蛋白類藥物強制降解研究進展

張曉騰，韓建軍，白燕

華北制藥金坦生物技術股份有限公司，石家莊050035

蛋白類藥物在腫瘤、免疫等疾病上，具有特異性高、療效快、安全性好等優(yōu)點，因此，近年來，蛋白類藥物的研發(fā)引起了人們廣泛的關注，尤其是抗體藥物，已成為醫(yī)藥領域發(fā)展最迅速、研發(fā)數(shù)量最多的產品之一［1-2］。截至2020年，單克隆抗體產品全球銷售額約1 250億美元，占藥品總銷售額的15%［3］。2019年共批準上市了9款抗體藥物，累計上市的抗體藥物數(shù)量是2010 年的近3 倍，且后期臨床管線較豐富，與2010 年相比，處于后期研究階段的抗體療法數(shù)量增加了2倍多；同時，早期臨床管線也較多，據(jù)統(tǒng)計，有500 多種新型抗體療法已進入臨床Ⅰ、Ⅰ/Ⅱ、Ⅱ期試驗［4-5］。

蛋白類藥物主要成分是蛋白質，其分子量大、不穩(wěn)定且具有高度復雜的二維和三維構象，有些蛋白質還有特定的糖基化修飾，其不穩(wěn)定性導致對外界條件較敏感，易發(fā)生降解，從而影響其功效。蛋白類藥物的降解產物具有免疫原性，這也是蛋白類藥物的主要危險因素。因此，穩(wěn)定性研究是蛋白類藥物質量控制的重要內容之一。美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）、國際人用藥品注冊技術協(xié)調會（The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）（Q1A8、ICH Q5C）和世衛(wèi)組織（World Health Organization，WHO）（Annex 10）指南規(guī)定了藥物穩(wěn)定性試驗的要求，用于了解在各種環(huán)境因素的影響下，原料藥和藥品的質量是如何隨時間變化的。強制降解是穩(wěn)定性試驗中最重要的部分，也是預測藥物穩(wěn)定性最常用的工具，可以預測外界條件對藥品純度、效力和安全性的影響，從而制定藥品包裝、運輸、儲存等條件要求。目前，對于強制降解研究，僅在ICH Q1B 中對強光條件設置有明確的規(guī)定，其他條件如高溫、高濕、酸/堿水解及氧化條件均無明確規(guī)定。雖然化學藥物強制降解研究已相對成熟，但蛋白類藥物對環(huán)境和條件更敏感，因此，蛋白類藥物強制降解與化學藥物差異較大。本文主要綜述了蛋白類藥物的強制降解條件及其對蛋白質結構的影響，以期為蛋白類藥物強制降解試驗條件設計提供理論參考依據(jù)。

1 蛋白類藥物不穩(wěn)定性因素

蛋白類藥物的穩(wěn)定性由物理穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性組成。物理不穩(wěn)定性與蛋白質高階結構的變化有關，包括熱不穩(wěn)定性和構象不穩(wěn)定性，其中熱不穩(wěn)定性與蛋白質的展開溫度有關；構象不穩(wěn)定性與蛋白質的三維結構有關。物理不穩(wěn)定性可能由降解導致，如去折疊、解離、變性、吸附、聚集和沉淀，其中蛋白質去折疊是非常重要的物理不穩(wěn)定性因素，會影響蛋白質的二級結構和三級結構，這種構象變化可能會導致蛋白類藥物的生物活性下降并可誘導不可逆的蛋白質聚集［6-8］。而化學不穩(wěn)定性與蛋白類藥物一級結構中共價鍵的形成和/或斷裂有關，可由氧化、還原、脫酰胺、水解、精氨酸轉化、β-消除等不同降解途徑引發(fā)［9］。

2 蛋白類藥物強制降解條件

不同類型的蛋白質其結構、分子量均不相同，導致穩(wěn)定性差異較大，因此，難以制定強制降解條件的統(tǒng)一標準。但目前對于降解量，F(xiàn)DA和WHO建議為5%～30%。強制降解的條件若過于激烈，可能會導致次級降解產物的生成，甚至導致主峰被完全破壞，且在研究中這些次級降解產物的穩(wěn)定性較差，對于蛋白類藥物的穩(wěn)定性及雜質譜無指導價值。若強制降解的條件過于平緩，降解產物的含量很難達到檢出限或者定量限，進而很難對穩(wěn)定性試驗中可能出現(xiàn)的雜質做出正確的預測。因此，合理的試驗條件是強制降解成功的關鍵。目前，強制降解試驗條件主要考察高溫、pH（強酸、強堿）、氧化、光照、反復凍融、振蕩等。

2.1 高溫

蛋白類藥物受溫度影響較大，一般儲存于2～8 ℃下，隨著溫度的升高，蛋白構象可能會發(fā)生展開或者部分展開，展開后的蛋白質更易發(fā)生降解或者聚集。隨著溫度的持續(xù)升高，會達到蛋白質融化溫度，導致蛋白質發(fā)生不可逆的聚集。在高溫下，構象發(fā)生變化的蛋白質其氨基酸更易與化學物質發(fā)生反應，因此，在高溫下，蛋白質除了發(fā)生聚集外，還會伴隨其他化學反應，如氧化、脫酰胺等。蛋白類藥物的溫度設置條件需高于穩(wěn)定性研究加速考察溫度的10 ℃以上，還需低于融化溫度的10～20 ℃，才可以獲取有效的降解信息。Mcavan 等［10］研究表明，IgG4 單克隆抗體在40、50 ℃處理14 d 后，發(fā)生了聚集反應，進一步對肽圖進行分析發(fā)現(xiàn)，Met、Trp 和His 殘基發(fā)生了氧化，且50 ℃處理下，發(fā)生了明顯的脫酰胺反應；同時，利妥昔單抗在45、55、65°C處理4 h，發(fā)現(xiàn)在低于熔化溫度（45、55 ℃）時，His 和Lys 殘基發(fā)生變化，進而導致單抗的拓撲結構發(fā)生了變化，而在65°C時，利妥昔單抗發(fā)生聚體沉淀。

藥物的高溫降解一般遵循阿倫尼烏斯（Arrhenius）方程，其可用來實時預測蛋白質降解情況，但蛋白類藥物降解并不遵循阿倫尼烏斯方程。Didier等［11］發(fā)現(xiàn)凍干減毒活疫苗在37 ℃強制條件下處理14 d，病毒的滴度下降不符合阿倫尼烏斯方程，分析原因為病毒滴度下降首先由病毒與海藻糖之間的氫鍵發(fā)生變化引起，而后發(fā)生構象變化（α-螺旋增加、β-轉角減少）和脫酰胺導致病毒失活造成病毒滴度下降，該現(xiàn)象實際遵循二級動力學方程。在其他生物制品中，高溫對蛋白類藥物造成的降解也發(fā)現(xiàn)此種情況，二級動力學模型在儲運期間（包括溫度偏移）的穩(wěn)定性均可以被準確預測，而阿倫尼烏斯方程在穩(wěn)定性預測方面會產生顯著誤差［12］。

2.2 pH

蛋白質在極端pH 條件下由于維持構象的分子內或分子間作用力（如氫鍵、靜電力和疏水力）被破壞，從而可能導致永久變性或聚集。在細胞培養(yǎng)階段、低pH 病毒失活、純化階段等常造成局部溶液pH極端，進而導致蛋白類藥物降解，因此，對于工藝研究，了解極端pH條件導致的蛋白類藥物降解至關重要。蛋白類藥物pH 強制條件一般為低pH 在3～5 之間，高pH 在8～9 之間，處理時間1～3 周，甚至3 個月［13］。低pH 條件下蛋白類藥物易發(fā)生Gln 脫酰胺和Asn 殘基脫酰胺，在高pH 條件下蛋白類藥物易發(fā)生Met殘基氧化、Gln殘基脫酰胺、Asn 殘基脫酰胺和蛋白質纖維化［14］。但以上條件并不是絕對的，藥品中的某些物質也會導致蛋白類藥物的降解，如在低pH 下，中國倉鼠卵巢細胞宿主蛋白也會加速蛋白類藥物Phe 和Trp殘基的降解［15］。

高溫可以加速pH 依賴的降解，因此，pH 誘導的強制降解試驗的溫度一般在25 ℃或者40 ℃［16］。但溫度對pH誘導的強制降解加速并不是絕對的，與緩沖液類型也有一定的關系。Pacea 等［17］發(fā)現(xiàn)溫度影響不同pH 緩沖液下IgG1 單克隆抗體的脫酰胺速率，在40 ℃時，酸性緩沖液溶液的脫酰胺速率快于堿性緩沖液，但在5 ℃時，堿性緩沖液溶液的脫酰胺速率快于酸性緩沖液，原因為OH-濃度與單克隆抗體的脫酰胺速率相關，而溫度的劇烈變化會影響緩沖液中的OH-濃度。pH 對溫度造成的蛋白質聚集影響較大，人單克隆IgG2 抗體在4 ℃下表現(xiàn)出典型的pH 依賴性的二聚體聚集。然而在37 ℃下，高分子量聚集體與pH 呈負相關關系，表明其與溫度介導的剪切相關［18］。

2.3 氧化

蛋白類藥物中S 原子比較活躍，容易被氧化，因此，Met 和Cys 殘基是最容易被氧化的氨基酸。在堿性條件下，Met 和Cys 殘基氧化可生成Met 亞砜或Met 砜甚至形成分子內/間二硫鍵。由于氨基酸結構中存在芳香環(huán)，芳香環(huán)容易被氧化，因此，His、Tyr 和Trp 殘基也容易被氧化［19］。蛋白質的氧化易受到外界環(huán)境的刺激，進而加速氧化，如某些金屬離子、高溫、光照、化學添加劑等。最常用的化學氧化劑為H2O2、叔丁基過氧化氫、2-偶氮雙（2-氨基丙烷）二鹽酸鹽等，常用的金屬離子為Fe2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+等，其中H2O2氧化法是最經(jīng)典的氧化方法，添加量為0.03～500 mmol·L-1，但反應時間差異較大。氧化法常結合高溫或者光照輔助加速氧化，但有時氧化反應速度過快，并且在低溫甚至冷凍條件下仍然可以進行，因此，很難將氧化反應終止，目前，最常用的氧化終止法是緩沖液交換法。蛋白類氧化會造成藥物的療效降低，甚至導致蛋白質空間結構發(fā)生變化。Singh 等［20］在25 ℃條件下采用300 mmol H2O2氧化人粒細胞刺激 因 子（human granulocyte-stimulating factor，G-CSF），發(fā)現(xiàn)G-CSF 的Met殘基最易被氧化，氧化位 點 為Met1、Met138、Met127 和Met 122，其 中Met127 和Met122 的氧化還會引起G-CSF 的Asp113和Thr117殘基的輕微位移，從而導致局部構象發(fā)生變化。此外，一些賦形劑（如聚山梨酯、聚乙二醇和吐溫-80）、潤滑劑和包裝材料的過氧化物的污染可導致蛋白類藥物的氧化［21］。使用不同的氧化劑雖然均能氧化蛋白質，但氧化的位點優(yōu)先順序卻存在差異，強光氧化條件下IgG1 重鏈的Met 優(yōu)先氧化，而叔丁基過氧化氫氧化條件下Met氧化是隨機的［22］。

2.4 光照

蛋白類藥物一般建議避免陽光直射，并且有些藥物需采取相應的措施以避免直接或者長期暴露于陽光下，但在蛋白類生產用藥過程中很難完全避免光照，如純化層析過程中紫外燈的檢測、半成品的配制和轉移可能暴露于人工光源下等。光強制降解是眾多條件中，唯一有指導原則的試驗。ICHQ1B 光穩(wěn)定性試驗指導原則要求對光源的波長分布除450～650 nm 的可見光區(qū)外，還應包括320～400 nm 的近紫外區(qū)。因此，光源有2 種選擇方式，第1種是光源分布波長特性相當于ISO室外日光標準D65 與室內間接日光標準ID65 的光源，如日光熒光燈、氨燈、鹵燈等；第2種是同時暴露于冷白熒光燈和近紫外熒光燈下。并且ICH還要求樣品應暴露于總照度不低于1.2×106lx·h，近紫外能量不低于200 w·h·m-2。光誘導的強制降解與蛋白質的結構和構象、制劑配方組成、包裝形式以及光波長、光強度和光照時間密切相關。光強制降解可導致多種產物生成，包括蛋白質聚集、交聯(lián)和降解。光強制降解常作用于Cys、Trp、Tyr和Phe 靶點［23］。光照條件下存在的氧化劑或者金屬離子均可加速蛋白質氧化。光強制降解雖然只影響單個氨基酸的化學變化，但單個氨基酸可能在活性氧和水共同存在下與其他氨基酸發(fā)生反應使蛋白質的構象發(fā)生變化，從而導致聚集，或者在長期儲存期間，產生的小濃度聚集物作為成核中心，進而產生可見顆粒物。酪氨酸的氧化產物是二酪氨酸，脫質子化的二酪氨酸具有光敏作用，可以產生O2-、H2O2和O2，進一步與其他氨基酸發(fā)生反應，破壞蛋白質的空間結構［24］。

除了蛋白類藥物的氨基酸光照后形成的氨基酸氧化產物是光敏劑外，糖基化終產物和過氧化物也可以作為光敏劑，進而破壞蛋白質的結構。蛋白質可與還原糖發(fā)生非酶反應，形成結構多樣的雜環(huán)交聯(lián)產物——高級糖基化終產物，如戊糖苷、甲基乙二醛賴氨酸二聚體、乙二醛賴氨酸二聚體和脫氧葡萄糖基賴氨酸二聚體。這種高級糖基化產物在紫外光的作用下產生O2-、H2O2和O2等，進而氧化破壞蛋白質的結構［25-26］。蛋白類藥物制劑中一般不存在還原糖，但蔗糖等二糖常作為穩(wěn)定劑添加到制劑中。蔗糖在酸性和高溫條件下易水解為葡萄糖和果糖，如單克隆抗體在蔗糖中29 ℃保存6 個月即可以生成高級糖基化產物［25］。聚山梨酯-80是蛋白類藥物中常用的抗氧化劑，亞油酸是其游離的脂肪酸成分。亞油酸可以通過殘余宿主細胞蛋白的催化水解或者氧化釋放出來。亞油酸可以進一步氧化生成丙二醛。丙二醛可與Lys 殘基反應生成二氫吡啶加合物，其在光照條件下可產生O2，以氧化蛋白質［27］。

2.5 反復凍融

蛋白類藥物在儲藏和運輸過程中，易受到外界環(huán)境的劇烈變化導致發(fā)生凍融過程。蛋白類藥物運輸儲藏過程中易發(fā)生低于0 ℃情況，此時藥物是否可以使用需要依據(jù)蛋白類藥物反復凍融的機制去評估。在反復凍融過程中，可能會發(fā)生蛋白質與冰表面張力變化、溫度劇烈變化、濃縮、賦形劑結晶、相分離和pH 變化，這些變化會影響蛋白類藥物的聚集，但影響程度取決于制劑的組分、蛋白質本身性質及反復凍融的溫度及溫度變化速率［28-29］。蛋白質的聚集主要是由于蛋白結構在冷凍過程中被打開，蛋白質單體可與相鄰單體發(fā)生聚合反應，形成二聚體和三聚體，但此聚合過程是可逆的。但若pH 在冷凍過程中變化導致緩沖液pH 接近蛋白質的等電點時，近距離蛋白質單體之間互相排斥的電荷被中和，疏水力會增大，進而導致蛋白質重新折疊成聚集體（此過程是可逆的）或者與另一個蛋白質單體發(fā)生β-折疊形成不可逆的聚集體［30］。如單克隆抗體在-80 ℃下冷凍，室溫下解凍會發(fā)生明顯的聚集，但此聚集體是不可逆的，當冷凍過程pH 由酸性偏向于中性時，蛋白質聚集體的含量也隨之增加［31］。蛋白質聚集體在高溫強制條件下也可以形成，但形成機制不同。如單克隆抗體在高溫條件下形成的聚集體是以二硫鍵連接的，而在反復凍融過程中形成的聚集體是以非共價鍵連接起來的，形成的機制不同，導致生物物理性質和高階結構與單體相比差異也較大。反復凍融形成的聚集體在生物活性、物理性質和高階結構方面與單體差異較小，但由于空間位阻的存在，導致其生物活性顯著降低［32］。

反復凍融試驗中，試驗樣品的體積參數(shù)也非常重要，1～5 mL 蛋白質溶液在幾分鐘冷凍，而大體積的蛋白質溶液冷凍過程漫長，會導致蛋白質溶液出現(xiàn)不均一現(xiàn)象，這是由于發(fā)生了冷凍濃縮現(xiàn)象，水溶液的冰點低首先凍結，導致下層溶液蛋白質、緩沖液成分均變大，引起滲透壓、pH 發(fā)生變化，因此，在反復凍融試驗中，試驗的體積應盡可能小。冷凍溫度一般需要低于蛋白類藥物的玻璃態(tài)融化溫度，一般選擇-20 ℃或者-80 ℃。融化溫度一般選擇5 ℃或者25 ℃。反復凍融的周期一般應大于3個周期。

2.6 振蕩或攪拌

蛋白類藥物在生產、運輸和最終給藥過程中常會受到振蕩或攪拌，因此，測試其在振蕩或者攪拌情況下的穩(wěn)定性非常重要。蛋白質在振蕩或者攪拌中會暴露于剪切力增大、氣液兩相、局部溫度變化等情況下，這些情況可能導致蛋白類藥物發(fā)生降解。蛋白類藥物在混合、過濾等制造過程中易受到剪切力的作用從而導致蛋白質的聚集，但研究發(fā)現(xiàn)當剪切力達到20～150 pN 時，蛋白質結構才可能被破壞，從而導致聚集。一般在混合、過濾過程中，剪切力最高不超過0.06 pN，理論上無法使蛋白質發(fā)生聚集，但也有蛋白質發(fā)生聚集的情況，原因為蛋白質暴露于氣液兩相界面上導致蛋白質的穩(wěn)定性發(fā)生變化，其發(fā)生的聚集是不可逆的甚至會形成不溶顆粒［33-34］。剪切力可能會導致蛋白質的融化溫度降低從而導致蛋白質的結構發(fā)生變化，如重組人生長激素（recombinant human growth hormone，rhGH）在高剪切力作用下，雖然構象未發(fā)生變化，但其焓值發(fā)生了明顯變化［35］。

在蛋白類藥物的實際運輸過程中，雖然難以發(fā)生高剪切力作用，但可能由于多種因素的共同作用導致蛋白類藥物的聚集，如蛋白類藥物濃度越高，蛋白質在疏水作用下越容易自發(fā)展開折疊進而形成聚集體。因此，應充分考慮運輸路線、交通工具、運輸距離、運輸時間、裝載模式、外界環(huán)境等因素。通過試驗，在運輸過程中應確認產品處于擬定的保存條件下可以保持產品的穩(wěn)定性［36］。目前，對于運輸振蕩的模擬，一般采用渦流振蕩器法、搖床振蕩法和振動試驗機法。Fleischman等［37］采用渦流振蕩器、搖床和振動試驗機來模擬運輸對IgG1和IgG4的影響，發(fā)現(xiàn)振動試驗機能夠預測在實時運輸過程中，單克隆抗體在西林瓶和預灌封注射器中發(fā)生的聚集，而其他方法不能實時預測，表明振動試驗機是模擬蛋白類藥物在實際運輸過程中蛋白質聚集的有效手段。

3 提高蛋白類藥物穩(wěn)定性策略

雖然以提高蛋白類藥物穩(wěn)定性的新技術或手段較多，但目前仍以物理和化學兩種策略為主。在物理策略上，主要通過改變劑型或調整緩沖液的組分以達到提高蛋白質穩(wěn)定性的目的。目前蛋白類藥物劑型主要為注射劑或粉針劑。粉針劑是采用冷凍干燥制得，其蛋白質的穩(wěn)定性比注射劑更強，主要是由于蛋白質在冷凍干燥后其分子在介質中的熱運動及相互作用降低，并且制劑中的賦形劑也可維持蛋白質的天然結構，從而其穩(wěn)定性也大大提高［38-39］。因此，對于不穩(wěn)定的蛋白主要采用冷凍干燥制成粉針。在冷凍干燥中使用的賦形劑主要有糖類或糖醇（如甘露醇、葡糖糖等）、氨基酸（如組氨酸［40］、精氨酸等［41］）、表面活性劑（如吐溫20、吐溫80 等）、聚集物（如乙二醇、葡聚糖和聚乙烯吡咯烷酮等［42］）。隨著科學技術的發(fā)展，脂質體包埋［43］、納米微球［44］、聚電解質［45］等也是提高蛋白類藥物穩(wěn)定性的有效有段，其可以較好地抵抗溫度、pH 造成的蛋白質降解。在注射制劑中，調整緩沖液的pH或組分是提高蛋白類藥物穩(wěn)定性最常用的策略［46］。蛋白類藥物易受到pH的影響，因此，將蛋白類藥物調整到穩(wěn)定性的范圍內是最經(jīng)濟的手段。在組分添加中，主要添加物有表面活性劑、糖類等物質。表面活性劑中吐溫-80 應用最廣泛，其可以防止蛋白聚集，從而達到穩(wěn)定蛋白質的目的［47］。糖類可通過非特異性的靜電作用提高蛋白類藥物的穩(wěn)定性［48］。

在化學策略上，主要是通過對蛋白質的結構進行修飾以達到穩(wěn)定的目的，主要手段有定點突變、聚乙二醇修飾、糖基化修飾、脂肪酸修飾及末端修飾等，其中聚乙二醇修飾及脂肪酸修飾是最成功的手段，均有大量商業(yè)化產品上市。定點突變主要是通過對不穩(wěn)定的氨基酸殘基側鏈進行替換，且不對活性中心進行修飾，以達到不影響其活性且增加穩(wěn)定性的目的。Palmer 等［49］發(fā)現(xiàn)蛋白G在堿性條件下，Asn37 殘基易發(fā)生降解導致其蛋白不穩(wěn)定，而將其位置突變?yōu)門hr 后發(fā)現(xiàn)其耐堿性增加8 倍。用聚乙二醇對蛋白質進行修飾后形成了大量的氫或離子鍵，這些親水健的形成，會提高其穩(wěn)定性，延長其半衰期，如商業(yè)化聚乙二醇化人粒細胞刺激因子等。糖基化修飾是對蛋白質的N-糖基、O-糖基、C-糖基以及糖基磷脂酰肌醇等進行修飾，是最簡便、有效的工具［50］。CH2結構域是人類IgG 恒定區(qū)的關鍵結構，但其最不穩(wěn)定。有研究者［51］對CH2結構域的糖基化進行修飾，構建出不含糖基化的CH2結構域后，發(fā)現(xiàn)其不會造成蛋白聚集，其免疫原性也更強，表明CH2結構域的糖基化易造成蛋白聚集。脂肪酸修飾也是商業(yè)化較為成功的方法，如利拉魯肽等均已成功上市。脂肪酸修飾后的蛋白質穩(wěn)定性更強，還有利于提高其脂溶性［52］。末端修飾主要應用于多肽類藥物，多肽中的靜電作用力是維持肽鏈結構與穩(wěn)定性的主要應力，因此，對肽鏈末端進行修飾可加強靜電作用進而提高多肽的穩(wěn)定性。Zheng 等［53］將神經(jīng)六肽的N 端和C 端分別連接Phe 和Thr 后發(fā)現(xiàn)，其結構更穩(wěn)定，且不易發(fā)生聚集。

4 展望

強制降解是蛋白類藥物研發(fā)過程中最重要的一環(huán)，其可以闡明蛋白類藥物的內在穩(wěn)定性及降解機制，從而為分析方法的建立及制劑開發(fā)等指明方向。強制降解條件是強制降解研究成功的關鍵，但目前強制降解條件與穩(wěn)定性研究試驗條件相比缺少相關的指南和建議，對蛋白類藥物的強制降解條件主要依靠蛋白質的結構和研究人員經(jīng)驗進行確定，因此，需要質量研究人員對蛋白質的結構有清楚的認知，雖然藥典中未對強制降解的批次進行要求，但在前期試驗條件探索過程中，需要大量的試驗和批次才能確認較好的試驗條件。在強制降解試驗中制劑使用的包材（如預灌封注射器、西林瓶等）質量較穩(wěn)定，然而在原液中使用的包材大多數(shù)為重復使用的材料，質量穩(wěn)定性較差，容易對試驗造成干擾，因此，建議使用質量較好的且未使用的原液包材進行強制降解，以保證批次間的一致性。

綜上所述，反復凍融和震蕩或攪拌主要引起蛋白質物理不穩(wěn)定性，造成蛋白質的聚集，而高溫、氧化、光照可以引起蛋白質化學不穩(wěn)定性，造成蛋白質氨基酸氧化、脫酰胺等，從而使蛋白質高級結構發(fā)生變化，導致蛋白類藥物失活。此外，一些緩沖液或制劑成分會加速蛋白質的降解，如金屬離子、還原糖等。目前強制降解試驗中仍存在降解程度過低的問題，導致長期試驗中難以發(fā)現(xiàn)該物質，進而造成檢測條件不合理，影響患者身體健康；同時，也存在降解條件過于劇烈，檢測到降解產物再次降解，這些次級降解產物在藥品穩(wěn)定性試驗中很難出現(xiàn)，造成方法及降解產物毒理學研究過度。在強制降解試驗中也存在分析方法靈敏度過低、方法不合理的問題，這需要對于可能降解的產物采用更加靈敏的方法，如質譜法、核磁共振等進行分析，以期確定其結構或者可能發(fā)生降解的位點，為制劑配方的開發(fā)或穩(wěn)定性改造奠定研究基礎。此外，強制降解條件的合理設計是試驗成功的關鍵。本文為蛋白類藥物研發(fā)人員的強制降解條件的選擇以及降解產物的分析提供了理論參考。