不同體液標(biāo)本活檢在肺癌微小殘留疾病監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用最新進(jìn)展

閆星，劉山梅，劉長(zhǎng)宏*

經(jīng)過幾十年的相關(guān)探索，肺癌患者的管理方法發(fā)生了深刻變革?？梢悦鞔_的是，疾病監(jiān)測(cè)是治療成功的基礎(chǔ)，目前在肺癌的臨床診療過程中因復(fù)發(fā)導(dǎo)致術(shù)后患者死亡的百分比仍然很高（2年內(nèi)ⅠB期患者復(fù)發(fā)率為45%、ⅢA期患者復(fù)發(fā)率高達(dá)76%）［1］。因此作為腫瘤復(fù)發(fā)的“罪魁禍?zhǔn)住薄⑿埩艏膊。∕RD）越來越受到臨床重視。MRD是指經(jīng)過治療后，傳統(tǒng)影像學(xué)或?qū)嶒?yàn)室檢查不能發(fā)現(xiàn)，通過液體活檢發(fā)現(xiàn)的癌來源分子異常，代表惡性腫瘤的持續(xù)存在和臨床進(jìn)展可能［2］。在TRACERx研究中［3］，經(jīng)液體活檢分析證實(shí)99%以上沒有復(fù)發(fā)的非小細(xì)胞肺癌患者M(jìn)RD陰性，并且發(fā)現(xiàn)在通過標(biāo)準(zhǔn)成像檢測(cè)到疾病之前復(fù)發(fā)的患者中可以檢測(cè)到MRD。目前檢測(cè)MRD的新興手段之一便是液體活檢，通過分析血液及其他體液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）、 循 環(huán)腫 瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、外泌體等來源于實(shí)體瘤的生物標(biāo)志物監(jiān)測(cè)腫瘤進(jìn)展，可為后續(xù)治療提供臨床決策。液體活檢不同于組織活檢的是可以多次、連續(xù)進(jìn)行識(shí)別腫瘤驅(qū)動(dòng)突變、跟蹤腫瘤演變和監(jiān)測(cè)疾病復(fù)發(fā)的無創(chuàng)操作，且操作方式更加便捷，能夠動(dòng)態(tài)反饋疾病的進(jìn)展，相關(guān)報(bào)道稱液體活檢可使患者避免約5%與CT引導(dǎo)肺組織活檢相關(guān)的主要并發(fā)癥［4］。同時(shí)液體活檢可以完全反映腫瘤的異質(zhì)性，為患者術(shù)后進(jìn)行個(gè)體化靶向治療、改善預(yù)后提供更多機(jī)會(huì)。本文綜述了幾種熱點(diǎn)液體（外周血、尿液、唾液、痰液、胸腔積液）標(biāo)本在肺癌MRD檢測(cè)中的進(jìn)展，并探討多元化液體活檢標(biāo)本分析指導(dǎo)肺癌MRD精準(zhǔn)治療的應(yīng)用價(jià)值，期待其成為未來指導(dǎo)臨床決策并改善患者預(yù)后的一條嶄新道路。

1 肺癌MRD液體活檢的優(yōu)勢(shì)及挑戰(zhàn)

傳統(tǒng)檢查（包括組織活檢、影像學(xué)、生化指標(biāo)等常規(guī)檢查）一直在肺癌的發(fā)生、發(fā)展監(jiān)測(cè)及治療過程中起著重要作用，在液體活檢應(yīng)用于臨床之前其是包括原發(fā)性肺癌在內(nèi)的惡性腫瘤病理診斷、分期和治療決策的“金標(biāo)準(zhǔn)”。然而，傳統(tǒng)檢查受限于操作與時(shí)效性而難以真正推動(dòng)肺癌MRD監(jiān)測(cè)的發(fā)展。液體活檢的優(yōu)勢(shì)在于，首先相對(duì)于組織活檢其是一種非侵入性操作，患者的體液可以很容易地重復(fù)取樣，這使得在治療過程中可以通過連續(xù)取樣來監(jiān)測(cè)腫瘤特征（“實(shí)時(shí)活檢”），同時(shí)打破了其腫瘤異質(zhì)性的取樣局限。ROTHWELL等［5］的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，39例晚期實(shí)體瘤患者的循環(huán)游離DNA（circulating free DNA，cfDNA）和患者相應(yīng)腫瘤組織DNA的高通量測(cè)序（NGS）顯示，在腫瘤組織中未檢測(cè)到的突變是來自血漿樣本的30%；其次，液體活檢相對(duì)于常規(guī)檢測(cè)具有時(shí)間優(yōu)越性及較高的特異度。TRACERx研究發(fā)現(xiàn)［3］，術(shù)后ctDNA預(yù)測(cè)肺癌患者36個(gè)月復(fù)發(fā)的靈敏度為48%，特異度為100%；且ctDNA檢測(cè)和影像學(xué)復(fù)發(fā)之間的中位時(shí)間為167 d，而癌胚抗原（CEA）升高和影像學(xué)復(fù)發(fā)之間的中位時(shí)間為61 d，相比較液體活檢縮短了臨床診斷復(fù)發(fā)間隔時(shí)間，爭(zhēng)取了復(fù)發(fā)前治療優(yōu)勢(shì)。有趣的是一份報(bào)告描述了1例ⅡB期非小細(xì)胞肺癌患者接受了放射治療且影像學(xué)檢查顯示有殘留腫塊，盡管該患者在治療后沒有檢測(cè)到ctDNA，但根據(jù)ctDNA連續(xù)監(jiān)測(cè)，該患者在治療22個(gè)月后被視為無病狀態(tài)［6］，事后來看，該腫塊代表輻射誘導(dǎo)的炎癥變化，這也引起了業(yè)界對(duì)影像學(xué)篩查導(dǎo)致假陽性率過高以及輻射風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)注。然而，液體活檢要想進(jìn)一步在臨床應(yīng)用中大有作為仍存在一些挑戰(zhàn)，例如克隆性造血（cloning of hematopoietic，CH），在沒有已知驅(qū)動(dòng)突變的情況下，隨著非小細(xì)胞肺癌患者年齡增長(zhǎng)，通過cfDNA檢測(cè)到造血干細(xì)胞在造血的隨機(jī)過程中可能獲得突變，而大多數(shù)JAK2突變和部分TP53突變可能是由于CH，這就使得樣本中CH相關(guān)突變的檢測(cè)可能被錯(cuò)誤地解釋為腫瘤切除后MRD的指示。研究者目前正在采用各種方法從真正的腫瘤DNA衍生突變中篩選出CH相關(guān)突變。最直接的方法是對(duì)有核白細(xì)胞進(jìn)行深度測(cè)序（CAPP-Seq）以識(shí)別克隆性造血突變，并將其從樣本中排除［7］。雖然該方法在技術(shù)上可行且操作簡(jiǎn)單，但其卻將成本翻了一番。其他如基因片段太小、t1/2短以及隨著治療效果顯現(xiàn)，腫瘤DNA比例會(huì)大幅度下降等。鑒于檢測(cè)成本較高及缺乏分析方法共識(shí)，目前液體活檢仍不能完全替代傳統(tǒng)檢查，但作為后者的輔助檢測(cè)手段，未來的研究必定需要將兩者更好地結(jié)合起來，監(jiān)測(cè)與評(píng)估MRD狀態(tài)，進(jìn)而完善肺癌患者術(shù)后個(gè)體化治療。不同液體活檢的比較見表1。

表1 不同液體活檢比較Table 1 Comparison of five types of body fluid biopsies

2 體液標(biāo)本活檢

2.1 外周血 從早期至晚期肺癌，隨著實(shí)體瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等，大量的腫瘤細(xì)胞及其衍生物會(huì)進(jìn)入外周血液循環(huán)中，在影像學(xué)檢查和血清學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)之前其是準(zhǔn)確、可靠地識(shí)別MRD并指導(dǎo)后續(xù)治療決策的標(biāo)本。采集血液檢查比活組織檢查具有更小的侵入性，這使其易于獲取，并允許對(duì)癌癥進(jìn)行近實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。外周血樣本中主要活檢對(duì)象包括CTC、ctDNA以及外泌體等，特征比較見表2。目前國(guó)內(nèi)外大量臨床試驗(yàn)以及分析處理的方法已基本達(dá)成共識(shí)，使得上述對(duì)象在以血液為載體的基礎(chǔ)上進(jìn)行活檢成為目前最常用的方法。而某些特定體液中的腫瘤細(xì)胞及其衍生物因無法如同全身循環(huán)的血液那樣反映癌癥轉(zhuǎn)移的具體情況，在臨床實(shí)際應(yīng)用中尚處于探索階段。此外，相比于血液，其他體液有著更加復(fù)雜的微生物環(huán)境，微生物自身及其代謝物會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成難以預(yù)測(cè)的影響。目前血液活檢技術(shù)可根據(jù)其基因組覆蓋范圍進(jìn)行分類，從靶向等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）到NGS技術(shù)，如雜交捕獲NGS、全外顯子組測(cè)序和全基因組測(cè)序。所有檢測(cè)方法共同面臨的問題包括血漿ctDNA含量低、正常（非腫瘤）細(xì)胞產(chǎn)生的cfDNA背景豐富以及發(fā)現(xiàn)的基因變異來源不確定，但隨著技術(shù)的進(jìn)步，使用個(gè)性化的基因測(cè)序跟蹤更多的突變可以提高這些平臺(tái)在檢測(cè)低容量MRD時(shí)的靈敏度。

表2 外周血中三種常見活檢對(duì)象比較Table 2 Comparison of three common liquid biopsy biomarkers in peripheral blood

2.1.1 CTC 是指從原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移灶脫落、發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)入患者外周血血液循環(huán)的惡性腫瘤細(xì)胞［8］。腫瘤復(fù)發(fā)需要許多病理生理級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在這些癌癥擴(kuò)展、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的基本過程中，CTC可能參與了轉(zhuǎn)移這一重要階段。CTC是血管中一種極其罕見的細(xì)胞，外周血液中的數(shù)量非常少（1 ml全血中僅含有1～10個(gè)CTC）［9］，從文獻(xiàn)回顧來看，絕大部分肺癌患者中均可發(fā)現(xiàn)CTC［10］。對(duì)于早期肺癌，可從外周血中檢測(cè)到甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1（TTF-1）陽性CTC，并與不良預(yù)后和更短的進(jìn)展期相關(guān)［11］。對(duì)于經(jīng)證實(shí)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的肺癌患者，CTC數(shù)量越多，預(yù)后越差，并且LINDSAY等［12］的報(bào)告指出CTC將是晚期非小細(xì)胞肺癌無進(jìn)展生存率（PFS）和總生存率（OS）的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。因此，CTC可作為肺癌患者的一種動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)工具來觀察治療前后腫瘤動(dòng)力學(xué)的變化。在上述文獻(xiàn)回顧的研究中，26例患者早期肺癌術(shù)前和術(shù)后第0天、第1天和第3天進(jìn)行CTC檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)肺癌患者CTC計(jì)數(shù)的下降斜率較低，而無復(fù)發(fā)患者的CTC下降斜率較高。對(duì)于有肺轉(zhuǎn)移的肺外惡性腫瘤，腫瘤切除后CTC下降，術(shù)后第3天CTC反彈至更高水平，即使在影像學(xué)上可見病變已完全切除。表示CTC可以作為MRD檢測(cè)的一種工具，并且可以預(yù)測(cè)治愈性術(shù)后幾個(gè)月的復(fù)發(fā)情況。

2.1.2 ctDNA 定義為腫瘤細(xì)胞脫落到體循環(huán)中的短DNA序列，來源于死亡CTC的分解產(chǎn)物或腫瘤細(xì)胞的活性分泌，是cfDNA片段中的一小部分，盡管比例不到1%但測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步已經(jīng)可以滿足檢測(cè)與腫瘤生物學(xué)相關(guān)的突變和染色體改變［13］，且ctDNA的t1/2約為2 h，比其他腫瘤標(biāo)記物的t1/2更短［14］。在肺癌發(fā)展過程中，肺腫瘤組織可能獲得一系列體細(xì)胞突變。某些突變?nèi)鏓GFR T790M會(huì)產(chǎn)生耐藥性，并影響患者的總體生存率。2016年美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)cobas EGFR突變?cè)囼?yàn)V2［15］作為在肺癌中使用ctDNA檢測(cè)MRD的第1次液體活檢試驗(yàn)。因ctDNA檢測(cè)隱匿性癌癥和動(dòng)態(tài)追蹤腫瘤特異性突變的潛在能力，連續(xù)血漿樣本中跟蹤檢測(cè)腫瘤基因突變已經(jīng)用于晚期非小細(xì)胞肺癌患者的臨床決策［16］。另一方面術(shù)后ctDNA與患者后期復(fù)發(fā)率呈正相關(guān)，在一項(xiàng)包含230例肺癌患者術(shù)后的研究中［17］，研究者通過血漿樣本中相對(duì)于健康對(duì)照組中最高突變等位基因分?jǐn)?shù)（MAF）量化的ctDNA確定了ctDNA陽性和陰性患者術(shù)后無復(fù)發(fā)生存率（RFS）的顯著差異，且認(rèn)為術(shù)后ctDNA狀態(tài)對(duì)RFS的影響大于任何單個(gè)臨床病理風(fēng)險(xiǎn)因素或任何因素組合，術(shù)后靈敏度、特異度皆高于其他檢測(cè)手段。目前克隆性造血和組織活檢之間的基因組差異性仍是ctDNA檢測(cè)存在的明顯局限性，但隨著NGS及數(shù)字PCR（dPCR）等技術(shù)的進(jìn)步，ctDNA檢測(cè)的靈敏度也在逐漸提高。

2.1.3 外泌體 JOHNSTONE等［18］在研究網(wǎng)織紅細(xì)胞的成熟過程時(shí)首次發(fā)現(xiàn)并命名外泌體。外泌體是一種球形囊泡，直徑為40～100 nm，密度為1.13～1.19 g/ml，其內(nèi)主要核酸包含microRNA（miRNA）、tRNA和長(zhǎng)非編碼RNA（lncRNA），以及大量片段化的信使RNA（mRNA）。外泌體的分離方法主要有基于物理（如大小、密度和分子量）特性、沉淀、微流體、免疫親和捕獲的技術(shù)，目前超速離心和商用試劑盒提取法是分離外泌體最廣泛使用的常規(guī)方法［19］。盡管所有類型的細(xì)胞會(huì)釋放出外泌體，但腫瘤細(xì)胞中的外泌體非常豐富。研究表明腫瘤細(xì)胞源性外泌體在腫瘤生物學(xué)過程中起著重要作用，其負(fù)責(zé)促進(jìn)受體細(xì)胞的血管生成、侵襲和增殖，通過將其內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到肺癌微環(huán)境中的靶細(xì)胞參與肺癌的形成和進(jìn)展［20］。癌細(xì)胞外泌體包含多種與癌癥相關(guān)的蛋白質(zhì)，例如表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）是肺癌外泌體中的主要膜結(jié)合蛋白，從肺癌細(xì)胞中提取的外泌體中約有80%呈EGFR陽性［21］，而腫瘤源性外泌體衍生的miRNA也可能是影響非小細(xì)胞肺癌患者生存率的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子［22］。RABINOWITS等［23］評(píng)估了血漿樣本循環(huán)腫瘤外泌體水平對(duì)27例肺腺癌患者和9例健康對(duì)照的診斷和預(yù)后潛力，發(fā)現(xiàn)腺癌患者的外泌體水平（平均2.85 mg/ml）、外泌體miRNA濃度（158.6 ng/ml）均高于健康對(duì)照（平均0.77 mg/ml、68.1 ng/ml）。

2.2 唾液 唾液由唾液腺中的腺泡細(xì)胞產(chǎn)生，腺泡細(xì)胞具有很高的滲透性，且周圍有豐富的毛細(xì)血管，使血液中的分子能夠與相鄰?fù)僖杭?xì)胞中的分子自由交換［24］，目前血液中大約40%的腫瘤標(biāo)志物也可以在唾液中找到［25］。加之唾液的收集速度快、簡(jiǎn)單、便宜、無創(chuàng)，表明唾液可以被視為一種理想的液體活檢標(biāo)本。GU等［26］首次將血漿CTC和唾液mRNA生物標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌的無創(chuàng)檢測(cè)，在區(qū)分早期肺癌患者和健康對(duì)照組的研究中其靈敏度和特異度分別高達(dá)92.1%和92.9%。非小細(xì)胞肺癌患者和健康人群之間唾液cfDNA的定量或濃度無顯著差異［27］。然而，血漿cfDNA和唾液cfDNA之間EGFR突變的一致性為83.78%，scfDNA能夠作為基因突變的補(bǔ)充［28］。EGFR是一種在NSCLC中頻繁表達(dá)的膜受體，其影響NSCLC細(xì)胞的增殖、血管生成和MRD復(fù)發(fā)及化療耐藥性，并促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［29］。頻繁對(duì)術(shù)后肺癌患者進(jìn)行血液活檢監(jiān)測(cè)EGFR突變是不切實(shí)際的，而唾液活檢恰可以為肺癌MRD提供另一個(gè)有希望的診斷補(bǔ)充。加州大學(xué)洛杉磯分校（UCLA）牙科學(xué)院開發(fā)的電場(chǎng)誘導(dǎo)釋放和測(cè)量（EFIRM）技術(shù)可以檢測(cè)肺癌患者體液中表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）突變。LI等［30］在13例非小細(xì)胞肺癌患者唾液樣本中利用上述技術(shù)檢測(cè)到循環(huán)腫瘤DNA（sctDNA）EGFR突變，靈敏度為100%。另一些腫瘤生物化學(xué)指標(biāo)與肺癌患者的生存率顯著相關(guān)［31］，例如咪唑化合物（ICs）濃度和唾液乳酸脫氫酶（LDH）活性，這兩個(gè)參數(shù)的組合被用作評(píng)估肺癌預(yù)后及存活率更為有效。對(duì)于預(yù)后良好（ICs<0.311 mmol/L和LDH>1 133 U/L）的患者，1年、3年和5年生存率比預(yù)后不良的患者均高2倍。而C反應(yīng)蛋白（CRP）水平可能也會(huì)隨著腫瘤大小和區(qū)域轉(zhuǎn)移而升高。

2.3 尿液 經(jīng)治療后MRD血漿中ctDNA和CTC的含量較低，在連續(xù)監(jiān)測(cè)病灶進(jìn)展過程中需要提取相對(duì)大容量的血液，盡管是微創(chuàng)但患者仍然會(huì)感覺到不適。研究表明外周血中的cfDNA能夠通過腎屏障并經(jīng)過尿液排泄［32］，CHEN等［33］對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者匹配的3 ml外周血和8 ml尿液樣本共計(jì)150份進(jìn)行分析，從中獲得的cfDNA數(shù)量沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。且尿液易于儲(chǔ)存和運(yùn)輸，更易于提取大容量樣本，從尿液樣本中獲取關(guān)鍵疾病信息的可能性為補(bǔ)充傳統(tǒng)的腫瘤取樣方法提供了更多選擇。MRD陽性意味著癌癥治療后血液中可檢測(cè)到來自腫瘤的DNA，那么尿液中檢測(cè)到的DNA水平也可以類似地指示腫瘤負(fù)擔(dān)相關(guān)性。在先前的報(bào)道中利用尿液DNA追蹤腫瘤特異性突變并針對(duì)耐藥性給予個(gè)體化治療，臨床應(yīng)用被證明適用于晚期非小細(xì)胞肺癌患者［34］。LI等［35］發(fā)現(xiàn)治療后可檢測(cè)到尿ctDNA的存在與肺癌患者的疾病復(fù)發(fā)明顯相關(guān)，尿ctDNA檢測(cè)不到的患者有較好的無病生存率，可檢測(cè)到ctDNA的患者3、6和9個(gè)月復(fù)發(fā)概率對(duì)應(yīng)為15.6%、6.6%和5.1%。表明尿ctDNA對(duì)疾病復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)有一定的前瞻性，尤其是對(duì)突變DNA檢測(cè)不到的患者進(jìn)行甄別具有良好的臨床實(shí)用性。LEE等［36］指出在治療后階段EGFR突變持續(xù)陽性的NSCLC患者可能存在殘余病灶，需要進(jìn)一步治療或加強(qiáng)疾病復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)。特別是T790M突變與疾病進(jìn)展時(shí)間縮短和總體生存率降低密切相關(guān)。CHEN等［33］對(duì)150例非小細(xì)胞肺癌患者分組后發(fā)現(xiàn)，尿液DNAT790M陽性組患者的總體生存結(jié)果明顯最差，中位生存率為30個(gè)月，T790M陰性組的中位生存率為34個(gè)月，進(jìn)一步驗(yàn)證了尿液DNA在治療后患者風(fēng)險(xiǎn)分層和疾病監(jiān)測(cè)中的臨床實(shí)用性。

2.4 痰液 美國(guó)國(guó)家癌癥研究所（NCI）［37］進(jìn)行了一項(xiàng)肺癌的低劑量螺旋計(jì)算機(jī)斷層掃描和痰細(xì)胞學(xué)雙重篩查研究，雙重篩查診斷的90例患者中有18例（20%）痰標(biāo)本呈癌癥陽性，但影像學(xué)檢查呈陰性，表明痰液在診斷臨床上處于緩解期或隱匿期的癌癥相比較影像學(xué)具有時(shí)間優(yōu)越性，但因?yàn)榇蠖鄶?shù)肺癌患者痰液樣本量較少，致使其包含的腫瘤細(xì)胞數(shù)量有限，加之痰液中的黏性黏液成分使得腫瘤源性的DNA提取更加困難。這也是液體活檢相對(duì)較少使用痰液的原因之一。WANG等［38］制備了一種無甲醇黏液溶解溶液（MS2）改進(jìn)從痰中分離腫瘤源性cfDNA，實(shí)驗(yàn)證明經(jīng)治療后患者的痰標(biāo)本中利用MS2提取的cfDNA檢測(cè)EGFR突變的靈敏度顯著高于經(jīng)MS1（傳統(tǒng)的含甲醇的黏液溶解溶液）分離的同一隊(duì)列痰標(biāo)本，并在一項(xiàng)包括102例肺腺癌患者的研究中，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)對(duì)痰cfDNA檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，30例患者（29.4%）的EGFR突變狀態(tài)呈陽性，總體靈敏度和特異度分別為46.2%和100.0%。MAO等［39］在肺癌患者臨床診斷之前發(fā)現(xiàn)10例原發(fā)腫瘤中有8例患者的痰液樣本中檢測(cè)到K-ras突變和p53突變，這對(duì)提高腫瘤基因分型和腫瘤靶向精準(zhǔn)治療、發(fā)展圍術(shù)期個(gè)體化治療具有重要意義。研究證明miRNAs、mir-21和mir-155的過度表達(dá)是腫瘤切除后患者復(fù)發(fā)、預(yù)后及總體生存率的負(fù)面因素［40］。而痰液含有來自肺部和下呼吸道的支氣管上皮細(xì)胞，痰液環(huán)境下miRNA對(duì)RNase活性具有抗性，能顯著地以穩(wěn)定形式存在，并且在儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)7 d的痰液樣本中也可檢測(cè)到［41］。LIAO等［42］發(fā)現(xiàn)痰樣本中miRNA組可以檢測(cè)NSCLC，具有顯著的靈敏度和特異度。來自較小氣道的腺癌很難通過支氣管鏡或痰細(xì)胞學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，痰中miRNA的表達(dá)將為肺癌的MRD監(jiān)測(cè)提供一種高準(zhǔn)確率的特異性標(biāo)志物。并在無創(chuàng)的基礎(chǔ)上對(duì)患者起到早診斷、早治療的作用。

2.5 胸腔積液 惡性胸腔積液（MPE）是中晚期肺癌的一種常見并發(fā)癥，是淋巴腺被腫瘤阻塞，組織液滲出積聚于胸膜腔內(nèi)，與患者腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。與組織活檢等其他侵入性技術(shù)相比，MPE非常容易收集。此外，與手術(shù)切除標(biāo)本相比，肺癌相關(guān)MPE患者的突變率要高得多［43］。胸腔積液活檢標(biāo)本的生物標(biāo)志物可能來自多個(gè)腫瘤克隆，因此其可以同時(shí)反映腫瘤以及播散性病變的異質(zhì)性。同時(shí)足夠來源的MPE為獲得評(píng)估腫瘤基因組學(xué)提供了一個(gè)豐富的機(jī)會(huì)［44］。MPE的分子分析代表了一種檢測(cè)腫瘤驅(qū)動(dòng)基因突變的微創(chuàng)方法，尤其是當(dāng)腫瘤組織不可用時(shí)，其可用于臨床決策。MPE可能是提供EGFR等基因突變狀態(tài)有用信息的替代來源。如果EGFR基因突變檢測(cè)可以通過更多可獲得的胸腔積液樣本實(shí)現(xiàn)，將有利于探索MRD在驅(qū)動(dòng)基因陽性和驅(qū)動(dòng)基因陰性兩種類型患者中的作用，并進(jìn)一步探討耐藥機(jī)制，以及評(píng)估能否在影像學(xué)之前識(shí)別耐藥的優(yōu)越樣本。晚期非小細(xì)胞肺癌患者的靶向藥物治療也將成為可能，這將具有重要的臨床和實(shí)用價(jià)值。

2.6 胸腔積液上清液（MPEs） 晚期非小細(xì)胞肺癌患者胸腔積液上清液中的cfDNA的腫瘤基因突變豐度顯著高于積液腫瘤細(xì)胞和血漿游離DNA樣本，已成為在檢測(cè)治療靶點(diǎn)和腫瘤突變負(fù)荷（TMB）中優(yōu)異的替代品［45］。在晚期肺癌MRD中，檢測(cè)驅(qū)動(dòng)基因EGFR的突變被用作靶向治療的指導(dǎo)，TMB可用于評(píng)估免疫治療的療效。WANG等［46］對(duì)腫瘤組織、血漿和MPEs的EGFR突變狀態(tài)進(jìn)行比較，并將結(jié)果與EGFR-TKI療法進(jìn)行關(guān)聯(lián)，結(jié)果證明在基于ctDNA的EGFR突變檢測(cè)方法下腫瘤組織和MPEs之間EGFR突變靈敏度和特異度的高度一致，而血漿中的EGFR突變率最低。MPEs中的EGFR突變可以預(yù)測(cè)第一代EGFR-TKI治療的療效。經(jīng)TKI治療的EGFR突變患者的中位總生存期長(zhǎng)于野生型EGFR患者，接受一線或二線EGFR-TKI治療的MPEs中EGFR突變患者的ORR和DCR分別為56%和94%，與基于組織的檢測(cè)結(jié)果一致。因此當(dāng)兩種樣本均可用時(shí)，從MPEs中提取的游離DNA可能是比血漿更好的作為預(yù)測(cè)腫瘤對(duì)TKIs反應(yīng)的生物標(biāo)志物。同時(shí)YANG等［47］觀察發(fā)現(xiàn)MPEs中EGFR突變患者的中位PFS顯著長(zhǎng)于野生型EGFR患者（7.33個(gè)月與2.07個(gè)月）。而SONG等［48］研究了使用肺腺癌患者M(jìn)PEs外泌體DNA進(jìn)行基因檢測(cè)的可行性，發(fā)現(xiàn)在MPEs外泌體DNA中發(fā)現(xiàn)的78%的突變與MPEs ctDNA中發(fā)現(xiàn)的突變相匹配，支持其用于基因檢測(cè)的可靠性。多渠道確定腫瘤基因原始突變狀態(tài)和監(jiān)測(cè)突變的變化對(duì)于肺癌的治療至關(guān)重要。

3 總結(jié)與展望

將液體樣本衍生的生物標(biāo)志物應(yīng)用于監(jiān)測(cè)MRD、預(yù)測(cè)腫瘤反應(yīng)和探索治療耐藥性等臨床工作無疑是迫切需要的。液體活檢作為一種分析變異的替代方法，不僅提供了一種非侵入性的方法來提前檢測(cè)肺癌的改變，而且還補(bǔ)充了組織活檢檢測(cè)的結(jié)果，使更多的癌癥患者能夠接受精準(zhǔn)治療。在這個(gè)個(gè)體化精準(zhǔn)醫(yī)療時(shí)代，MRD本身仍有很多問題有待進(jìn)一步解決，未來的研究有必要確定如何最好地將腫瘤組織活檢、臨床檢查和醫(yī)學(xué)影像與液體活檢的基因組學(xué)和MRD信息結(jié)合起來，從而使多元化液體活檢標(biāo)本分析應(yīng)用于臨床腫瘤工作成為指導(dǎo)臨床決策并改善患者預(yù)后的一條嶄新道路。

作者貢獻(xiàn)：閆星提出研究選題方向，負(fù)責(zé)相關(guān)內(nèi)容的文獻(xiàn)收集和整理，并撰寫論文初稿；劉山梅參與文獻(xiàn)的收集和整理，負(fù)責(zé)論文的修訂，與閆星在文章中所做同等貢獻(xiàn)；劉長(zhǎng)宏負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)；所有作者確認(rèn)了論文的最終稿。

本文無利益沖突。