羅漢松實(shí)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

班月梅，劉小杜，彭益淳，姜佩佩，黃增瓊

（廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021）

羅漢松實(shí)為羅漢松科羅漢松屬植物羅漢松Podocarpus macrophyllus（Thunb.）D.Don和短葉羅漢松Podocarpus macrophyllus（Thunb.）D.Don var.makiEndl.的種子及花托，藥用部位主要為種子［1］?；ㄍ胁糠职被?、礦物質(zhì)元素及多糖含量豐富，可食用或泡酒飲用［2-3］。羅漢松實(shí)（特指羅漢松種子）味甘，性微溫，具有行氣止痛和養(yǎng)血功效，對(duì)胃脘疼痛及血虛面色萎黃等癥狀有明顯療效［1］。《本草綱目拾遺》曰：“味甘補(bǔ)腎，其香益肺；治心胃痛，大補(bǔ)元?dú)?。”?］羅漢松實(shí)含有降二萜內(nèi)酯類及萜類化合物、生物堿化合物和黃酮類化合物［5-6］，其提取物具有調(diào)脂、改善心肌供血、保肝、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用［7-8］。民間有應(yīng)用羅漢松實(shí)治療心胃痛和胃脘疼痛的歷史。心胃痛為因心前區(qū)疼痛而引起胃脘疼痛，可能與心肌缺血有關(guān)。研究表明，總黃酮具有良好的抗心肌缺血作用［9-10］。本研究中選擇總黃酮作為羅漢松實(shí)藥材的含量控制指標(biāo)成分。羅漢松實(shí)藥材資源豐富，但卻鮮有關(guān)于藥材質(zhì)量控制方法的研究報(bào)道。為了更好地開發(fā)利用羅漢松實(shí)藥材資源，控制藥材質(zhì)量，本研究中對(duì)7個(gè)不同產(chǎn)地羅漢松實(shí)藥材的外觀性狀、顯微鑒別、薄層色譜（TLC）鑒別及水分、總灰分、浸出物、總黃酮的含量進(jìn)行了研究，建立了羅漢松實(shí)藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HR-04A型多功能粉碎機(jī)（上海哈瑞斯電器有限公司）；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；箱式電阻爐（上海必爾得儀器實(shí)業(yè)有限公司）；SHA-CA型數(shù)顯水浴恒溫振蕩器（金壇市易晨?jī)x器制造有限公司）；HH-S6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）；Digital型生物顯微鏡（麥克迪奧光學(xué)儀器有限公司）；ATY224型電子分析天平（日本島津公司，精度為萬分之一）；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 試藥

羅漢松實(shí)采集于7個(gè)產(chǎn)地（表1），經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中藥學(xué)教研室李瓊講師鑒定為羅漢松科植物短葉羅漢松Podocarpus macrophyllus（Thunb.）D.Don var.makiEndl.的種子；羅漢松實(shí)總黃酮提取物（實(shí)驗(yàn)室自制）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)為1009H021，純度≥98%）；硝酸鋁（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；亞硝酸鈉（分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）；氫氧化鈉、無水乙醇均為分析純，購(gòu)于成都市科隆化學(xué)品有限公司。

表1 羅漢松實(shí)藥材來源Tab.1 Sources of Semen Podocarpi

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別

取不同產(chǎn)地羅漢松實(shí)藥材，用游標(biāo)卡尺測(cè)量，結(jié)果見圖1和表2。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地羅漢松實(shí)均呈橢圓形、類圓形或斜卵圓形；種子表面粗糙，常為灰綠色或棕褐色，有突起的不規(guī)則網(wǎng)紋，具白霜附著；質(zhì)堅(jiān)實(shí)，不易破碎；氣微，味淡。

表2 不同產(chǎn)地羅漢松實(shí)縱長(zhǎng)和直徑測(cè)量結(jié)果（±s，cm，n=100）Tab.2 Results of longitudinal length and diameter measuring of Semen Podocarpi from different producing areas（±s，cm，n=100）

表2 不同產(chǎn)地羅漢松實(shí)縱長(zhǎng)和直徑測(cè)量結(jié)果（±s，cm，n=100）Tab.2 Results of longitudinal length and diameter measuring of Semen Podocarpi from different producing areas（±s，cm，n=100）

編號(hào)1 2 3 4 5 6 7產(chǎn)地廣西北海市湖北恩施市湖南長(zhǎng)沙市四川成都市江西奉新縣江蘇宿遷沭陽(yáng)縣福建泉州永春縣縱長(zhǎng)0.85±0.07 0.81±0.07 0.85±0.08 0.84±0.07 0.84±0.09 0.85±0.06 0.85±0.08直徑0.64±0.06 0.60±0.06 0.64±0.07 0.65±0.06 0.64±0.07 0.65±0.05 0.63±0.06

圖1 廣西產(chǎn)羅漢松種子光學(xué)照片F(xiàn)ig.1 Optical photos of the seeds of Podocarpus macrophyllus from Guangxi Province

2.2 顯微鑒別

切面特征：羅漢松實(shí)用單面刀片分別沿縱軸和橫軸切開，置體視顯微鏡下觀察。種子斷面呈米白色，富粉性，為種子胚乳，斷面種皮厚，子葉1，黃棕色；橫切面中心有一小孔，系子葉生長(zhǎng)孔道（圖2 A）?？v切面中間有一凹槽，系子葉痕跡，部分可見子葉（圖2 B）。

A.橫切面B.縱切面圖2羅漢松種子橫切面和縱切面顯微照片A.Cross section B.Longitudinal sectionFig.2 Micrographs of cross section and longitudinal section of seeds of Podocarpus macrophyllus

粉末特征：取羅漢松實(shí)粉末，過5號(hào)篩，按2020年版《中國(guó)藥典（四部）》通則2001項(xiàng)下方法［11］230制片，用光學(xué)顯微鏡觀察粉末特征，另在以上處理方法基礎(chǔ)上滴加碘液再制片觀察。肉眼觀察，羅漢松實(shí)粉末為黃棕色。顯微鏡下觀察，種皮表皮細(xì)胞為黃棕色或灰褐色，呈多邊形或長(zhǎng)方形緊密排列；石細(xì)胞單個(gè)散在或多個(gè)成群，淡綠色，呈卵圓形、長(zhǎng)方形或不規(guī)則形，壁厚，孔溝明顯；淀粉粒眾多，卵圓形或類圓形，臍點(diǎn)及層紋不明顯，滴加碘液后呈藍(lán)色淀粉粒及黃色糊粉粒，兩者多呈糊化狀態(tài)；網(wǎng)紋螺紋導(dǎo)管少見。顯微特征見圖3。

A.種皮表皮細(xì)胞B.石細(xì)胞C.淀粉粒D.滴加碘液的淀粉粒E.導(dǎo)管F.滴加碘液的糊粉粒圖3羅漢松實(shí)粉末顯微特征（×40）A.Epidermal cells of seed coat B.Stone cells C.Starch grain D.Starch grain in iodine solution E.Vessels F.Aleurone grain in iodine solutionFig.3 Microscopic characteristics of Semen Podocarpi powder（×40）

2.3 TLC鑒別

分別取不同產(chǎn)地的羅漢松實(shí)粉末8.0 g，過20目篩，置錐形瓶中，加甲醇50 mL，超聲（功率為100 W，頻率為40 kHz）2 h，濾過，濾液蒸干，取少量浸膏加1 mL甲醇溶解制成供試品溶液。以廣西產(chǎn)羅漢松實(shí)為對(duì)照藥材，同法制備成對(duì)照藥材溶液。照2020年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502試驗(yàn)［11］59，吸取上述溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-冰醋酸（2∶1∶0.5，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品藥材溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)顯色清晰，分離度較好。色譜圖見圖4。

2.4 水分、灰分、浸出物測(cè)定

水分、總灰分、浸出物測(cè)定分別依據(jù)2020年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0832第四法［11］111、通則2302［11］232、通 則2201［11］234。結(jié) 果 顯 示，7個(gè) 產(chǎn) 地 樣 品 的 水 分8.80%～15.13%，多低于13.00%；總灰分為3.47%～4.68%；冷水溶性浸出物為1.41%～3.15%，熱水溶性浸出物為7.13%～9.21%，冷醇溶性浸出物為0.20%～1.39%，熱醇溶性浸出物為0.95～3.89%。詳見表3。

表3 水分、灰分、浸出物測(cè)定結(jié)果（%，n=3）Tab.3 Results of content determination of moisture，ash and extract（%，n=3）

1.對(duì)照藥材溶液2-7.供試品溶液（編號(hào)為2-7）圖4薄層色譜圖1.Reference solution of medicinal materials 2-7.Test solution（number：2-7）Fig.4 TLC chromatograms

2.5 總黃酮含量［12］測(cè)定

2.5.1 溶液制備

取羅漢松種子粗粉20 g，置圓底燒瓶中，加6倍量70%乙醇，回流提取1 h，濾過，收集濾液，濾渣重復(fù)提取1次，合并2次濾液，減壓濃縮，80℃烘干。取羅漢松實(shí)總黃酮提取物50 mg，精密稱定，置燒杯中，加40 mL 70%乙醇，超聲30 min，溶液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加70%乙醇定容，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的供試品溶液，置4℃冰箱保存，備用。取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液，置4℃冰箱保存，備用。取70%乙醇，置25 mL容量瓶中，搖勻，即得空白對(duì)照溶液。

2.5.2 顯色方法

取亞硝酸鈉固體5 g，精密稱定，置燒杯中，加少量純化水溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加純化水定容，搖勻，制成5%NaNO2溶液，置4℃冰箱保存，備用。同法制備10%Al（NO3）3溶液和4%NaOH溶液。分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白對(duì)照溶液各適量，置25 mL容量瓶中，加5%NaNO2溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%Al（NO3）3溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加4%NaOH溶液5 mL，搖勻，放置15 min，顯色。

2.5.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液0.04，0.08，0.14，0.18，0.22 mL，分別置25 mL容量瓶中，加70%乙醇配制成系列質(zhì)量濃度分別為0.32，0.64，1.12，1.44，1.76 μg/mL的溶液，按2.5.2項(xiàng)下方法顯色，設(shè)置測(cè)定波長(zhǎng)為253 nm，以空白對(duì)照溶液調(diào)零。以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（C，μg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=2.282 3C+0.395 7（r=0.995 2，n=5）。結(jié)果表明，蘆丁質(zhì)量濃度在0.32～1.76 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取線性關(guān)系考察項(xiàng)下質(zhì)量濃度為1.12μg/mL的對(duì)照品溶液，按2.5.2項(xiàng)下方法顯色，于253 nm波長(zhǎng)處，以空白對(duì)照溶液調(diào)零，重復(fù)測(cè)定6次。結(jié)果的RSD為0.30%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取6份烘干后的總黃酮提取物各50 mg，精密稱定，依法制備供試品溶液。精密量取0.1 mL，置25 mL容量瓶中，按2.5.2項(xiàng)下方法顯色，于253 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以空白對(duì)照溶液調(diào)零，代入回歸方程計(jì)算總黃酮含量。結(jié)果總黃酮平均含量為293.45 mg/g，RSD為4.69%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密量取2.5.1項(xiàng)下質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的供試品溶液0.1 mL，置25 mL容量瓶中，按2.5.2項(xiàng)下方法顯色，于253 nm波長(zhǎng)處分別于避光放置15，30，45 min時(shí)測(cè)定吸光度，以空白對(duì)照溶液調(diào)零。結(jié)果的RSD為1.73%（n=3），表明供試品溶液在45 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的羅漢松總黃酮提取物6份，各25 mg，精密稱定，分別加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品3.76 mg，依法制備供試品溶液，分別精密量取0.1 mL，按2.5.2項(xiàng)下方法顯色，于253 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以空白對(duì)照溶液調(diào)零，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表4。

表4 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.4 Results of the recovery test（n=6）

2.5.4 樣品含量測(cè)定

取7個(gè)產(chǎn)地同批次羅漢松實(shí)（編號(hào)為1-7）總黃酮提取物各50 mg，精密稱定，各3份，依法制備供試品溶液，分別精密量取0.1 mL，按2.5.2項(xiàng)下方法顯色，于253 nm波長(zhǎng)處測(cè)定供試品溶液吸光度，以空白對(duì)照溶液調(diào)零，代入回歸方程計(jì)算含量。結(jié)果見表5。

表5 樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg/g）Tab.5 Results of content determination of total flavonoids in samples（mg/g）

3 討論

3.1 性狀與顯微鑒別

羅漢松實(shí)由種子和花托組成，吳魯東等［13］曾對(duì)其枝葉進(jìn)行外觀性狀、薄層鑒別等生藥學(xué)研究，本研究中對(duì)羅漢松實(shí)進(jìn)行生藥學(xué)研究。通過對(duì)7個(gè)產(chǎn)地不同種源羅漢松種子的性狀觀察，可見其性狀基本一致；7個(gè)產(chǎn)地的樣品粉末均觀察到大量淀粉粒、糊粉粒和石細(xì)胞，可作為羅漢松種子粉末顯微鑒別的標(biāo)志性特征。羅漢松實(shí)含揮發(fā)油［14］，但本研究中的顯微鑒別未發(fā)現(xiàn)7個(gè)產(chǎn)地的樣品粉末存在油室或油滴，還需作進(jìn)一步研究。

3.2 水分、灰分、浸出物測(cè)定

由表3可知，大部分樣品水分含量在10%～13%范圍，擬訂羅漢松實(shí)藥材含水量為不超過13.0%。中藥材在儲(chǔ)存過程中出現(xiàn)的蟲害、霉變、潮解等變質(zhì)現(xiàn)象多與含水量有關(guān)［15］，要加強(qiáng)對(duì)水分的研究和管理，藥材也應(yīng)保存在干燥處?？偦曳衷?.0%～5.0%范圍內(nèi)，擬訂總灰分不超過5.0%。

在進(jìn)行浸出物測(cè)定時(shí)，對(duì)浸出方法（冷浸法、熱浸法）和溶劑種類（水、乙醇）進(jìn)行考察，以水、乙醇為溶劑時(shí)，所得成分存在差異［16-17］。參考文獻(xiàn)［18-19］，醇溶浸出物中降二萜內(nèi)酯類、黃酮類化合物和揮發(fā)油含量豐富。此外，由于產(chǎn)地、采收季節(jié)和樹齡的差異，不同產(chǎn)地羅漢松種子的浸出物含量也存在一定差異。結(jié)合2020年版《中國(guó)藥典（一部）》，同時(shí)以7個(gè)產(chǎn)地測(cè)試結(jié)果最低量擬訂標(biāo)準(zhǔn)，擬訂冷、熱水溶性浸出物分別不低于1.4%和7.0%，冷、熱醇溶性浸出物分別不低于0.2%和0.9%。

3.3 總黃酮含量測(cè)定

植物總黃酮因具有廣泛的藥理作用，常作為藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)。前期研究發(fā)現(xiàn)，羅漢松種子中黃酮含量較豐富，且極有可能是羅漢松實(shí)藥材治療心胃痛的主要成分［19］。故選擇羅漢松種子總黃酮作為藥材定量控制指標(biāo)。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地羅漢松種子總黃酮含量差異較大。江西產(chǎn)羅漢松種子總黃酮含量達(dá)964.17 mg/g，而四川產(chǎn)僅175.99 mg/g。初步推測(cè)，不同產(chǎn)地總黃酮含量的差異與采集地的氣候、日照平均度、地理等外部條件有關(guān)?？紤]到總黃酮含量太低可能對(duì)其藥效有影響，故擬將羅漢松種子總黃酮含量限量定為不低于300 mg/g。劉欣宇等［12］測(cè)得廣西產(chǎn)羅漢松種子黃酮含量為323.50 mg/g，大于300 mg/g，其差異可能與種子采收時(shí)間及批號(hào)不同等因素有關(guān)。趙凱麗等［20］曾對(duì)廣西羅漢松種子揮發(fā)油化學(xué)組成進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)揮發(fā)油中含大量川芎嗪，川芎嗪可能是羅漢松實(shí)治心胃痛的有效成分。但彭益淳等［14］通過測(cè)定不同產(chǎn)地羅漢松種子揮發(fā)油，均未鑒定川芎嗪。潘翠柳等［16］采用對(duì)廣西產(chǎn)羅漢松莖、葉、果實(shí)部位進(jìn)行掃描鑒別，不同藥用部位在相同位置均有吸收，方法專屬性不強(qiáng)，不建議使用紫外-可見光譜法作為指標(biāo)的定性鑒別，可考慮采用紫外指紋圖譜法代替紫外-可見光譜法定性鑒別藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)。此外，本研究中未對(duì)不同產(chǎn)地羅漢松實(shí)進(jìn)行紫外指紋圖譜分析，后續(xù)研究重點(diǎn)將進(jìn)行羅漢松種子化學(xué)成分研究，明確治心胃痛的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，進(jìn)一步完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

綜上所述，所建立的方法操作簡(jiǎn)便、專屬性好、可行性強(qiáng)，可有效控制羅漢松實(shí)藥材的質(zhì)量。