番茄灰霉病菌拮抗菌的篩選和應(yīng)用

1 番茄簡(jiǎn)介及主要病害

1.1 番茄簡(jiǎn)介

番茄人工種植歷史長(zhǎng)，是中國(guó)重要果蔬[1]。番茄含有豐富的維他命和抗氧化成分，中國(guó)番茄年產(chǎn)量為1.21億t。中國(guó)蔬菜生產(chǎn)面積較大，種類(lèi)較多，番茄產(chǎn)量占全國(guó)蔬菜總產(chǎn)量的34.7%。番茄含有大量維生素，其中蕃茄紅素抗氧化性較好，可以降低罹患前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。

1.2 番茄灰霉病菌

番茄灰霉病是灰葡萄孢菌侵襲植物所引起的一類(lèi)疾病，主要危害蔬菜、果樹(shù)和花卉，特別對(duì)番茄危害尤為突出，從生長(zhǎng)到開(kāi)花、結(jié)果期均可感染，通常造成番茄減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重者高達(dá)50%，甚至絕產(chǎn)[2]。是全球危害程度第二的植物病原體。目前，壞死性真菌感染是病原體之一。因寄生體多樣性，經(jīng)濟(jì)損害無(wú)法估量。當(dāng)前，中國(guó)對(duì)灰霉病菌的防治仍以化學(xué)農(nóng)藥和培育較強(qiáng)抗性的新品種為主。然而，由于時(shí)間和技術(shù)條件的制約，新品種耐病性較差，雖然化學(xué)農(nóng)藥防治效果較好，但同時(shí)也會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重的影響。

2 拮抗菌篩選

2.1 拮抗真菌

葡萄孢菌拮抗菌主要菌群體為真菌，對(duì)灰葡萄孢菌的抑菌作用以真菌為主，主要為酵母菌屬和木霉屬。已有20多種拮抗性真菌被用于防治灰霉菌。在灰葡萄孢菌控制上，酵母菌是一種非常有效的控制方法。羅倫隱球酵母菌、假絲酵母菌、季也蒙畢赤酵母菌、檸檬形克勒克酵母菌、卡利比克畢赤酵母菌、異常威克漢姆酵母菌可以控制灰霉菌[3]。

木霉菌是另一種主要的抑菌類(lèi)型，張富榮等[4]在木霉屬中發(fā)現(xiàn)多種木霉菌，包括哈茨木霉、鉤狀木霉、擬康氏木霉、青木霉等；此外，刺殼孢菌、金龜子綠僵菌等對(duì)灰色葡萄孢菌也具有一定的抑制效果。

2.2 拮抗細(xì)菌

在灰霉菌生物防治過(guò)程中，也大量應(yīng)用細(xì)菌。當(dāng)前用于控制灰霉病菌的抗性菌株有芽孢桿菌、假單胞菌、格氏沙雷桿菌等。抗藥性菌株可以抑制灰葡萄球菌活性，產(chǎn)生抗生素，或與其爭(zhēng)奪養(yǎng)分，抑制發(fā)展程度。

潘曉梅[5]利用從甘肅省興隆山原始森林土壤中分離出對(duì)番茄灰霉病菌有拮抗作用的細(xì)菌XF，結(jié)果表明，XF具有較好的拮抗能力，其抑制率達(dá)到66.35%，并與對(duì)照組比較，其菌絲增長(zhǎng)速度較慢，而且較稀。XF能明顯提高灰霉菌菌絲的增殖速度，提高灰霉菌的菌絲體積，使其纖維體積增大、分支增加、節(jié)間化、形成囊泡，并伴隨細(xì)胞壁的斷裂和滲出。

馬超[6]為得到一種高效抗菌的抗菌菌種，以G-1為試驗(yàn)材料，對(duì)抗菌譜、分類(lèi)學(xué)地位、抗菌物質(zhì)種類(lèi)、抗菌物質(zhì)在番茄灰霉病中的抑菌作用機(jī)理進(jìn)行了初步探討，初步確定G-1為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌，采用平板對(duì)峙法，以番茄灰霉病菌、菜豆菌核病菌、番茄枯萎病菌、桃褐腐病菌、番茄早疫病菌等9種植物病原菌為指示菌，對(duì)內(nèi)生菌G-1進(jìn)行抗真菌譜活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)G-1具有83.14%、81.65%的抗菌活性。G-1的代謝物對(duì)番茄灰霉菌有很強(qiáng)的抑制作用，其抑制效果達(dá)85.87%。結(jié)果表明：G-1代謝物耐熱性高，在121℃條件下30 min，抑制效果仍然達(dá)到81.76%；G-1的代謝產(chǎn)物酸堿穩(wěn)定性良好，具有較強(qiáng)的抗紫外輻射能力，24 h紫外線(xiàn)照射后抑制效果達(dá)到85.68%。

高振峰等[7]采用平板篩選、田間篩選、利福平抗性標(biāo)記、形態(tài)鑒定、生理生化鑒定及16SrR NA、gyrA基因、gyrB基因鑒定相結(jié)合的方法對(duì)番茄灰霉病高效內(nèi)生拮抗細(xì)菌進(jìn)行篩選，結(jié)果表明，58株細(xì)菌中菌株ZSY-1抑菌活性較優(yōu)，在室內(nèi)和田間試驗(yàn)中對(duì)番茄灰霉病菌均可保持75%以上的抑菌效果；雖然菌株FG-6在番茄根際、根系、葉片中的定殖特性明顯優(yōu)于菌株ZSY-1，但其田間防效較差，僅約30%，明顯低于菌株ZSY-1；利用形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定及16SrRNA、gyrA基因、gyrB基因鑒定，將菌株ZSY-1鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。結(jié)果表明，ZSY-1是一種較好的抗灰霉和抗真菌肥料。

2.3 拮抗放射菌

放線(xiàn)菌是一種天然的微生物，其在生物控制方面有著廣闊的發(fā)展和利用價(jià)值。目前，用于抑制劑的放線(xiàn)細(xì)菌多為鏈霉菌科，其中超過(guò)一半的細(xì)菌可生產(chǎn)抗菌藥物。邵勝楠等[8]通過(guò)對(duì)KN37菌體的分析，發(fā)現(xiàn)該菌體對(duì)番茄灰霉病菌的菌絲和芽胞的萌發(fā)均有明顯的抑制作用。趙娟等[9]從土壤中分離和篩選出的鏈霉菌T22，其能夠生產(chǎn)出纖維素酶和幾丁質(zhì)酶。其它拮抗放線(xiàn)菌還有暗色鏈霉菌、白黑鏈霉菌等。

3 拮抗菌的應(yīng)用

呂婷[10]從西紅柿根間土樣中分離得到了2個(gè)對(duì)番茄灰霉病菌有拮抗作用的生防菌株解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciensLM-Y和甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌B.methylotrophicusLM-N,2株生防菌表現(xiàn)出良好的親和性，可混合發(fā)酵且復(fù)合菌株對(duì)番茄灰霉病菌抑菌能力優(yōu)于單一菌株。2株生防菌復(fù)合菌劑在1%葡萄糖、1%蛋白胨、0.5% 氯化鈉，29℃、pH7.0、接種量 5%、裝液量90 mL(250 mL三角瓶)、發(fā)酵時(shí)間為48 h的培養(yǎng)條件下發(fā)酵液活菌數(shù)和抑菌活性最高，復(fù)合菌發(fā)酵液對(duì)番茄灰霉菌抑菌直徑較單菌株分別提高44.31%和32.47%。并首次提出用2種不同的芽孢桿菌和藻類(lèi)液體配制生物藻肥的方法。結(jié)果表明：采用生物藻類(lèi)肥料對(duì)番茄進(jìn)行了改良，改善了番茄發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、株高、莖粗和果實(shí)重量，而400倍濃度溶液對(duì)番茄幼苗發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均有明顯的抑制作用，且400倍濃度溶液能明顯抑制病菌生長(zhǎng)，且與單純使用細(xì)菌相比下降70.41%。

趙佳振[11]利用菌絲體菌絲生長(zhǎng)速率法，分析9種供試劑的敏感性，并進(jìn)行了田間藥效實(shí)驗(yàn)，確定了適用于關(guān)中地區(qū)灰霉病的化學(xué)試劑，并進(jìn)行了相應(yīng)的藥理分析，結(jié)果表明：22.5%啶氧菌酯懸浮劑、50%啶酰菌胺水分散粒劑、25%啶菌噁唑水乳劑均能有效控制關(guān)中灰霉病。在野外施用時(shí)，可以將上述2種農(nóng)藥輪流施用，減少單次施用次數(shù)，防止田間出現(xiàn)抗性細(xì)菌，從而增加控制的有效性。除采取藥劑防治外，還應(yīng)采取其他方法進(jìn)行綜合防治，從而提高病原菌耐藥性，控制病害。

生物防治符合綠色、環(huán)保和可持續(xù)的農(nóng)業(yè)發(fā)展觀念。拮抗菌株具有較強(qiáng)的特異性，但對(duì)食物鏈造成的不良效應(yīng)較少，不會(huì)干擾生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定狀態(tài)。在自然界中，動(dòng)植物、微生物、環(huán)境之間的相互聯(lián)系十分錯(cuò)綜復(fù)雜，在實(shí)際使用時(shí)，外部的生態(tài)系統(tǒng)和微系統(tǒng)都會(huì)對(duì)其產(chǎn)生不同程度的影響。目前，大部分生物防病產(chǎn)品都是周期性的，長(zhǎng)期貯存會(huì)導(dǎo)致活性成分下降，成本增加。有些病原體會(huì)以較穩(wěn)定的形態(tài)在生物防治產(chǎn)品中生存，且生存期較長(zhǎng)，不易完全殺死。

與傳統(tǒng)的化學(xué)控制方法相比，生物控制技術(shù)對(duì)環(huán)境無(wú)污染，對(duì)人畜亦相對(duì)安全，不會(huì)導(dǎo)致病害產(chǎn)生抗性。拮抗微生物是生物控制的主要內(nèi)容。通過(guò)深入研究植物、分泌物、不同生態(tài)環(huán)境之間的演變規(guī)律，可以更好地調(diào)控土壤中的無(wú)機(jī)物和有機(jī)物，使其具有更好的控制作用。