基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討白鶴方治療血栓性淺靜脈炎的作用機(jī)制

俞 寧，陳 健，曹燁民，曹永兵

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院脈管病研究所，上海 200082；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院脈管病科，上海 200082）

血栓性淺靜脈炎（superficial thrombophlebitis）是與靜脈血栓形成相關(guān)的淺靜脈炎癥，其特征是淺靜脈內(nèi)血栓，管腔部分受累或閉塞，靜脈沿途有炎癥反應(yīng)[1]。既往臨床認(rèn)為[2，3]，該病是一種良性、自限性下肢疾病，可影響全身大部分靜脈系統(tǒng)，與深靜脈血栓形成（DVT）或肺栓塞（PE）密切相關(guān)，是DVT 和PE 的重要危險(xiǎn)因素。研究表明[3]，血栓擴(kuò)散到深靜脈的比例為6%～44%，PE 的發(fā)生率為1.5%～33%。血栓性淺靜脈炎的發(fā)病率尚不明確，但被認(rèn)為高于深靜脈血栓形成的發(fā)病率，且據(jù)估計(jì)[4]，深靜脈血栓的發(fā)病率約為1/1000。白鶴方由上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院國家級名老中醫(yī)奚九一教授創(chuàng)立，可用于治療血管炎、膽囊炎、胃炎等疾病。藥理學(xué)研究表明[5]，白鶴方通過抑制ICAM-1 表達(dá)和嗜中性粒細(xì)胞CD18 的表達(dá)，從而抑制嗜中性粒細(xì)胞與HUVEC 的粘附，發(fā)揮抗炎治療的作用。隨著大數(shù)據(jù)時(shí)代的到來和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的發(fā)展，運(yùn)用藥理學(xué)、生物信息學(xué)等多門學(xué)科與系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)分析相結(jié)合，深度挖掘和整合這些多種草藥組成的中醫(yī)復(fù)方，闡明不同的組分之間復(fù)雜的相互作用，從多組分、多靶點(diǎn)的揭示藥物治療機(jī)制，可以為中醫(yī)藥現(xiàn)代化和新藥研發(fā)提供思路[6]?；诖?，本研究主要基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討白鶴方治療血栓性淺靜脈炎的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 白鶴方和血栓性淺靜脈炎潛在靶點(diǎn)檢索 首先將白鶴方中的13 味中藥：白芍、半枝蓮、柴胡、陳皮、黨參、地耳草、甘草、虎杖、蒲公英、拳參、蜀羊泉、藤梨根、仙鶴草依次輸入中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）[7]、中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫ETCM（http://www.tcmip.cn/ETCM/）[8]、中醫(yī)藥生物信息分析平臺(tái)SymMap（http://www.symmap.org/）[9]、中醫(yī)藥分子機(jī)制生物信息學(xué)分析工具BATMAN-TCM（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）[10]和相關(guān)文獻(xiàn)收集方劑中各單味藥的主要化學(xué)成分，根據(jù)中藥功效將其分為4 類。通過SWISSADME[11]網(wǎng)站對每種成分進(jìn)行ADME 分析[12]，以胃腸道吸收和生物利用度為指標(biāo)篩選潛在活性成分。通過SwissTargetPrediction（http://swisstargetprediction.ch/）[13]預(yù)測白鶴方有效成分的主要靶標(biāo)，同時(shí)符合degree 2 倍中位數(shù)以上、BC 中位數(shù)以上、CC 中位數(shù)以上的靶點(diǎn)作為白鶴方治療血栓性淺靜脈炎的關(guān)鍵活性成分。通過在GeneCards（https://www.genecards.org/）[14]、DisGeNET（https://www.disgenet.org/home/）[15]、OMIM（https://www.omim.org/）[16]、Drug－Bank（https://www.drugbank.com/）[17]數(shù)據(jù)庫中搜索“superficial thrombophlebitis”，即可獲得預(yù)測出的血栓性淺靜脈炎有關(guān)的靶點(diǎn)。

1.2 藥物-疾病靶點(diǎn)篩選 通過預(yù)測獲得白鶴方潛在靶點(diǎn)和血栓性淺靜脈炎靶點(diǎn)，將兩組數(shù)據(jù)分別輸入到韋恩圖繪制工具（http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/index.html）軟件中，得到白鶴方和血栓性淺靜脈炎的映射的共同靶標(biāo)，即為藥物-疾病靶點(diǎn)。

1.3 藥物-疾病靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將上述篩選出的白鶴方和血栓性淺靜脈炎的共同作用靶點(diǎn)利用STRING（https://string-db.org/）[18]，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。使用Cytoscape 軟件中的cytoHubba 插件按照拓?fù)鋵W(xué)規(guī)則計(jì)算關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，按照節(jié)點(diǎn)度Degree 排序得出PPI 網(wǎng)絡(luò)中排名前10 的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。

1.4 GO 和KEGG 通路富集分析 使用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫[19]對上述得出的白鶴方和血栓性淺靜脈炎的靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析。富集分析篩選P＜0.05 的條目，并在Cytoscape 3.8.2 軟件[20]中構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，找到白鶴方治療血栓性淺靜脈炎的主要潛在生物學(xué)過程及作用信號通路。

1.5 核心靶點(diǎn)的分子對接模擬驗(yàn)證 結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[21]，選擇核心靶點(diǎn)中drgree 程度前10 的靶點(diǎn)蛋白，使用利用Autodock_vina 軟件用于分子對接，從RCSBPDB 數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/）獲取這些靶點(diǎn)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)文件，從Pubchem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取這些小分子3D 結(jié)構(gòu)文件，計(jì)算靶點(diǎn)蛋白與活性成分間的最低結(jié)合能并將分子對接模擬驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 白鶴方的有效成分篩選和靶標(biāo)預(yù)測 在TCMSP、ETCM、SymMap 等數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)檢索的方式對白鶴方的主要有效成分及相應(yīng)的關(guān)鍵指標(biāo)進(jìn)行查詢，共發(fā)現(xiàn)811 個(gè)成分，并通過SWISSADME 網(wǎng)站對所有成分的藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行篩選后，得到706 個(gè)有效成分。將這些成分輸入Swiss target prediction 網(wǎng)站搜索潛在靶標(biāo)，剔除重復(fù)項(xiàng)后，篩選出對應(yīng)213 個(gè)靶標(biāo)。其中，補(bǔ)氣養(yǎng)血藥中發(fā)現(xiàn)了89 種成分和262 個(gè)靶點(diǎn)，清熱解毒藥有110 種成分和645 個(gè)靶點(diǎn)，其它藥材中有62 種成分和277 個(gè)靶點(diǎn)。不同組中草藥的成分和預(yù)測目標(biāo)的數(shù)量見表1。

表1 白鶴方不同組別藥材的成分?jǐn)?shù)量和預(yù)測靶標(biāo)

2.2 血栓性淺靜脈炎疾病靶點(diǎn)篩選結(jié)果 通過檢索GeneCards、OMIM、DrugBank、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫，檢出與血栓性淺靜脈炎相關(guān)的靶點(diǎn),刪除檢索結(jié)果中重復(fù)靶點(diǎn)后共納入257 個(gè)相關(guān)的靶點(diǎn)，見圖1。

圖1 不同疾病數(shù)據(jù)庫疾病靶點(diǎn)的映射

2.3 核心靶點(diǎn)篩選及PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 在ImageGP在線軟件測繪工具平臺(tái)上輸入213 個(gè)白鶴方有效成分作用靶點(diǎn)和257 個(gè)血栓性淺靜脈炎疾病靶點(diǎn)，二者映射以繪制韋恩圖，即白鶴方治療血栓性淺靜脈炎的交集靶點(diǎn)，見圖2。剔除重復(fù)后，得到白鶴方治療血栓性淺靜脈炎的交集靶點(diǎn)20 個(gè)。通過STRING對20 個(gè)共同靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，最低交互分?jǐn)?shù)為0.4，產(chǎn)生了20 個(gè)靶點(diǎn)和62 條邊，平均節(jié)點(diǎn)度（average node degree）為6.2，平均聚類系數(shù)為0.636，PPI 網(wǎng)絡(luò)富集的P＜2.22e-16，見圖3。對構(gòu)建出的互作網(wǎng)絡(luò)使用Cytoscape 軟件中的cyto－Hubba 進(jìn)行分析，按節(jié)點(diǎn)度degree 進(jìn)行排序發(fā)現(xiàn)排名前10 個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)為TNF、AKT、MP、IL、MMP9、F、MMP、MMP3、F2、MMP1，見圖4。

圖2 白鶴方有效活性成分與血栓性淺靜脈炎靶點(diǎn)的韋恩圖

圖3 白鶴方-血栓性淺靜脈炎共同靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖4 PPI 網(wǎng)絡(luò)中前10 個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)

2.4 白鶴方對血栓性淺靜脈炎的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析 采用Cytoscape3.8.2 軟件將白鶴方的13 味中藥、306個(gè)有效活性成分及213 個(gè)潛在標(biāo)點(diǎn)和血栓性淺靜脈炎-白鶴方20 個(gè)共同靶標(biāo)進(jìn)行分析，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)渲礵egree、BC、CC 確定白鶴方治療血栓性淺靜脈炎關(guān)鍵活性成分，degree 中位數(shù)2 倍值為14，BC 中位數(shù)為0.051 614 322，CC 中位數(shù)為0.305 250 905，同時(shí)符合degree 2 倍中位數(shù)以上、BC 中位數(shù)以上、CC中位數(shù)以上的靶點(diǎn)作為白鶴方治療血栓性淺靜脈炎的關(guān)鍵活性成分（圖5）。共有15 種活性成分滿足上述要求，分別為槲皮素、山柰酚、芹黃素、葉黃素、原兒茶酸、柚木素、肉豆蔻酸、硬脂酸、反式白藜蘆醇、反式香豆酸、咖啡酸、黃芩素、沒食子酸、咖啡因、油酸，見表2。

表2 白鶴方治療血栓性淺靜脈炎的關(guān)鍵活性成分及其拓樸學(xué)參數(shù)

圖5 “核心成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 潛在作用靶點(diǎn)的GO 富集分析 利用DAVID6.8對20 個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能富集分析，篩選統(tǒng)計(jì)的P＜0.05 的生物過程，共得到GO 條目92 個(gè)，其中生物過程（BP）條目61 個(gè)、分子功能（MF）條目21個(gè)、細(xì)胞組成（CC）條目9 個(gè)。GO 功能富集分析顯示，BP 主要涉及膠原蛋白分解過程、細(xì)胞外基質(zhì)分解、白細(xì)胞遷移、蛋白分解、蛋白質(zhì)代謝過程等過程；MF 主要涉及同質(zhì)蛋白結(jié)合、鋅離子結(jié)合、鈣離子結(jié)、金屬肽酶活等分子功能；CC 主要涉及質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)、蛋白質(zhì)類細(xì)胞外基、胞外區(qū)、胞外空間等細(xì)胞組分相關(guān)，見圖6。

圖6 GO 富集潛在靶點(diǎn)條形圖

2.6 KEGG 通路富集分析 利用DAVID6.8 對20 個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路功能富集分析，共得到KEGG 條目72 個(gè)，見圖7。其中，包括腫瘤壞死因子信號通路、雌激素信號通路、T 細(xì)胞受體信號通路、MTOR 信號通路、Fc epsilon RI 信號通路、Toll 樣受體信號通路、鞘脂信號通路等信號通路，見圖8。

圖7 KEGG 通路分析

圖8 KEGG 氣泡圖

2.7 分子對接模擬驗(yàn)證 根據(jù)藥物-成分-靶點(diǎn)構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，根據(jù)degree 程度選擇了前10 個(gè)核心靶 點(diǎn)：TNF、AKT1、MPO、IL2、MMP9、F2、MMP2、MMP3、F3、MMP1，在PDB 數(shù)據(jù)庫中檢索經(jīng)典靶點(diǎn)受體蛋白信息。利用Autodock_vina 軟件計(jì)算這10個(gè)靶點(diǎn)蛋白與預(yù)測出上述靶點(diǎn)的活性成分間的最低結(jié)合能，結(jié)果顯示活性成分分子與靶點(diǎn)受體蛋白周圍分子通過氫鍵等分子間作用力形成較為穩(wěn)定的構(gòu)象；白鶴方中的大多數(shù)成分都能很好地與靶基因結(jié)合，其中芹黃素、山奈酚和槲皮素的結(jié)合性能最好；TNF、MMP3、F2、F3、MPO、MMP9 基因可以與大多數(shù)活性成分很好地對接，見表3。

表3 白鶴方的關(guān)鍵成分與目的靶標(biāo)的結(jié)合能

3 討論

本研究為了探討白鶴方治療血栓性淺靜脈炎的作用機(jī)制，通過網(wǎng)站篩選發(fā)現(xiàn)白鶴方中706 個(gè)潛在活性成分和213 個(gè)靶點(diǎn)。同時(shí)，使用多個(gè)數(shù)據(jù)庫篩選了257 個(gè)疾病目標(biāo)。通過韋恩圖映射，共發(fā)現(xiàn)20個(gè)共同目標(biāo)。PPI 網(wǎng)絡(luò)和GO 富集分析表明這些共同的靶基因之間存在多重互作。GO 功能從分子功能、生物過程和細(xì)胞成分3 大類分析所有靶基因的功能，最后從抗炎免疫、減少炎癥損傷和抑制新生血管的形成兩方面分析了各通路的信息。

研究發(fā)現(xiàn)，白鶴方中多種潛在活性成分均表現(xiàn)出良好的抗炎活性，如山奈酚、槲皮素、芹黃素、硬脂酸等。已有研究報(bào)道[22-24]，槲皮素一種具有多種生物活性的黃酮醇類化合物，可降低TNF-α 的表達(dá)水平，對損傷血管有保護(hù)作用，對IL-6、IL-2、NF-κB、TNF-α 等均有較好的抑制作用，且還可以通過抑制血管生長發(fā)揮抗腫瘤作用。山奈酚是一種天然黃酮醇，可以抑制NF-κB 和MAP 激酶的磷酸化，減少IL-1β、IL-6 和TNF-α 的水平，具有顯著的抗炎效果[25-27]。硬脂酸是硬脂酰輔酶A 去飽和酶的主要底物，可與TNF-α 通過TLR4/TBK/IRF3 信號通路促進(jìn)單核細(xì)胞中巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1α 的產(chǎn)生[28]。芹黃素可以顯著抑制MAPK 的激活，減少TNF-α、IL-6 和NF-κB 的表達(dá)和細(xì)胞凋亡，從而抑制炎癥[29]。同時(shí)，芹菜素對HIF-1α 的表達(dá)及其下游的VEGF-A/VEGFR2 和PDGF-BB/PDGFβR 信號通路有強(qiáng)烈的抑制作用，對新生血管有明顯的抑制作用[30]。因此，本研究認(rèn)為白鶴方中的這些關(guān)鍵成分可能通過抗炎免疫和抑制血管生成來治療血栓性淺靜脈炎。

此外，本研究中KEGG 通路富集結(jié)果發(fā)現(xiàn)大量的抗炎免疫通路，其中TNF 信號通路是最重要的途徑，共涉及6 個(gè)調(diào)控基因：PIK3CA、MMP3、AKT1、PIK3R1、TNF、MMP9。研究報(bào)道，TNF-α 是一種促炎細(xì)胞因子，可促進(jìn)炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的表達(dá)，包括IL-6、IL-1β 和ICAM[31]，還可通過調(diào)節(jié)NF-κB 信號通路和產(chǎn)生多種炎癥反應(yīng)來調(diào)節(jié)MMPs 的表達(dá)[32]。分子對接是一種模擬小配體分子與受體蛋白大分子相互作用的技術(shù)，可以計(jì)算兩個(gè)對應(yīng)物之間的結(jié)合能來預(yù)測它們的親和力。結(jié)合能小于0 表示兩個(gè)分子自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能越小，構(gòu)象越穩(wěn)定[6]。本研究中分子對接實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，山奈酚、槲皮素、芹黃素、硬脂酸與關(guān)鍵靶蛋白MPO、MMP3、F2、MMP9 等具有較好的結(jié)合力。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對接驗(yàn)證，有效地闡明了抗炎免疫和抑制血管生成是白鶴方減輕血栓性淺靜脈炎的核心分子機(jī)制，仙鶴草中的山奈酚、白芍中的硬脂酸等是重要的活性成分，其通過TNF 信號通路、Toll 樣受體信號通路、T 細(xì)胞受體信號通路共同作用于MMP9、MMP12、PIK3R1、ALOX5、AKT1 等多個(gè)靶點(diǎn)，發(fā)揮抗炎免疫通路作用；黨參中的槲皮素、藤梨根中的芹黃素等可抑制新生血管生成，減少血栓形成，主要作用于F2、TTR、AKT1、MMP2 等下游靶標(biāo)，具有調(diào)控血管生成的作用。