乏氧光學(xué)影像探針的設(shè)計(jì)與應(yīng)用

李 成，周森森，蔣錫群

（南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院高分子科學(xué)與工程系,江蘇省納米技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023）

氧氣在生命活動(dòng)中具有重要意義，為需氧生物提供了重要的能量來(lái)源.哺乳動(dòng)物具有氧感應(yīng)機(jī)制，可通過(guò)增加呼吸、血流和生存反應(yīng)來(lái)幫助他們快速適應(yīng)氧含量變化.氧氣供應(yīng)不足、組織中氧含量低是乏氧的典型特征.乏氧會(huì)導(dǎo)致好氧生物的細(xì)胞功能障礙，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡［1，2］.乏氧往往與炎癥、腦卒中、心肌梗塞、組織創(chuàng)傷和腫瘤密切相關(guān).組織氧濃度是評(píng)估機(jī)體健康的重要依據(jù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)組織氧濃度的準(zhǔn)確檢測(cè)有助于多種疾病的診斷、預(yù)防和監(jiān)測(cè).

生物醫(yī)學(xué)傳感器可以在病理?xiàng)l件下檢測(cè)活體內(nèi)化學(xué)、物理和生物學(xué)信息的變化.乏氧作為一種生物學(xué)標(biāo)志物，也可以被特殊的生物傳感器檢測(cè)到.傳統(tǒng)的乏氧檢測(cè)需要在病灶部位有創(chuàng)地插入電極進(jìn)行檢測(cè)，雖然這種方法可以直接測(cè)量局部氧濃度，但病灶部位的異質(zhì)性、電極的靈敏度以及電極插入的創(chuàng)傷性限制了這種方法的廣泛使用［3，4］.其它的乏氧成像方法如核磁共振成像在臨床乏氧檢測(cè)上顯示了應(yīng)用潛力，但檢測(cè)方法的特異性和靈敏性仍然面臨較大的限制，且患者要暴露于電離輻射中［5］.因此，無(wú)創(chuàng)、低成本、高特異性、實(shí)時(shí)檢測(cè)和可視化等乏氧檢測(cè)需求推動(dòng)了無(wú)創(chuàng)光學(xué)乏氧成像的發(fā)展.

光學(xué)成像在空間分辨率、靈敏性和成本方面的巨大優(yōu)勢(shì)使其成為炎癥、癌癥、腦部疾病和手術(shù)導(dǎo)航的重要影像診斷工具［6］.分子染料被廣泛用作光學(xué)成像的探針或造影劑，目前已有4種光學(xué)探針被批準(zhǔn)進(jìn)入臨床，另有數(shù)十種光學(xué)成像探針正在進(jìn)行不同階段的臨床試驗(yàn)［7］.乏氧作為一種疾病特異性的生物標(biāo)志物，近年來(lái)受到了廣泛的關(guān)注，乏氧光學(xué)探針及其光學(xué)成像在腫瘤的早期診斷［8］、炎癥的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)［9］、組織再生響應(yīng)［10］和手術(shù)導(dǎo)航［7］等方面展現(xiàn)了突出的應(yīng)用潛力和廣泛的應(yīng)用前景.

關(guān)于乏氧探針的相關(guān)綜述已有報(bào)道［11，12］，但都主要介紹乏氧熒光探針的設(shè)計(jì)及其在腫瘤診療中的應(yīng)用.本文介紹了數(shù)種乏氧響應(yīng)的光學(xué)探針，包括乏氧熒光探針、乏氧磷光探針和多重響應(yīng)的乏氧磷光探針，并探討了乏氧熒光探針和乏氧磷光探針的優(yōu)缺點(diǎn)，分別展示了不同乏氧光學(xué)探針在腫瘤檢測(cè)、炎癥監(jiān)測(cè)、傷口氧含量監(jiān)測(cè)、疾病治療監(jiān)測(cè)和食品包裝檢測(cè)等方面的應(yīng)用，最后探討了乏氧光學(xué)成像的應(yīng)用前景.

1 乏氧光學(xué)探針

1.1 乏氧熒光探針

熒光探針通常具有極高的靈敏度和分辨率，可以顯示多個(gè)組織和亞細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)，同時(shí)其也可以實(shí)現(xiàn)刺激響應(yīng)性激活，并提高在特定區(qū)域的信噪比［13，14］.乏氧微環(huán)境下較低的氧濃度可引發(fā)黃素腺嘌呤二核苷酸（FADH2）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）等多種還原性物質(zhì)的積累.這些物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致組織的氧濃度降低，從而產(chǎn)生過(guò)量的活性氧（ROS）.因此，乏氧微環(huán)境具有增強(qiáng)的氧化還原水平.通常，乏氧的程度與還原性物質(zhì)（如硝基還原酶和偶氮還原酶）的局部濃度密切相關(guān)［15，16］.在對(duì)乏氧組織進(jìn)行成像時(shí)，可利用硝基芳烴、醌基或偶氮苯衍生物在乏氧微環(huán)境中響應(yīng)斷裂或還原的特性來(lái)設(shè)計(jì)乏氧響應(yīng)的熒光探針［圖1（A）］.

Fig.1 Design of the fluorescence probes under hypoxia condition

1.1.1 基于硝基的乏氧熒光探針 硝基還原酶是可催化硝基化合物還原的一類酶的總稱.這些酶是以尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或尼克酰胺二核苷酸（NADPH/NADH）為氫供體的黃素蛋白，硝基還原酶在硝基化合物介導(dǎo)的細(xì)胞毒性中發(fā)揮著重要作用［17］.在乏氧條件下，包括硝基還原酶在內(nèi)的多種還原酶被細(xì)胞過(guò)量表達(dá)以應(yīng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激［18］.因此，硝基可作為乏氧響應(yīng)的激活基團(tuán)用于構(gòu)建乏氧光學(xué)探針.

基于該原理，Okuda等［19］設(shè)計(jì)了一種近紅外熒光探針GPU-167，該探針由作為熒光基團(tuán)的花菁和乏氧響應(yīng)基團(tuán)的2個(gè)硝基咪唑組成.該探針在乏氧條件下的熒光強(qiáng)度顯著強(qiáng)于常氧情況，但是由于熒光基團(tuán)未被猝滅（非激活型），該探針的信噪比不高.為了探究硝基的化學(xué)位置對(duì)乏氧光學(xué)探針信噪比的影響，Li等［20］設(shè)計(jì)了5種具有不同硝基芳香基團(tuán)結(jié)構(gòu)的近紅外熒光花菁染料，研究表明熒光基團(tuán)和硝基的連接位置對(duì)硝基還原酶的催化活性具有重要影響，只有一個(gè)對(duì)硝基苯甲酸酯修飾的花菁探針（Cy7-1）可作為快速監(jiān)測(cè)乏氧的近紅外（NIR）光學(xué)探針，并具有較高的信噪比［圖1（B）］.

尼羅藍(lán)（NB）是一種具有NIR發(fā)射的水溶性噁嗪染料.Su等［21］將對(duì)硝基芐基作為硝基還原酶的識(shí)別部分引入到尼羅藍(lán)的熒光團(tuán)中（NB-NO2），通過(guò)分子內(nèi)光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移過(guò)程猝滅尼羅藍(lán)的熒光.在乏氧條件下，NB-NO2中的硝基在NADH存在下被硝基還原酶還原為氨基并釋放出游離熒光團(tuán)NB，該探針的熒光強(qiáng)度隨著硝基還原酶的濃度和還原時(shí)間的增加而增強(qiáng)，并可對(duì)不同乏氧條件下細(xì)胞中硝基還原酶的表達(dá)進(jìn)行成像.

Shen等［22］將現(xiàn)有的半花青染料（Cy）中共軛結(jié)構(gòu)的氧元素轉(zhuǎn)換成硫元素，制備了一種近紅外熒光和光聲信號(hào)（PA）同時(shí)存在的雙比率型探針AS-Cy，再將硝基還原酶響應(yīng)的4-硝基苯與AS-Cy偶聯(lián)，獲得可對(duì)乏氧組織硝基還原酶響應(yīng)的NIR/PA雙比率型乏氧探針.由于NIRF/PA成像的互補(bǔ)優(yōu)勢(shì)和該雙比率型探針的優(yōu)良性能，AS-Cy-NO2可以在乏氧組織有效地同時(shí)激活NIR熒光信號(hào)和PA信號(hào)，從而定量觀察體內(nèi)乏氧水平.

1.1.2 基于醌基的乏氧熒光探針 醌基作為一種電子供體可以有效猝滅各種熒光分子的發(fā)射，而在乏氧條件下，醌可以轉(zhuǎn)化為氫醌.氫醌作為電子受體并不能猝滅連接的熒光分子，因此醌基可以用來(lái)作為乏氧響應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)［23］.

Tanabe等［24］基于該原理設(shè)計(jì)合成了一種由醌基和香豆素組成的乏氧響應(yīng)熒光探針I(yè)Q-Cou.吲哚醌可以通過(guò)分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移猝滅機(jī)理和內(nèi)濾效應(yīng)抑制連接的香豆素的熒光，而在乏氧條件下，IQ-Cou通過(guò)單電子還原的方式釋放香豆素?zé)晒饣鶊F(tuán)，產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光，這種單電子還原的過(guò)程可以被分子氧有效地抑制［圖1（C）］.然而，IQ-Cou在水中的低溶解度和相對(duì)較短的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)限制了其在細(xì)胞成像中的進(jìn)一步應(yīng)用.為了使探針適用于細(xì)胞成像，他們通過(guò)將親水性的熒光基團(tuán)Rhodol與吲哚醌結(jié)合來(lái)構(gòu)建親水性探針，在乏氧響應(yīng)性吲哚醌的作用下，探針的熒光發(fā)射在常氧/乏氧條件下表現(xiàn)出良好的開/關(guān)切換特性［25］.

1.1.3 基于偶氮的乏氧熒光探針 偶氮還原酶家族是另外一種在乏氧細(xì)胞中高表達(dá)的還原酶家族，偶氮還原酶的催化反應(yīng)涉及NADPH（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate）作為電子供體并通過(guò)逐步電子轉(zhuǎn)移將偶氮芳香烴還原為苯胺衍生物的可逆反應(yīng)［26］.但在乏氧條件下，該可逆反應(yīng)難以逆轉(zhuǎn)，因此偶氮基團(tuán)也可以用來(lái)設(shè)計(jì)乏氧響應(yīng)的光學(xué)探針［27］.

Huang等［28］將含氨基的半花菁染料（NR-NH2）與N，N-雙（2-氯乙基）-對(duì)苯二胺（HMX1）通過(guò)偶氮鍵（azo）偶聯(lián)，設(shè)計(jì)了一種可乏氧激活的近紅外探針NR-azo.偶聯(lián)有HMX1的花菁染料在激光照射下沒(méi)有熒光發(fā)射信號(hào)，但是在乏氧條件下，偶氮鍵斷裂釋放出游離的花菁染料產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光，進(jìn)而可以對(duì)乏氧組織進(jìn)行特異性成像［圖1（D）］.Liu等［29］利用超分子自組裝的方法，通過(guò)硫酸根-β-環(huán)糊精（SCD）和偶氮苯衍生物的靜電相互作用構(gòu)建了一種乏氧響應(yīng)納米材料，接著將熒光染料羅丹明123負(fù)載在納米顆粒中，由于硫酸根對(duì)羅丹明123的猝滅作用，可以實(shí)現(xiàn)該材料在乏氧條件下的熒光增強(qiáng).He等［30］報(bào)道了一種基于原位概念的乏氧響應(yīng)熒光探針，該探針由含氨基甲酸酯鍵的水溶性偶氮苯共聚物和陰離子水溶性聚集誘導(dǎo)發(fā)射熒光四苯基乙烯（TPE）組成.通過(guò)偶氮鍵的還原和低氧條件下的1，6-自消除級(jí)聯(lián)反應(yīng)，水溶性共聚物可以轉(zhuǎn)化為質(zhì)子化的含伯胺聚合物.根據(jù)聚集誘導(dǎo)的特性，陰離子TPE從分子分散狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榕c陽(yáng)離子聚合物自組裝誘導(dǎo)的聚集狀態(tài)，從而使熒光明顯增強(qiáng).

長(zhǎng)期跟蹤體內(nèi)循環(huán)乏氧需要具有極低光細(xì)胞毒性的可逆近紅外發(fā)光探針.迄今，幾乎所有報(bào)道的有機(jī)熒光乏氧探針都是不可逆的，因此，Guo等［31］通過(guò)偶氮鍵將3，5-二三氟甲基苯與NIR發(fā)射的呫噸/花菁融合熒光團(tuán)（HD）偶聯(lián)，構(gòu)建了一種對(duì)乏氧響應(yīng)的可逆開啟NIR熒光的探針（HDSF）.該可逆的熒光行為歸因于吸電子三氟甲基對(duì)芳基偶氮還原中間體苯肼的穩(wěn)定作用，從而阻止了隨后的N—N鍵還原斷裂.除了可以細(xì)胞內(nèi)循環(huán)乏氧成像外，HDSF還能夠通過(guò)共聚焦成像監(jiān)測(cè)斑馬魚胚胎中藥物誘導(dǎo)的缺氧-復(fù)氧循環(huán).

基于偶氮、醌基和硝基等化學(xué)鍵設(shè)計(jì)的多種熒光成像機(jī)制均可用于乏氧光學(xué)探針的設(shè)計(jì).這些探針可以以高分辨率對(duì)氧濃度進(jìn)行實(shí)時(shí)成像.然而，乏氧熒光探針的設(shè)計(jì)依賴于間接生物標(biāo)志物（如偶氮還原酶及硝基還原酶等）對(duì)其激活，而在乏氧組織中，各種酶的含量及空間分布并不均一，這將對(duì)這類探針的成像產(chǎn)生影響.

1.2 乏氧磷光探針

與大多數(shù)熒光探針不同，磷光探針由于與分子氧獨(dú)特的聯(lián)系，可以用于直接檢測(cè)組織氧含量.在光激發(fā)下，激發(fā)的電子經(jīng)歷系間竄越到達(dá)激發(fā)的三重態(tài).隨著自旋禁阻躍遷的出現(xiàn)，電子返回其單重基態(tài)并發(fā)射光子，從而產(chǎn)生磷光.由于禁阻躍遷，磷光探針通常具有更長(zhǎng)的衰變壽命.然而，在分子氧存在的情況下，會(huì)使探針的磷光發(fā)射發(fā)生猝滅，衰變壽命變短.因此，磷光發(fā)射強(qiáng)度與局部氧濃度成正比.利用Stern-Volmer進(jìn)行校準(zhǔn)，可以將磷光強(qiáng)度轉(zhuǎn)換成氧分壓（pO2）［12］.

1.2.1 基于磷光強(qiáng)度的金屬配合物乏氧探針 基于磷光在常氧條件下猝滅并在乏氧環(huán)境下被激活的原理，磷光的強(qiáng)度可直接用于對(duì)乏氧進(jìn)行檢測(cè).金屬配合物如Ir（Ⅲ）配合物、Ru（Ⅱ）配合物和金屬卟啉類配合物是幾種常見的乏氧響應(yīng)的磷光探針.

最初的磷光探針是基于簡(jiǎn)單的Pd卟啉設(shè)計(jì)的，但是其需要與大分子載體（白蛋白）預(yù)結(jié)合，以增強(qiáng)其水溶性并將其猝滅條件置于與生理氧濃度兼容的范圍內(nèi)［32］.為了進(jìn)一步提高金屬卟啉的水溶性，Vinogradov等［33］設(shè)計(jì)合成了兩種樹枝狀大分子偶聯(lián)的Pd卟啉G4和R4，新的探針在水中具有較高的溶解度.探針在生理?xiàng)l件下和一定溫度（22～38℃）范圍內(nèi)顯示出較高的穩(wěn)定性和信號(hào)可重復(fù)性，并且成功應(yīng)用于腫瘤血管內(nèi)和間質(zhì)的氧含量監(jiān)測(cè).

Ru（Ⅱ）配合物通常具有較強(qiáng)的熒光和較大的斯托克斯位移，但這些有機(jī)金屬配合物進(jìn)入細(xì)胞的能力較差且細(xì)胞毒性高［34］.為了解決這一問(wèn)題，Tanabe等［35］將金屬Ru（Ⅱ）配合物偶聯(lián)在二氧化硅納米粒子（MSN-Ru）上以降低Ru（Ⅱ）配合物的細(xì)胞毒性.由于納米材料的特性，與分子Ru（Ⅱ）配合物相比，MSN-Ru顯著降低了探針的光毒性，同時(shí)保持了對(duì)氧依賴的磷光強(qiáng)度，可用于組織乏氧成像.

為了進(jìn)一步提高乏氧磷光探針的分辨率和靈敏度，本課題組［8］提出了一種兩步放大腫瘤微環(huán)境信號(hào)的新概念和新技術(shù)，合成了能夠?qū)δ[瘤微環(huán)境中酸化和乏氧連續(xù)響應(yīng)的新型大分子磷光探針，該新型成像探針可同時(shí)測(cè)量pH和pO2兩個(gè)參數(shù)［圖2（A）］.與傳統(tǒng)單一響應(yīng)的探針相比，該探針顯著提高了腫瘤檢測(cè)的特異性、靈敏度和成像信噪比，充分壓制了目標(biāo)的背景信號(hào).在該探針中，Ir（Ⅲ）復(fù)合物和聚乙二醇（PEG）鏈通過(guò)酸敏感亞胺鍵連接，亞胺鍵在酸性條件下水解，使探針的發(fā)射峰從610 nm偏移到705 nm.被酸激活的探針在乏氧的環(huán)境下發(fā)射信號(hào)被進(jìn)一步放大，其磷光強(qiáng)度與組織氧含量成反比.

Wong等［36］報(bào)道了具有J聚集誘導(dǎo)的NIR-II磷光的5，15-雙（2，6-雙（十二烷氧基）苯基）-卟啉鉑（II）（PpyPt）.并將其制備成水溶性納米顆粒（PpyPt NPs），該納米顆粒具有微秒級(jí)的NIR-II磷光壽命和良好的水中氧敏感性，同時(shí)具有近紅外二區(qū)的發(fā)射光.

1.2.2 有機(jī)磷光乏氧探針 近年來(lái)，有機(jī)室溫磷光探針受到越來(lái)越多人的關(guān)注.有機(jī)分子由于自旋的多重性，可以從單重激發(fā)態(tài)發(fā)出熒光或從三重激發(fā)態(tài)發(fā)出磷光［37］.有機(jī)室溫磷光材料（RTP）具有成本低、易于制備、可裁剪性和加工性好等優(yōu)點(diǎn)，這些都利于開發(fā)大面積、柔性、高分辨率顯示器和功能性光學(xué)器件［38］.很多研究報(bào)道了環(huán)境敏感型有機(jī)室溫磷光材料系統(tǒng)，能感知氧氣、水分、pH值、溫度、機(jī)械力和光激發(fā).與壽命短的熒光材料相比，壽命在微秒到毫秒甚至到秒之間的有機(jī)室溫磷光材料是生物成像的良好候選材料.長(zhǎng)壽命的有機(jī)室溫磷光材料可以降低生物自身熒光和背景干擾的影響［39］.此外，有機(jī)磷光材料不含有毒重金屬，具有優(yōu)良的生物相容性及更大的臨床應(yīng)用潛力.然而，室溫磷光光團(tuán)通常在晶體中表現(xiàn)出有效的磷光，但在非晶態(tài)聚集體中只有微弱的發(fā)射；而且它們較大的初始晶體尺寸不利于生物應(yīng)用［40，41］.同時(shí)，一些有機(jī)磷光系統(tǒng)不能與氧氣充分接觸，造成其氧不敏感［42］，這些都限制了有機(jī)磷光材料在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用.為了解決這一限制，科學(xué)家們發(fā)展了多種策略，實(shí)現(xiàn)了有機(jī)磷光材料在乏氧生物成像領(lǐng)域的突破.Zhang等［43］報(bào)道了一種由碘化物取代的二氟硼二苯甲酰甲烷聚乳酸［BF2dbm（I）PLA］固態(tài)探針，該探針是一種單組分、雙發(fā)射的熒光/磷光比率型探針［圖2（B）］，在該熒光/磷光發(fā)射體系中，熒光強(qiáng)度與磷光強(qiáng)度之比與氧濃度成反比，這樣一種比率型探針為量化腫瘤乏氧提供了新方法.Villa等［44］報(bào)道了一種聚集誘導(dǎo)磷光的方法，該方法通過(guò)將官能化的過(guò)硫化苯發(fā)色團(tuán)共價(jià)封裝到二氧化硅納米粒子中產(chǎn)生磷光.納米粒子在環(huán)境溫度下顯示出明亮的磷光，并在水中具有高膠體穩(wěn)定性，納米粒子的磷光可以被生理范圍內(nèi)的分子氧很好地猝滅，從而具有在生物體內(nèi)對(duì)氧含量進(jìn)行成像的潛力.He等［45］將純有機(jī)單色團(tuán)共價(jià)偶聯(lián)在二氧化硅納米粒子（SiNPs）中，在水溶液中就能發(fā)出熒光和明亮的磷光，多孔SiNPs中有機(jī)發(fā)色團(tuán)的氧不敏感熒光可以作為參比熒光，氧依賴的磷光作為氧濃度指示劑，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)在活細(xì)胞中基于單發(fā)色團(tuán)的超靈敏比率型乏氧成像.Kim等［46］通過(guò)簡(jiǎn)單的一鍋?zhàn)越M裝法，將氧敏感有機(jī)磷光體Br6A封裝在一個(gè)剛性的、透氧的聚溴苯乙烯中，接著該聚合物被包裹在一層磷脂殼中.制備的雜化NPs具有長(zhǎng)壽命的明亮室溫磷光，且該探針對(duì)氧含量具有高的靈敏度和良好的體外長(zhǎng)期穩(wěn)定性.盡管多種用于生物氧成像的室溫有機(jī)磷光材料已經(jīng)被開發(fā)出來(lái)，但是其發(fā)射波長(zhǎng)較短，在活體組織中的散射較多，穿透深度低，不利于活體組織的氧含量監(jiān)測(cè)，因此，還亟待開發(fā)近紅外或者遠(yuǎn)紅外波段（＞650 nm）的可用于生理環(huán)境的純有機(jī)磷光分子.

Fig.2 Design of the hypoxia phosphorescence probes

1.2.3 基于磷光的比例型乏氧探針 與單發(fā)射的磷光探針相比，比例型氧敏感探針可以通過(guò)計(jì)算信號(hào)峰和參比峰之間的強(qiáng)度比來(lái)實(shí)現(xiàn)氧分壓的定量測(cè)量.該方法避免了探針濃度對(duì)信號(hào)強(qiáng)度的影響，為氧含量的定量監(jiān)測(cè)提供了可靠的方法，以彌補(bǔ)非比率型磷光探針的不足.比率型探針的設(shè)計(jì)需要雙發(fā)射體系，一般由對(duì)氧敏感的磷光信號(hào)和對(duì)氧不敏感的熒光信號(hào)組成，這樣的探針可以通過(guò)組合兩種不同的發(fā)光基團(tuán)或通過(guò)單激發(fā)雙發(fā)射的發(fā)光基團(tuán)來(lái)實(shí)現(xiàn).

Yoshihara等［47］報(bào)道了一種雙組分比率型乏氧探針，其中香豆素C343（氧不敏感的熒光基團(tuán)）與銥配合物（IrBTP）（氧敏感的磷光基團(tuán)）通過(guò)一個(gè)多肽（四個(gè)脯氨酸基團(tuán)）進(jìn)行偶聯(lián).所得探針（C343-Pro4-BTP）可以在405 nm激光激發(fā)下產(chǎn)生藍(lán)色熒光和紅色磷光.該研究表明磷光/熒光的比值與氧分壓之間存在線性關(guān)系.然而，過(guò)渡金屬配合物探針在水溶液中較差的溶解性限制了它們?cè)谏锝M織中的應(yīng)用.為了解決這一問(wèn)題，本課題組［48］開發(fā)了水溶性高分子聚乙烯吡咯烷酮偶聯(lián)的銥配合物（Ir-PVP）乏氧磷光探針，作為內(nèi)標(biāo)分子的近紅外染料NIR797與PVP鏈末端基團(tuán)偶聯(lián)得到氧敏感的比率型探針I(yè)r-PVP-NIR797.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，雖然探針?lè)肿釉诟闻K和腫瘤中都有富集，但是只在腫瘤中顯示出明顯的乏氧信號(hào).Lippert等［49］將哌嗪連接到丙烯酸改性的螺金剛烷1，2-二氧雜環(huán)丁烷上，再將其與Ir（Ⅲ）配合的2-（苯并［b］噻吩-2-基）吡啶偶聯(lián)，構(gòu)建了第一個(gè)用作化學(xué)發(fā)光的近紅外乏氧敏感比率型探針，并在體外和小鼠體內(nèi)驗(yàn)證了該探針的乏氧敏感性.雙組分體系的比率型乏氧探針易受兩種不同染料之間光穩(wěn)定性、光漂白性和組織穿透能力差異的影響，進(jìn)而影響雙發(fā)光基團(tuán)比率型探針的可靠性［50］.為了彌補(bǔ)這一缺陷，單組分雙發(fā)射的小分子探針這一設(shè)想被提出，但如何保持激發(fā)三重態(tài)和單重態(tài)之間的微妙平衡以實(shí)現(xiàn)兩個(gè)激發(fā)態(tài)之間的輻射衰減一直具有挑戰(zhàn)性.Liu等［51］報(bào)道了一種C/N環(huán)金屬化的Pt（Ⅱ）（acac）配合物的單組分雙發(fā)射的小分子探針.該配合物利用芳基噻吩部分來(lái)降低和減弱系間竄越效應(yīng)以實(shí)現(xiàn)雙重發(fā)射.當(dāng)氧分壓降至0.1 bar（1 bar=1×105Pa）時(shí)該探針的磷光壽命提高到3.29μs，而熒光壽命保持不變，證實(shí)了該單組分雙發(fā)射的比率型小分子探針的氧敏感性.

近年來(lái)，非芳香結(jié)構(gòu)的具有熒光發(fā)射功能的聚合物引起了越來(lái)越多的關(guān)注，并且對(duì)這種反?，F(xiàn)象背后的機(jī)理也進(jìn)行了探索.Tang等［52］發(fā)現(xiàn)，羰基的鏈內(nèi)和鏈間n→π*相互作用在低聚馬來(lái)酸酐（OMAhs）的聚集態(tài)發(fā)光過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用.基于該原理，Zhu等［53］設(shè)計(jì)合成了一種由親水骨架聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）（氧不敏感）和鉑（Ⅱ）四苯基卟啉（Pt-TPP）（氧敏感的磷光探針）構(gòu)建的比率型納米磷光探針（Pt-TPP-PVP430）.基于PVP側(cè)基在納米粒子中的聚集發(fā)光效應(yīng)，該納米探針在595 nm激光照射下，在660 nm和760 nm具有雙重發(fā)射.在660 nm處的發(fā)射是由PVP聚合物骨架產(chǎn)生的氧不敏感熒光發(fā)射峰，而760 nm處的發(fā)射峰是由Pt-TPP產(chǎn)生的氧敏感的磷光發(fā)射峰.該比率型納米探針可以在活體細(xì)胞和腫瘤組織中實(shí)現(xiàn)高信噪比的比率型乏氧成像，為單激發(fā)雙發(fā)射比率型磷光探針的設(shè)計(jì)提供了一種新的方法.

乏氧磷光探針為氧濃度的直接檢測(cè)提供了工具，而比率型乏氧磷光探針進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了對(duì)氧濃度的定量檢測(cè).但是現(xiàn)有的乏氧磷光探針在深層組織的成像方面仍然面臨挑戰(zhàn).

2 乏氧探針的應(yīng)用

生命活動(dòng)中氧含量的變化往往與疾病的發(fā)生、發(fā)展聯(lián)系緊密，所以利用乏氧光學(xué)探針實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)組織和生命體中氧含量的變化可以為不同疾病的診療提供準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)且穩(wěn)定的信息.本章總結(jié)了部分乏氧光學(xué)探針的應(yīng)用方向，包括腫瘤檢測(cè)、炎癥監(jiān)測(cè)、皮膚氧含量監(jiān)測(cè)、疾病治療響應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)以及食品質(zhì)量監(jiān)測(cè).

2.1 腫瘤檢測(cè)

乏氧是實(shí)體腫瘤的標(biāo)志之一，對(duì)腫瘤的治療、診斷和預(yù)后具有重要意義［54］.腫瘤乏氧是由于血管系統(tǒng)受損和癌細(xì)胞對(duì)氧的快速消耗導(dǎo)致氧氣輸送不足造成的.根據(jù)其時(shí)空特征，乏氧分為慢性乏氧和急性乏氧.慢性乏氧是由于細(xì)胞密度增加和細(xì)胞與微血管之間的距離增加導(dǎo)致氧氣擴(kuò)散受限和長(zhǎng)時(shí)間（＞24 h）的低氧壓力形成的；而急性乏氧是由不規(guī)則細(xì)胞阻塞引起的異常血管關(guān)閉，進(jìn)而導(dǎo)致暫時(shí)的局部血液重新分布（幾分鐘到幾小時(shí)），這種現(xiàn)象有可能是可逆轉(zhuǎn)的［55］.在乏氧條件下，腫瘤細(xì)胞上調(diào)乏氧誘導(dǎo)因子（HIF）并啟動(dòng)下游生物化學(xué)反應(yīng)，包括細(xì)胞內(nèi)還原酶過(guò)度表達(dá)以及隨后的化學(xué)成分（如乳酸）的增加［56］.乏氧被證明與侵襲性的癌細(xì)胞表型有關(guān)，從而導(dǎo)致腫瘤對(duì)化學(xué)療法、放射療法和光動(dòng)力學(xué)療法的抗性［57～59］.因此，乏氧也成為監(jiān)測(cè)腫瘤進(jìn)展和治療反應(yīng)的理想生物標(biāo)志物［60，61］.

基于銥配合物乏氧響應(yīng)的性質(zhì)，本課題組［48］開發(fā)出了一種對(duì)缺氧腫瘤微環(huán)境具有高度特異性的近紅外光學(xué)成像探針I(yè)rPVP，能夠檢測(cè)活體內(nèi)幾千個(gè)癌細(xì)胞的存在.這種對(duì)氧敏感、近紅外發(fā)光、水溶性的磷光大分子探針不僅能夠報(bào)告包括體內(nèi)轉(zhuǎn)移性腫瘤在內(nèi)的各種癌癥模型的乏氧微環(huán)境［圖3（A）］，還能夠在腫瘤形成前基于癌細(xì)胞增殖過(guò)程中增加的耗氧量檢測(cè)到少量的活的癌細(xì)胞.為了進(jìn)一步提高該探針的靈敏度，本課題組創(chuàng)制了一種對(duì)酸化和乏氧連續(xù)響應(yīng)的大分子光學(xué)探針［8］.和傳統(tǒng)的開關(guān)探針設(shè)計(jì)原則不同，該探針以病灶生物環(huán)境變化引起的探針信號(hào)波長(zhǎng)的移動(dòng)來(lái)實(shí)現(xiàn)探針信號(hào)的放大.通過(guò)對(duì)波長(zhǎng)移動(dòng)/磷光強(qiáng)度增強(qiáng)的連續(xù)響應(yīng)，可以有效地實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤微環(huán)境信號(hào)的兩步放大.小鼠腫瘤模型的測(cè)試結(jié)果顯示，這種兩步連續(xù)響應(yīng)的大分子光學(xué)探針在腫瘤成像中表現(xiàn)出了高于常規(guī)一步響應(yīng)的光學(xué)探針一個(gè)數(shù)量級(jí)以上的信噪比.在小鼠腫瘤肝臟轉(zhuǎn)移模型中，該探針能夠高靈敏地檢測(cè)到小于1 mm大小的微小腫瘤轉(zhuǎn)移灶［圖3（B）］.

Fig.3 Metastatic tumor detection with hypoxia probe

2.2 炎癥監(jiān)測(cè)

炎癥是由細(xì)菌感染、阿爾茨海默病、帕金森病、中風(fēng)和癌癥等有害刺激引起的機(jī)體的一種防御反應(yīng).在炎癥過(guò)程中，組織血管受損，而病原體和浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞會(huì)消耗更多的氧氣［62，63］.同時(shí)，與健康的組織相比，炎癥組織顯示出更高的代謝率并伴有乏氧［64］，而組織修復(fù)過(guò)程中充足的氧含量是細(xì)胞增殖和蛋白質(zhì)合成的先決條件.因此，評(píng)估炎癥組織中的氧含量對(duì)于監(jiān)測(cè)炎癥至關(guān)重要.從濕疹和痤瘡等常見疾病到銀屑病、蜂窩組織炎和慢性糖尿病潰瘍等主要疾病，皮膚炎癥的發(fā)生范圍很廣.皮膚炎癥反應(yīng)通常涉及刺激炎性細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，然后介導(dǎo)一系列細(xì)胞過(guò)程.皮膚炎癥的標(biāo)志包括紅斑（發(fā)紅）、血管舒張、肥大細(xì)胞活化以及免疫細(xì)胞（如中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）浸潤(rùn)到受影響的組織中［65］.

本課題組［9］近期開發(fā)出了一種乏氧響應(yīng)的小分子探針I(yè)r-btp和水溶性高分子探針I(yè)rPVP，水溶性的IrPVP可以實(shí)現(xiàn)小鼠體內(nèi)的炎癥成像，并且在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的小鼠模型中區(qū)分健康區(qū)域和炎癥區(qū)域.同時(shí)，我們還將Ir-btp摻雜在聚氨酯薄膜中創(chuàng)制了一種智能繃帶，用于傷口的炎癥乏氧成像，在小鼠傷口模型中該薄膜可以有效識(shí)別小鼠創(chuàng)口的炎癥程度（圖4）.同樣地，Evans等［66］將Pd卟啉乏氧探針與液體繃帶混合，制備出一種可以涂覆的液體乏氧繃帶.在注射炎癥劑后，該繃帶可以追蹤7周內(nèi)損傷部位耗氧量的增加、平穩(wěn)和減少，并識(shí)別在皮膚表面以下不同深度注射引起的炎癥.這些探針的設(shè)計(jì)為動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)炎癥的進(jìn)程和愈合提供了一種長(zhǎng)期的觀察方式.

Fig.4 Polyurethane film composited with phosphorescent probe Ir-btp can real-time monitor wound inflammation in mice[9]

Fig.5 Optical wireless wearable prototype for transcutaneous oxygen monitoring[68]

2.3 皮膚氧含量監(jiān)測(cè)

組織氧含量的準(zhǔn)確測(cè)量對(duì)于燒傷、肢體損傷和外科手術(shù)的診斷應(yīng)用具有決定性意義［67］，而用來(lái)測(cè)量氧含量的醫(yī)療設(shè)備需要復(fù)雜的電子、光學(xué)和/或化學(xué)技術(shù)，這些技術(shù)通常會(huì)導(dǎo)致設(shè)備無(wú)法移動(dòng)且價(jià)格昂貴.Evans等［68］報(bào)道了一種用于皮膚氧含量監(jiān)測(cè)的無(wú)線可穿戴設(shè)備的原型，該原型使用金屬卟啉作為氧含量監(jiān)測(cè)探針，并將其嵌入高度透氣的氧傳感膜中（圖5）.該設(shè)備通過(guò)檢測(cè)磷光的壽命和強(qiáng)度來(lái)測(cè)量皮膚表面的組織氧含量，即使在溫度和濕度變化的條件下也能提供穩(wěn)定可靠的測(cè)量數(shù)據(jù).在豬缺血模型中，該可穿戴設(shè)備在肢體灌注減少時(shí)對(duì)生理范圍內(nèi)的組織氧含量變化高度敏感.

皮瓣在整形手術(shù)中很常見，用于在創(chuàng)傷或癌癥等情況下重建大的組織缺陷.然而，大多數(shù)用于監(jiān)測(cè)術(shù)后皮瓣缺血的組織血氧計(jì)都是復(fù)雜且笨重的有線設(shè)備，這阻礙了對(duì)手術(shù)后皮瓣的直接觀察，鑒于此，Evans等［69］進(jìn)一步地將內(nèi)標(biāo)分子熒光素和Pd卟啉混合在液體繃帶中，將其涂覆在皮瓣手術(shù)后病人的皮瓣處，接著用透明敷料進(jìn)行隔離.用繃帶測(cè)量的組織氧含量變化與血氧計(jì)測(cè)量的血氧飽和度吻合，證明了該乏氧繃帶的可靠性與準(zhǔn)確性.該液體繃帶僅需用傳統(tǒng)的數(shù)碼單反相機(jī)拍照即可對(duì)皮膚組織的氧含量變化進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，且可持續(xù)監(jiān)測(cè)10 d以上，該技術(shù)為開發(fā)在其它組織實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單快捷氧含量監(jiān)測(cè)的技術(shù)奠定了基礎(chǔ).

2.4 治療響應(yīng)監(jiān)測(cè)

疾病的發(fā)生、發(fā)展往往與組織氧含量的變化息息相關(guān)，當(dāng)使用治療性藥物對(duì)疾病進(jìn)行治療后，實(shí)時(shí)觀察治療效果對(duì)臨床診斷和治療具有重要意義.利用氧敏感光學(xué)探針實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)疾病組織氧含量的變化為動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)疾病發(fā)展過(guò)程提供了一種高效、便捷的方法.

鑒于此，本課題組［70］設(shè)計(jì)合成了一種修飾有Ir-PVP和洛沙坦的五氧化二釩納米粒子（IrP-L@V2O5）用于增強(qiáng)腫瘤分級(jí)光動(dòng)力治療［圖6（A）］.利用Ir-PVP的乏氧響應(yīng)特性，我們對(duì)光動(dòng)力治療過(guò)程中腫瘤部位的氧含量進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè).研究表明，在光動(dòng)力治療過(guò)程中，血管會(huì)被損傷進(jìn)而減少腫瘤組織氧含量，降低多次光動(dòng)力治療的療效；而IrP-L@V2O5可以舒張血管并增加腫瘤血管密度，從而增大腫瘤氧含量，提高分級(jí)光動(dòng)力治療的療效.腫瘤微環(huán)境中低氧腫瘤細(xì)胞的存在是對(duì)放療產(chǎn)生耐藥性的主要原因之一.與治療乏氧腫瘤相比，在氧合良好的條件下，電離輻射的作用可以大大增加.Liu等［71］設(shè)計(jì)了一種可同時(shí)用于放療和光熱治療的MnSe@Bi2Se3無(wú)機(jī)納米材料，該納米粒子對(duì)小鼠腫瘤模型的治療具有很強(qiáng)的協(xié)同作用.他們利用乏氧磷光探針I(yè)r-PVP動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)治療過(guò)程中腫瘤氧含量的變化［圖6（B）］，發(fā)現(xiàn)由于PTT期間輕度高溫促進(jìn)血液流入腫瘤導(dǎo)致氧含量顯著增加，放療的功效增強(qiáng).

Fig.6 Real time monitoring the oxygen level during therapy

2.5 食品質(zhì)量監(jiān)測(cè)

近年來(lái)，由于人們對(duì)包裝食品的質(zhì)量、感官、衛(wèi)生和安全性的關(guān)注日益增加，以及對(duì)食品保質(zhì)期的要求越來(lái)越高，主動(dòng)和智能包裝技術(shù)的應(yīng)用正受到越來(lái)越多的關(guān)注［72］.主動(dòng)包裝允許加入添加劑，例如氣體清除劑、二氧化碳釋放劑、乙醇釋放劑、溫度和濕度控制器、抗菌劑等，以提高包裝食品的質(zhì)量［73］.使用真空和氣調(diào)包裝系統(tǒng)（MAP）在無(wú)氧環(huán)境中儲(chǔ)存易腐爛食品以保持其質(zhì)量和延長(zhǎng)保質(zhì)期的情況正在興起.在MAP系統(tǒng)中，食品被包裝在包含特定比例的天然氣（N2，CO2，O2）混合物的包裝中，以延緩微生物的生長(zhǎng)和其它降解過(guò)程.然而，由于包裝材料的透氣性、封閉食品的氣體捕集能力、包裝受損、氣體沖洗效率低下及包裝、處理或運(yùn)輸過(guò)程中的意外損壞等因素，MAP產(chǎn)品中的殘留氧含量會(huì)增加［74］.因此，監(jiān)測(cè)單個(gè)包裝中的MAP成分，特別是氧濃度可以提供有關(guān)食品質(zhì)量、包裝材料完整性、包裝機(jī)器和工藝效率、儲(chǔ)存條件和處理的有價(jià)值信息.

Papkovsky等［75］將乏氧響應(yīng)的磷光探針Pt卟啉包裹在在聚苯乙烯中，并將其涂覆在聚合物薄膜或者濾紙上，發(fā)現(xiàn)利用手持記錄儀可以跟蹤真空包裝雞肉和氣調(diào)包裝中雞肉、牛肉和火腿樣品中的氧含量變化，為食品質(zhì)量監(jiān)測(cè)提供了一種新的手段.然而，在真空和MAP包裝樣品中，當(dāng)氧敏感探針被放置在產(chǎn)品頂部并與產(chǎn)品直接接觸時(shí)，對(duì)于它們所接觸的食品樣品，可以定量獲得可靠、穩(wěn)定的光學(xué)信號(hào)和氧濃度的數(shù)值.但在真空包裝的樣品中，對(duì)于沒(méi)有任何頂部空間的收縮包裝，氧氣在產(chǎn)品中的橫向擴(kuò)散大大減少，除非一些空氣能夠進(jìn)入包裝并使包裝膨脹，否則，這種氧敏感的探針并不能提供關(guān)于食品各方位的氧含量變化和食品包裝完整性的信息［76］.因此，在真空包裝產(chǎn)品中更廣泛地使用乏氧磷光探針作為質(zhì)檢的工具還有待研究.在初步的食品包裝測(cè)試被證明成功后，研究人員開始使用乏氧磷光探針來(lái)監(jiān)測(cè)和表征各種產(chǎn)品，評(píng)估它們的質(zhì)量、保質(zhì)期變化以及解決食品包裝問(wèn)題.干酪食品中大量的孔隙和氧氣為霉菌的生長(zhǎng)提供了條件，因此，食品包裝過(guò)程中需要在干酪食品中添加CO2以排空氧氣.O’Mahony等［77］將Pt卟啉乏氧探針置于干酪包裝袋內(nèi)，用于檢測(cè)對(duì)氧氣敏感的干酪在生產(chǎn)制作過(guò)程中的包裝完整性和質(zhì)量監(jiān)測(cè).該探針的使用揭示了食品包裝過(guò)程中生產(chǎn)工藝的缺陷，并為食品包裝工藝的優(yōu)化提供監(jiān)測(cè)手段.

3 總結(jié)與展望

光學(xué)成像不僅可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞和組織的無(wú)創(chuàng)高分辨率可視化，還可以通過(guò)檢測(cè)光學(xué)探針與分析物的相互作用來(lái)對(duì)組織生理變化進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè).與正電子發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層成像（PET）和核磁共振成像（MRI）不同，光學(xué)成像具有更高的空間分辨率和檢測(cè)靈敏性，不僅可以檢測(cè)腫瘤乏氧，還可以使用刺激響應(yīng)性探針動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)其狀態(tài).由于腫瘤間和腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性，腫瘤乏氧的程度可能有很大差異，這突出了在不同癌癥類型中進(jìn)行腫瘤乏氧研究的重要性.

組織氧含量的變化對(duì)傷口愈合起著至關(guān)重要的作用，然而臨床使用的氧含量檢測(cè)儀是單點(diǎn)測(cè)量，不能顯示組織或皮膚二維平面上的氧分壓變化，且只能檢測(cè)非受傷部位.基于乏氧光學(xué)探針的檢測(cè)可以顯示創(chuàng)傷組織或皮膚二維平面上的氧分壓變化情況且不會(huì)對(duì)組織造成損傷，是一種先進(jìn)的氧含量檢測(cè)技術(shù).雖然現(xiàn)有的乏氧光學(xué)探針的檢測(cè)位于組織的淺表部位，不利于深層組織的活體檢測(cè)，但是隨著探針設(shè)計(jì)水平的提高，其檢測(cè)深度也在增加.同時(shí)，氧氣在生命活動(dòng)中的重要作用決定了氧含量檢測(cè)光學(xué)探針在動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)組織和細(xì)胞的功能及環(huán)境微生物等方面具有廣泛的應(yīng)用前景，如腫瘤的早期檢測(cè)、腫瘤干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)以及血液循環(huán)腫瘤細(xì)胞的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)；腦部疾病如阿茲海默癥、腦水腫以及腦卒中等腦部病變的檢測(cè)與治療過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)；傷口愈合狀況的可視化監(jiān)測(cè)；纖維化疾病的檢測(cè)；環(huán)境中微生物含量及變化的監(jiān)測(cè)等.因此，開發(fā)具有不同波長(zhǎng)的乏氧光學(xué)探針用于不同疾病、微生物和環(huán)境的檢測(cè)具有重要意義.