進(jìn)樣口溫度：200℃；分流-不分流進(jìn)樣（SSL）：進(jìn)樣量1 mL，分流比25∶1；色譜柱：Agilent DB-Wax型毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）；氮?dú)饬髁浚?.0 mL/min，柱溫：程序升溫（初始溫度40℃，保留時(shí)間7 min，以10℃/min的速率升至80℃，再以25℃/min的速率升至200℃，保持5 min）；火焰離子化檢測(cè)器（FID）：溫度250℃，氫氣流量45 mL/min，空氣流量200 mL/min，尾吹氮?dú)饬髁?5 mL/min。

2.2 溶液制備

取樣品0.3 g，精密稱定，置20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，加純化水5 mL，密封，渦旋溶解，即得供試品溶液。取丙酮、異丙叉丙酮對(duì)照試劑各適量，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加純化水稀釋并定容，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為500，20μg/mL的混合對(duì)照貯備液。分別精密量取混合對(duì)照貯備液1，2，4，6，8 mL，置10 mL容量瓶中，加純化水稀釋并定容，搖勻，即得系列混合對(duì)照試劑溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：精密量取純化水5 mL，置20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，密封，即得空白溶液。取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照試劑溶液、供試品溶液及空白溶液各適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1。供試品溶液色譜圖中，在與混合對(duì)照試劑溶液相應(yīng)保留時(shí)間處有相應(yīng)色譜峰，空白溶液無(wú)干擾，表明方法專屬性良好。

線性關(guān)系考察：分別精密量取2.2項(xiàng)下系列混合對(duì)照試劑溶液各5 mL，置20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，密封，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、測(cè)得峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y丙=2 866.5Х丙-8 289.8（r=0.999 4），Y異=821.4Х異-312.60（r=0.999 0）。結(jié)果表明，丙酮、異丙叉丙酮質(zhì)量濃度分別在50～400μg/mL和2～16μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測(cè)限和定量限確定：取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照試劑溶液適量，逐級(jí)稀釋，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，按信噪比（S/N）分別為3，10的質(zhì)量濃度計(jì)算。結(jié)果丙酮、異丙叉丙酮的檢測(cè)限分別為0.03，0.09 μg/mL，定量限分別為0.10，0.30μg/mL，表明檢測(cè)靈敏度高。

精密度試驗(yàn)：精密量取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照試劑溶液10 mL，置50 mL容量瓶中，加水稀釋并定容，搖勻。精密吸取5 mL，置20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，密封。按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果丙酮、異丙叉丙酮峰面積的RSD分別為1.85%，2.16%（n=6），表明儀器精密度良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的胃蛋白酶樣品適量，精密稱定，共9份，分別精密加入低、中、高質(zhì)量濃度的混合對(duì)照貯備液1 mL，加純化水4.0 mL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.4 樣品含量測(cè)定

取廠家A，B，C，D各2批次胃蛋白酶樣品適量，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定2次，按峰面積計(jì)算各批次樣品中有機(jī)溶劑丙酮和異丙叉丙酮的殘留量，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，不同廠家生產(chǎn)的胃蛋白酶樣品中有機(jī)溶劑丙酮和異丙叉丙酮?dú)埩袅坎町愝^大。所有胃蛋白酶樣品中均檢測(cè)出了丙酮、異丙叉丙酮?dú)埩?，丙酮的殘留量? 008～4 692μg/g，異丙叉丙酮的殘留量為31～90μg/g，表明不同廠家的生產(chǎn)工藝對(duì)胃蛋白酶原料殘留溶劑有較大影響。

表2 樣品中丙酮、異丙叉丙酮溶劑殘留量檢測(cè)結(jié)果（μg/g，n=2）Tab.2 Results of determination of acetone and mesityl oxide residues in samples（μg/g，n=2）

1.丙酮2.異丙叉丙酮A.空白溶液B.混合對(duì)照試劑溶液C.供試品溶液圖1氣相色譜圖1.Acetone 2.Mesityl oxideA.Blank solution B.Solution of mixed reference reagents C.Test solutionFig.1 GC chromatograms

3 討論

胃蛋白酶屬親水性生物酶，在生產(chǎn)過(guò)程中先將胃黏膜溶解于一定濃度的鹽酸溶液中，再加丙酮沉淀，分離干燥后易形成泡狀微粒，殘留的有機(jī)溶劑很難再揮發(fā)除盡。曾考察了以N，N-二甲基甲酰胺作溶劑的液體進(jìn)樣方式，但其重復(fù)性、精密度均較差。本研究中比較了樣品溶解密封后，分別置70，80，90℃汽化環(huán)境中各加熱20 min。結(jié)果顯示，樣品置70℃加熱時(shí)，沸點(diǎn)較高的異丙叉丙酮信號(hào)響應(yīng)值較低，檢測(cè)限大于5 μg/mL；置90℃加熱時(shí)，由于丙酮沸點(diǎn)較低，殘留量相對(duì)較多，其峰面積響應(yīng)值太高，而異丙叉丙酮沸點(diǎn)較高，且含量相對(duì)較低，不能兼顧兩者信號(hào)的響應(yīng)強(qiáng)度；85℃頂空加熱20 min時(shí)，2種有機(jī)溶劑的線性關(guān)系及回收率均相對(duì)良好，樣品中有機(jī)溶劑的釋放濃度能完全滿足檢測(cè)要求，檢出率高，響應(yīng)靈敏，兼顧了各化合物沸點(diǎn)不同的問(wèn)題。

本研究中采用頂空進(jìn)樣，可避免樣品對(duì)儀器和色譜柱造成污染，對(duì)揮發(fā)性有機(jī)溶劑的靈敏度更好，降低了樣品中其他組分對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾，第1次增加了胃蛋白酶中異丙叉丙酮的檢測(cè)指標(biāo)。結(jié)果顯示，不同廠家的生產(chǎn)工藝存在一定差異，有機(jī)溶劑殘留量也較大，廠家A生產(chǎn)的胃蛋白酶中丙酮?dú)埩袅考s為0.10%，廠家D約為0.46%。

綜上所述，該方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、精密度高、重復(fù)性好，可用于胃蛋白酶原料藥中有機(jī)溶劑殘留量的檢測(cè)。