基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜在乳品微生物中的應用進展

金佳佳，嚴家?。?，綦 艷，姚麗鋒，張 娟，黃翠莉，吳思敏，莊藝協(xié)

1 廣東產品質量監(jiān)督檢驗研究院，廣東佛山 528300

2 拱北海關技術中心，廣東珠海 519015

0 引言

乳品中存在豐富的營養(yǎng)物質，可以為微生物生長提供有利的環(huán)境，在貯存、運輸、加工、銷售等各個環(huán)節(jié)都極易發(fā)生腐敗和污染，是乳品在供應保障中的關注焦點[1]。微生物中的腐敗菌，如變質奶油甜品中的蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）、凝固酶陰性葡萄球菌（Coagulase negative Staphylococcus）、腸球菌（Enterococcus）和明串珠菌屬（Leuconostocspp）等，會引起乳品發(fā)生化學、物理變化，直接或間接產生有害物質，造成乳品失去原有的功能活性和營養(yǎng)價值，是乳品腐敗變質的重要因素，其不僅對食用者的健康和生命安全造成一定的威脅，同時也給乳品行業(yè)造成了巨大的經濟損失[2]。微生物中的致病菌由于不會改變乳品的感官特性，污染乳品不易被察覺，且除了致病菌自身及其代謝產物會損害機體健康，其代謝過程也會對機體造成一定程度的損害[3]，因而相對于腐敗菌危害更大。常見的致病菌包括沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大腸桿菌O157、單核細胞增生李斯特菌、產氣莢膜梭菌等[4]。

1 乳品微生物分析技術的概述

乳品中微生物分析涉及定量和定性分析，也是對乳品質量進行判斷衡量的重要技術手段[5]。傳統(tǒng)微生物法主要通過表型鑒定技術進行分析，例如觀察培養(yǎng)基中微生物的生長形態(tài)、革蘭氏染色試驗和生理生化反應試驗等。該方法存在步驟復雜，具有一定的主觀性，且檢測時間長等缺陷[6]。

現(xiàn)如今，乳品中微生物的分析方法隨著科學技術的發(fā)展有了很大的進步，如免疫學檢測方法和分子信息學檢測方法。免疫檢測方法包括酶聯(lián)免疫法、免疫磁珠法、單克隆抗體法和熒光免疫分析法等。分子生物學檢測方包括PCR-DGGE指紋技術、實時PCR（定量PCR、qPCR）技術、ARISA指紋圖譜技術、限制性內切酶分析（REA）、16SrDNA序列分析技術和聚合酶鏈式反應（PCR）等。上述方法在微生物的分析上具有較高的準確性。然而，檢測過程仍然耗時耗力，對實驗室條件、檢驗人員專業(yè)知識要求高，且需要較高的成本，難以滿足大批量樣品的檢測需求。蛋白組學分析技術是應用于微生物快速分析的一種新型技術，該技術相對于上述方法具有快速、穩(wěn)定、準確、靈敏以及成本低等特點[7～9]。

2 蛋白質組學分析技術

蛋白質組學分析技術是一種可以在特定環(huán)境和時間條件下對細胞、組織或生物體中蛋白質進行分析的技術手段[10]，主要涉及樣品的制備、蛋白質的分離、蛋白質的鑒定和生物信息學分析[11]。目前最常用的蛋白質組學分析方法是質譜（MS）方法，該方法通過分析經特異性蛋白酶（如胰酶）水解后得到的肽段混合物來鑒定蛋白質。其中基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）和電噴霧離子化質譜（ES）使用頻率較高[12]。

3 MALDI-TOF MS 概述

MALDI-TOF MS是近幾年來逐漸發(fā)展起來的一種新型蛋白質組學分析技術。現(xiàn)如今，已用于革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌、創(chuàng)傷弧菌、分歧桿菌、霉菌和酵母的常規(guī)鑒定和分型。該技術在細菌鑒定中的應用已將十分成熟，還可用于細菌同源性分析和耐藥性檢測等，具有操作便捷、成本低、耗時短、高通量、對檢驗人員要求不高等優(yōu)點，因此，該技術在臨床實驗室逐漸得到認可和推廣[13]。

3.1 MALDI-TOF MS 的原理

MALDI-TOF MS主要由基質輔助激光解吸電離離子源（MALDI）和飛行時間質量分析器（TOF）兩部分組成。在進行MALDI-TOF MS分析時，首先將樣品均勻涂抹于金屬靶板上，加入基質混合后形成含蛋白質分子和其他細胞化合物的基質共結晶薄膜。然后將處理好的樣品放入分析室，在激光束的作用下，解吸和電離樣品中微生物的基質分子和蛋白質。經此過程產生的電離分子在電場作用下加速飛過飛行管道，由于它們的質荷比（m/z）不同而相互分離。MALDI-TOF MS系統(tǒng)根據(jù)不同質量離子到達檢測器的飛行時間生成肽質量指紋（PMF）的特征光譜。再通過各種算法分析圖譜峰型數(shù)據(jù)，并與數(shù)據(jù)庫中的已知微生物蛋白指紋圖譜進行比對，從而確定該未知微生物的種類[14]。該方法可以在屬、種甚至菌株的水平上識別微生物。

3.2 MALDI-TOF MS 的優(yōu)缺點 [15-17]

隨著國內外學者對MALDI-TOF MS的研究越來越多，MALDI-TOF MS分析技術得到了不斷的完善。與傳統(tǒng)方法依據(jù)微生物的表型鑒定方法不同，MALDI-TOF MS分析技術主要是依據(jù)微生物的蛋白質結構進行鑒定。因而，相對而言該技術有以下優(yōu)點：（1）操作簡單，實驗人員只需經過簡單的培訓就能進行操作；（2）效率高。單個樣品分析只需不到1 min，（3）高通量，一次可同時進行384 個樣本的分析；（4）成本低，單個樣本分析只需1～2 元，遠低于其他方法。（5）準確度高，可以分析結構復雜的蛋白質混合物，同時實現(xiàn)單樣本中多種微生物的鑒定。分析精度可達到種水平和某些亞種水平；（6）樣品需求量少，微量樣品（1 個菌落，105 個細胞）即可進行分析實驗，對于某些難以培養(yǎng)的微生物，只需單個克隆就可以進行鑒定；（7）發(fā)展?jié)摿Υ螅⑸飻?shù)據(jù)庫決定了方法的分析范圍，因而隨著數(shù)據(jù)庫的不斷擴充，MALDI-TOF MS可根據(jù)數(shù)據(jù)庫分析越來越多罕見的微生物。

目前，質譜仍有一定的局限性：（1）對于系統(tǒng)發(fā)育相關性高的微生物難以區(qū)分，如大腸埃希氏菌和志賀氏菌；（2）受數(shù)據(jù)庫更新的影響，對于一些少見、罕見微生物的鑒定方面效果較差，或無法檢測；（3）設備成本高。這些仍有待進一步的研究及改進。

4 MALDI-TOF MS在乳品微生物鑒定和分型中的應用

乳酸菌在食品工業(yè)中的經濟價值十分重要。宋丹靚敏等[18]使用MALDI-TOF MS法與16S rDNA序列分析法，對于乳酸菌鑒定的準確性以及微生物系統(tǒng)分類學相關分析結果進行比較，結果表明，15 株乳酸菌，只有2 株存在種水平差異，其余鑒定結果一致；MALDI-TOF MS分析所得的聚類分析圖和16S rDNA分析所得的系統(tǒng)發(fā)育樹，在科水平上一致，但在屬中水平上存在一定差異；MALDI-TOF MS法在乳酸菌鑒定方面有著快速、準確的優(yōu)勢，但仍需要通過優(yōu)化算法和擴充數(shù)據(jù)庫才能建立準確的系統(tǒng)發(fā)育相關性。

乳酸菌食品中污染菌計數(shù)的難點在于對計數(shù)瓊脂上菌落的鑒定，并快速準確的區(qū)分。采用傳統(tǒng)的生物化學方法鑒定乳酸菌，操作繁瑣且準確性低。因此，凌莉等[19]采用MALDI-TOF MS鑒定技術對平板計數(shù)瓊脂、不含糖的計數(shù)瓊脂上菌落進行鑒定，通過比較發(fā)現(xiàn)，PCA上的菌落既有乳酸菌，又有非乳酸菌，在CASF平板上生長的菌落屬于乳酸菌食品中的污染菌；MALDI-TOF MS與不含糖計數(shù)瓊脂結合，可準確快速的對乳酸菌食品中污染菌進行計數(shù)和鑒定。

周千渝等[20]以標準菌株為模式菌，優(yōu)化了對鑒定結果存在影響的菌株培養(yǎng)條件、基質溶液配比、點樣方式以及溶劑處理方法等條件，建立了MALDI-TOF MS快速測定5 種致病菌的方法，并考察了方法的穩(wěn)定性、重復性和檢測限，結果表明，所優(yōu)化的方法穩(wěn)定性良好，檢測限為106～109 CFU/mL，與16S rDNA測序法鑒定結果進行比較，83%在種水平一致，94%在屬水平一致。

鄭秋月等[21]應用MALDI-TOF MS對不同宿主、不同地區(qū)來源及不同血清型的74 株沙門氏菌進行肽指紋圖譜數(shù)據(jù)的相似性和差異性分析，結果表明，MALDI-TOF-M S對沙門氏菌具有很好的溯源能力，但溯源結果可能受血清型的影響。應結合血清型進一步完善MALDI-TOF-MS溯源分析方法。

Wenjing等[22]利用MALDI-TOF MS和主成分分析建立了一種用于致病菌鑒定的全細胞方法，研究發(fā)現(xiàn)，直接應用MALDI - TOF MS分析全細胞細菌，無需提取蛋白質，具有豐富的峰含量和較高的重現(xiàn)性。MALDI-TOF MS 與 PCA 相結合是一種有前途的快速鑒定食品中病原體的方法。這項研究在快速識別食品中的病原體方面具有巨大的應用潛力。

孟令緣等[23]選取210 株沙門氏菌和18 株金黃色葡萄球菌，使用MALDI-TOF-MS、16S rDNA測序和VITEK全自動細菌鑒定系統(tǒng)進行鑒定，比較3 種方法的鑒定水平和效率，結構表明，3 種方法鑒定210株沙門氏菌屬水平一致性均為100.0%；16S rDNA測序鑒定18株金黃色葡萄球菌屬水平為100.0%，其中15株（83.3%）菌可到鑒定種水平；MALDI-TOFMS和 VITEK可將18 株（100.0%）金黃色葡萄球菌鑒定到種水平；MALDI-TOF-MS鑒定耗時最短、效率最高。

雖然單增李斯特氏菌的發(fā)病率不高，但其致死率高達20%～50%。20世紀90年代，世界衛(wèi)生組織（WHO）已將其列為食品四大致病菌之一[24]。王耀等[25]使用MALDI-TOF-MS技術快速鑒別單增李斯特氏菌，基于實驗收集的37 株單增李斯特氏菌分離株獨特的蛋白質指紋圖譜，創(chuàng)建了一個數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫鑒定結果的可信度很高。他們還提出MALDI-TOF-MS可作為脈沖場電泳分型方法的補充方法，二者結合使用可擴大基因型對亞種水平的分型能力。

Boultifat等[26]認為，食品工業(yè)中任何微生物鑒定技術的首選條件是準確性，其次是操作簡單、快速且成本低，才能確保產品安全并識別其微生物污染。他們在乳品公司生產線的不同步驟收集的巴氏殺菌牛奶樣品中分離出了5 種細菌。用MALDI-TOF MS 方法進行分析，并將結果與16S rDNA 測序結果進行比較，以此確認鑒定的有效性。這項研究表明，與16S rDNA 基因測序相比，MALDI-TOF MS是一種高度靈敏、快速的方法，可用于鑒定乳制品行業(yè)的病原體。

相對于細菌和酵母，MALDI-TOF MS鑒定絲狀真菌的傳統(tǒng)預處理方法更加復雜，需加入乙醇、甲酸、乙腈以及離心提取蛋白質，這是MALDI-TOF MS無法廣泛應用于絲狀真菌鑒定的主要原因。Peng等[27]使用甲酸夾心法將中國湖北省三家大型綜合醫(yī)院收集的148 株臨床絲狀真菌分離株處理后，使用Vitek MS和Autof MS兩種MALDI- TOF MS數(shù)據(jù)庫進行鑒定。通過比較FA夾心法與傳統(tǒng)提取法的難易程度可知，甲酸夾心法是一種更方便、省時、省試劑、靈敏的前處理方法，適用于絲狀真菌的預處理和MALDI - TOF MS鑒定。

5 結論

MALDI - TOF MS是一種操作簡單、準確、經濟、高通量且高效的微生物分析技術。其鑒別能力高于16S rDNA 測序等其他分子生物學方法，分析精度可達到種水平和某些亞種水平，因此越來越多的應用于乳品中細菌、絲狀真菌和酵母菌等微生物進行鑒定和分型。各種微生物在乳品工業(yè)生產中應用廣泛，使用MALDI-TOF MS對這些微生物菌株的全面分析將有助于乳品發(fā)酵過程中菌株的快速鑒定或對微生物菌株的質量進行有效控制，此外還可以快速識別可能導致乳品變質或食物中毒的微生物，保證食品質量與安全?，F(xiàn)階段，MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)庫的數(shù)量和大小還無法滿足一些少見、罕見微生物的鑒定或分型需求。隨著研究的深入和數(shù)據(jù)庫的不斷擴充，MALDI-TOF MS可識別的微生物將會越來越廣泛，MALDI-TOF MS在乳品微生物鑒定中的作用必然會越來越重要。